本發明屬于植物無性繁殖技術領域，涉及一種杏葉柯組織培養外植體獲取方法。

背景技術：

杏葉柯（Lithocarpus amygdalifolius (Skan) Hayata）又名杏葉石櫟、紅椆、嶺梅，系殼斗科（Fagaceae）柯屬（Lithocarpus）喬木，春夏季抽出的新枝及嫩葉背面密被黃棕色卷柔毛，秋后毛全部脫落。雄穗狀花序單穗腋生或多穗排成圓錐花序，花序軸密被柔毛；雌花每3朵一簇，有時兼有單朵散生。殼斗近圓球形，全包堅果，呈不連續的環狀；堅果的果壁比殼斗壁稍厚，堅果頂部被微柔毛。分布于臺灣中部及南部、福建南部、廣東東南部約北回歸線以南地區、海南。生于海拔1 100-2 300米常綠闊葉林或針葉、闊葉混交林中，常為上層樹種。

目前，杏葉柯資源仍處于野生分布狀態，但隨著保持植物多樣性的需求，規?；斯ぴ耘嘈尤~柯資源勢在必行。目前雖然杏葉柯已成功利用組培快繁技術對選育出的優良家系進行了育苗并造林，但是在組織培養過程中，外植體材料通常使用大樹穗條和基部萌芽等。但是大樹多數位于偏遠林區，采摘不便、萌芽難、數量少且難以滅菌，因此大樹萌條難以滿足實際生產育苗需求。而離體胚、無菌實生苗、子葉和針葉等作為外植體材料，獲取不定芽的速度和數量不及莖段快和多，難以成為組織培養的常用材料。

技術實現要素：

本發明為了克服現有技術的不足，提供一種采摘方便，質量好，數量多，滅菌易，可滿足杏葉柯組織培養快速繁殖體系建立需要的杏葉柯組織培養外植體獲取方法。

為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

一種杏葉柯組織培養外植體獲取方法，主要操作步驟如下：

（1）選種與播種：選取無病蟲害、顆粒飽滿的杏葉柯優良家系種子經催芽處理后播種；

（2）芽苗移植與管理：芽苗出土后移植到規格為15cm×15cm無紡布育苗袋內，視情況淋水、噴藥、施肥；

（3）母株種植與管理：當步驟（2）移植苗木生根穩定后，移栽到規格為30cm×30cm容器杯內，搭建蔭棚，挑選壯苗作母株移植到裝有基質的容器杯中進行母株種植，定時追肥，加強病蟲害防治；

（4）外植體獲?。杭羧∶妊織l，修剪針葉，進行消毒接種。

以上所述的播種方法是指將經常規消毒和熱水浸泡后的種子置于100～140℃的烘箱中烘干，自然冷卻到室溫后將種子播種于采用體積濃度0.3%的高錳酸鉀溶液消毒過的沙床上。

以上所述的芽苗移植與管理方法是當芽苗高6～8 cm時移植到無紡布育苗袋內，每隔7～10天施一次質量濃度0.5%復合肥溶液，40天后芽苗生根穩定。

以上步驟（3）選取苗高40～60 cm，地徑0.3～0.6 cm，主干通直，側枝少的容器苗作為母株。

以上步驟（3）所述的基質的組分和重量比是：黃心土∶椰糠∶珍珠巖∶草木灰為5∶2∶2∶1。

以上所述的母株管理方法是用遮陰度為40～60%的遮陰網搭建高1.8～2.5 m的蔭棚，每隔7～15天施肥一次體積濃度為0.5～1%復合肥溶液，每20天向葉面噴施一次質量濃度為0.2%～0.5％的磷酸二氫鉀溶液；當母株種植30天后，于距離地面30 cm處截斷主干。

以上所述的外植體獲取方法是剪取長6～9cm，直徑0.2～0.4 cm的萌芽條，用體積濃度75%的酒精溶液對萌芽條進行噴霧消毒后，于萌芽條頂部0.5～1.0 cm處剪除頂芽，余下部分由上至下修剪成3.0～4.0 cm長的莖段作為外植體，每根萌芽條取1～2個莖段。

以上所述的復合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%。

對比于現有技術，本發明具有的優點及有益效果如下：

1、本發明是在苗圃里進行母株種植，方便母株管理和萌條采集；在母株選擇時已經過優良種源和優良壯苗的兩輪選擇，能很好的保證了所獲取的外植體的優良品質，并且在管理下，萌條可以不斷萌發，生長快，可滿足規?；a的需要。

2、本發明及時對母株進行截干促萌，既保證了有足夠的萌芽生長空間，又更好的保持了營養的均衡；選取適合的萌芽條作為外植體材料，其木質化程度和生理老化程度可較好的滿足了組培需要。

4、本發明根據杏葉柯的生理特性配制的母株基質，材料易得，營養均衡，減少了生產成本，提高了母株的成活率。

5、本發明在消毒萌芽條后，于其頂部剪除頂芽，可除掉受消毒液傷害的幼嫩頂芽，保證了外植體接種后的成活率；每根萌條從上往下剪取1-2個莖段，保證取莖段均具有較強的再生能力，保證了不定芽誘導過程中不定芽集中萌發，萌芽整齊。

6、本發明的母株管理和萌條采集都十分方便，所獲得的外植體品質優良，污染率、死亡率低，不定芽萌發率高，萌芽整齊，可操作性強，滿足了杏葉柯組織培養快速繁殖體系建立的需求，具有較強的經濟效益、社會效益和生態效益。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。

實施例1：

選取無病蟲害、顆粒飽滿的杏葉柯優良家系種子，經常規消毒和熱水浸泡后將種子置于100～140℃的烘箱中烘干，自然冷卻到室溫后將種子播種于采用體積濃度0.3%的高錳酸鉀溶液消毒過的沙床上。

芽苗出土后，當芽苗高6～8 cm時移植到規格為15cm×15cm無紡布育苗袋內，視情況淋水、噴藥，并每隔7～10天施一次質量濃度0.5%復合肥溶液，其中復合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%，40天后芽苗生根穩定。

當移植苗木生根穩定后，選取苗高40～60 cm，地徑0.3～0.6 cm，主干通直，側枝少的容器苗作為母株，移栽到規格為30cm×30cm并裝有基質的容器杯內，所述的基質的組分和重量比是：黃心土∶椰糠∶珍珠巖∶草木灰為5∶2∶2∶1。用遮陰度為40～60%的遮陰網搭建高1.8～2.5 m的蔭棚，每隔7～15天施肥一次體積濃度為0.5～1%復合肥溶液，復合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%；每20天向葉面噴施一次質量濃度為0.2～0.5％的磷酸二氫鉀溶液；當母株種植30天后，于距離地面30 cm處截斷主干。

剪取長6～9cm，直徑0.2～0.4 cm的萌芽條，用體積濃度75%的酒精溶液對萌芽條進行噴霧消毒后，于萌芽條頂部0.5～1.0 cm處剪除頂芽，余下部分由上至下修剪成3.0～4.0 cm長的莖段作為外植體，每根萌芽條取1～2個莖段。

實施例2：

選取無病蟲害、顆粒飽滿的杏葉柯優良家系種子，經常規消毒和熱水浸泡后將種子置于110℃的烘箱中烘干，自然冷卻到室溫后將種子播種于采用體積濃度0.3%的高錳酸鉀溶液消毒過的沙床上。

芽苗出土后，當芽苗高6～8 cm時移植到規格為15cm×15cm無紡布育苗袋內，視情況淋水、噴藥，并每隔8天施一次質量濃度0.5%復合肥溶液，其中復合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%，40天后芽苗生根穩定。

當移植苗木生根穩定后，選取苗高45～50 cm，地徑0.3～0.4 cm，主干通直，側枝少的容器苗作為母株，移栽到規格為30cm×30cm并裝有基質的容器杯內，所述的基質的組分和重量比是：黃心土∶椰糠∶珍珠巖∶草木灰為5∶2∶2∶1。用遮陰度為50%的遮陰網搭建高2.0 m的蔭棚，每隔8天施肥一次體積濃度為0.5%復合肥溶液，復合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%；每20天向葉面噴施一次質量濃度為0.2～0.3％的磷酸二氫鉀溶液；當母株種植30天后，于距離地面30 cm處截斷主干。

剪取長6～8cm，直徑0.2～0.3 cm的萌芽條，用體積濃度75%的酒精溶液對萌芽條進行噴霧消毒后，于萌芽條頂部0.5 cm處剪除頂芽，余下部分由上至下修剪成3.0cm長的莖段作為外植體，每根萌芽條取1～2個莖段。

實施例3：

選取無病蟲害、顆粒飽滿的杏葉柯優良家系種子，經常規消毒和熱水浸泡后將種子置于120℃的烘箱中烘干，自然冷卻到室溫后將種子播種于采用體積濃度0.3%的高錳酸鉀溶液消毒過的沙床上。

芽苗出土后，當芽苗高6～8 cm時移植到規格為15cm×15cm無紡布育苗袋內，視情況淋水、噴藥，并每隔9天施一次質量濃度0.5%復合肥溶液，其中復合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%，40天后芽苗生根穩定。

當移植苗木生根穩定后，選取苗高50～55 cm，地徑0.4～0.5 cm，主干通直，側枝少的容器苗作為母株，移栽到規格為30cm×30cm并裝有基質的容器杯內，所述的基質的組分和重量比是：黃心土∶椰糠∶珍珠巖∶草木灰為5∶2∶2∶1。用遮陰度為40～60%的遮陰網搭建高2.2 m的蔭棚，每隔10天施肥一次體積濃度為1%復合肥溶液，復合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%；每20天向葉面噴施一次質量濃度為0.3～0.4％的磷酸二氫鉀溶液；當母株種植30天后，于距離地面30 cm處截斷主干。

剪取長7～8cm，直徑0.2～0.3cm的萌芽條，用體積濃度75%的酒精溶液對萌芽條進行噴霧消毒后，于萌芽條頂部0.5～1.0 cm處剪除頂芽，余下部分由上至下修剪成3.0～4.0 cm長的莖段作為外植體，每根萌芽條取1～2個莖段。

實施例4：

選取無病蟲害、顆粒飽滿的杏葉柯優良家系種子，經常規消毒和熱水浸泡后將種子置于140℃的烘箱中烘干，自然冷卻到室溫后將種子播種于采用體積濃度0.3%的高錳酸鉀溶液消毒過的沙床上。

芽苗出土后，當芽苗高6～8 cm時移植到規格為15cm×15cm無紡布育苗袋內，視情況淋水、噴藥，并每隔10天施一次質量濃度0.5%復合肥溶液，其中復合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%，40天后芽苗生根穩定。

當移植苗木生根穩定后，選取苗高55～60 cm，地徑0.5～0.6 cm，主干通直，側枝少的容器苗作為母株，移栽到規格為30cm×30cm并裝有基質的容器杯內，所述的基質的組分和重量比是：黃心土∶椰糠∶珍珠巖∶草木灰為5∶2∶2∶1。用遮陰度為60%的遮陰網搭建高2.5 m的蔭棚，每隔15天施肥一次體積濃度為1%復合肥溶液，復合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%；每20天向葉面噴施一次質量濃度為0.4～0.5％的磷酸二氫鉀溶液；當母株種植30天后，于距離地面30 cm處截斷主干。

剪取長8～9cm，直徑0.3～0.4 cm的萌芽條，用體積濃度75%的酒精溶液對萌芽條進行噴霧消毒后，于萌芽條頂部0.5～1.0 cm處剪除頂芽，余下部分由上至下修剪成4.0 cm長的莖段作為外植體，每根萌芽條取1～2個莖段。