專利名稱：一種木姜葉柯總黃酮的制備方法
技術領域：
本發明涉及藥物制備，更具體地說是降血糖類的植物藥品及保健品的制備方法。
背景技術：
木姜葉柯為殼斗科柯屬植物Lithocarpus litseifolius Chun.，主要分布于中 國廣西百色、凌云、平果、那坡、隆林、大明山和河池等地區的山地密林中，資源豐富。木姜 葉柯主要成分是黃酮類成分，含量最高達到12.6%，主要包括根皮苷、三葉苷、3-羥基根 皮苷。藥理研究發現根皮苷及其同分異構體三葉苷對糖代謝的調節具有藥動學方面的協 同作用，根皮苷能逆轉胰島素抵抗性，使胰島素抵抗大鼠的糖耐量和胰島素敏感性恢復正 常，糾正高血糖狗的胰高血糖素對葡萄糖的敏感性，抑制高血糖家兔腸道對糖的吸收，部 分逆轉糖尿病的肝糖代謝基因的表達，增高葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，催化磷酸戊糖途 徑。1988年美國專利US 4760135公開了根皮苷及根皮素衍生物用于降血糖藥物的制造， 但是根皮苷在腸道可被糖苷酶水解(Diedrich, Arch. Biochem. Biophys.，1972，153(1) 155)，Barrow對比了灌胃和腹腔注射給藥兩種途徑，證明只有腹腔注射的大鼠體內發現有 原形藥物(Barrow，Biochem. J. 1977，125(2) :24)，這種水解活性具有明顯的動物種族差異 (Ramaswamy, Comp. Biochem. Physiol. Α.，1972，43(1) :173)。由于 US4760135 用的是單一活 性化合物根皮苷，無法避免腸道糖苷酶的水解，因此，必須注射給藥才能生效。而糖尿病患 者對長期注射給藥方式是難以接受的。

發明內容
本發明的目的是為了給糖尿病患者提供一種以木姜葉柯總黃酮為原料的新型藥 物，以利于糖尿病患者能長期、方便地服用，特別是提供了這種藥物的制備方法。研究發現，三葉苷是腸道糖苷酶的抑制劑，又是此酶的底物。但是其抑制糖苷酶的 作用遠大于被水解的作用(Evans, Arch. Biochem. Biophys. , 1980,199 (2) 342)；由于三葉 苷具有抑制腸道糖苷酶對根皮苷的水解，保護根皮苷不受糖苷酶的水解，可提高根皮苷的 生物利用度。又由于根皮苷與三葉苷共同存在于木姜葉柯中，成為具有藥動學協同作用的 天然配方。從木姜葉柯中提取的混合提取物-木姜葉柯總黃酮，其中包括根皮苷和三葉苷， 可以避免根皮苷在腸道的水解，因而口服給藥也有效。因此，糖尿病患者更加容易接受。木姜葉柯總黃酮可以抑制腸道對糖的吸收，減少血糖來源；抑制腎糖重吸收，促進 糖的排泄，降低血糖，減輕高血糖對各個器官組織的毒性作用；提高組織細胞對胰島素的敏 感性，改善胰島素的抵抗性；促進磷酸戊糖途徑和肌糖原的合成，增加糖的氧化。由于它在 糖代謝過程中可以減少血糖來源和增加血糖去路等多個環節進行調整，所以木姜葉柯總黃 酮成了 一種新型降血糖藥物的主要有效成分。本發明提出的一種木姜葉柯總黃酮制備方法，包括提取、濃縮、真空干燥工序，其 特征在于以乙醇為溶劑，對木姜葉柯干葉進行加熱回流提取，提取液經處理后再用聚酰胺 樹脂吸附分離，最后再以乙醇為洗脫劑將聚酰胺樹脂上的木姜葉柯總黃酮洗脫。
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上述的一種木姜葉柯總黃酮制備方法，其特征在于1.乙醇加熱回流提取a.木姜葉柯干葉，按重量加5-15倍量20_70%體積濃度的乙醇；b.回流提取1—4次，每次0. 5—3小時；c.回流提取溫度為50_90°C。2.聚酰胺樹脂法分離純化a.吸附上柱根皮苷量與聚酰胺樹脂的質量體積比<23 1(即相當于0.3g原 生藥/mL樹脂)；上樣液根皮苷濃度為6-8mg/mL(相當于0. Ig原生藥/mL)；上柱流速為 0.5-2BV/h ；b.洗脫以乙醇為洗脫劑；洗脫劑用量為10-30BV ；洗脫流速為l_3BV/h。上述的一種木姜葉柯總黃酮制備方法，其特征在于1.乙醇加熱回流提取a.木姜葉柯干葉，按重量加10倍量70%體積濃度的乙醇；b.回流提取三次，每次2小時；c.回流提取溫度為80_90°C。2.聚酰胺樹脂法分離純化a.吸附上柱根皮苷與聚酰胺樹脂質量體積比<23 1 (即相當于0. 3g原生藥/ mL樹脂)；上樣液根皮苷濃度為7mg/mL(相當于0. Ig原生藥/mL)；上柱流速為lBV/h ；b.洗脫20%乙醇為洗脫劑；洗脫劑用量為20BV ；洗脫流速為2BV/h。上述的一種木姜葉柯總黃酮制備方法，其特征在于聚酰胺樹脂規格為80-100目。收集20BV的洗脫液，洗脫液減壓回收乙醇，濃縮，真空干燥，獲得本發明的降血糖 提取物——木姜葉柯總黃酮。本發明的技術方案和操作方法是這樣選擇和確定的。黃酮類化合物的提取一般采用溶劑提取法，如熱水提取、堿性水或堿性稀醇提取、 有機溶劑提取、系統溶劑提取等方法(陳曉青，等.中草藥成分分離分析技術與方法，第1 版.北京化學工業出版社現代生物技術與醫藥科技出版中心，2006 =62-65.)。而從木姜葉 柯中提取黃酮成分主要有水煎煮提取法(廖曉峰，等.從多穗柯中提取二氫查耳酮(DHC) 類甜味劑的研究.廣州食品工業科技，1999，15(1) =35-38.；于麗靜，等.多穗柯中二氫查 耳酮的提取、純化與含量測定.中國食品添加劑，2007，(1) 176-179.；董華強，等.微波輔 助提取多穗柯嫩葉黃酮工藝研究.農業工程學報，2007，23 (2) 213-217.)和乙醇提取法 (肖坤福，等.多穗柯中黃酮類物質提取工藝的研究.食品科學，2004，25 (5) 112-115.； 李勝華，等.多穗柯總黃酮提取工藝及其含量動態變化研究.食品科學，2008，29(6) 139-141.；趙紅芳，楊亞玲，周強.云南甜茶中總黃酮的提取及其抗過敏活性研究.河北化 工，2006，29 (5) 10-11.)。熱水提取法是提取黃酮苷類化合物的常用方法，易于工業化大生 產，但熱水浸提時易溶于水的雜質較多，后處理較復雜，提取效率也不太高。由于黃酮類化合物大多具有酚羥基，因此可用堿性水或堿性稀醇浸提，浸出液經 酸化后可析出黃酮類化合物。但用堿性溶劑提取時，所用的堿濃度過高，加熱時容易破壞黃 酮類化合物母核；而且浸出液酸化時，析出的黃酮類化合物的稀醇或酸水中有一定的溶解度，降低了產品收率。所以不太適宜于工業化生產。乙醇是最常用的黃酮類化合物提取溶劑。其他有機溶劑雖然選擇性強，但容易揮 發，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，價格較貴，設備要求也比較高，操作需要有通風設備，在 大量提取中草藥原料或工業化生產時，直接應用這類溶劑有一定的局限性。綜合考慮各方面因素，我們選用比較常用的、比較經典的、易于操作的、工藝簡單 的乙醇提取與水提取進行比較，從而選出比較好的提取溶劑。1.木姜葉柯總黃酮的提取1. 1提取溶劑的選擇取木姜葉柯嫩葉粗粉分別用乙醇和水提取，以木姜葉柯總 黃酮中的主要有效成分根皮苷提取量為考察指標，優選出較好的提取溶劑。1. 1. 1水煎煮提取取木姜葉柯嫩葉粗粉100g，水煎煮提取二次，每次加10倍量 水，每次2小時，合并提取液，濾過，濾液濃縮至稠膏，真空干燥，稱重，測定其根皮苷含量， 計算根皮苷提取量。1. 1. 2乙醇回流提取取木姜葉柯嫩葉粗粉100g，加熱回流二次，每次加10倍量 70%乙醇，每次2小時，合并回流液，濾過，濾液減壓回收乙醇濃縮至稠膏，真空干燥，稱重， 測定其根皮苷含量，按下式計算根皮苷提取量。 實驗結果見表1。表1水煎煮提取和乙醇回流提取比較 實驗結果表明，乙醇提取較水提取好。乙醇安全，環保，易于工業化生產乙醇是中藥提取最常用的有機溶劑，其溶解性 能良好，對中草藥細胞的穿透力較強；乙醇的濃度還可以根據被提取物質的性質而變化，采 用不同濃度的乙醇進行提??；用乙醇提取比用水量少，提取時間短，溶解出的水溶性雜質也 少；乙醇雖易燃，但毒性小，價格便宜，來源方便，有一定設備即可回收反復使用；乙醇提取 液不易發霉變質。因此，乙醇是實驗室和工業生產中應用范圍最廣的一種溶劑，是歷來提取 最常用的一種溶劑。黃酮類化學成分易溶于乙醇木姜葉柯的主要有效成分是二氫查爾酮類黃酮，易 溶于乙醇，故用乙醇提取含量大雜質少。總而言之，乙醇利于黃酮有效成分的溶出，安全，環 保，且工藝流程簡單，提取率高，易于工業化生產。 綜合考慮，提取溶劑以乙醇為佳。 1. 2提取方法的選擇用乙醇提取分別采用冷浸法、滲漉法、回流法、超聲法進行
5實驗研究，以根皮苷的提取量為考察指標，比較這4種方法，優選出較佳提取方法。1.2. 1冷浸法取木姜葉柯嫩葉粗粉100g，室溫浸漬二次，每次加10倍量70% 乙醇，每次24小時，并時時攪拌，合并浸提液，濾過，濾液減壓回收乙醇濃縮至稠膏，真空干 燥，稱重，測定其根皮苷的含量，計算根皮苷提取量。1.2. 2滲漉法取木姜葉柯嫩葉粗粉100g，加入適量70%乙醇，浸漬24小時后，以 1 3mL/min的速度滲漉(共用20倍量70%乙醇浸漬、滲漉)，收集滲漉液，滲漉液減壓回 收乙醇濃縮至稠膏，真空干燥，稱重，測定其根皮苷的含量，計算根皮苷提取量。1. 2. 3加熱回流法取木姜葉柯嫩葉粗粉100g，加熱回流二次，每次加10倍量 70%乙醇，每次2小時，合并回流液，濾過，濾液減壓回收乙醇濃縮至稠膏，真空干燥，稱重， 測定其根皮苷的含量，計算根皮苷提取量。1. 2. 4超聲處理法取木姜葉柯嫩葉粗粉100g，超聲處理(功率80W，頻率50KHz) 二次，每次加10倍量70%乙醇，每次1小時，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇濃縮至稠 膏，真空干燥，稱重，測定其根皮苷的含量，計算根皮苷提取量。實驗結果見表2。表2不同乙醇提取法的比較

實驗結果表明，超聲法>回流法>滲漉法>冷浸法。超聲法最為簡便、快速，提取 效果也較好，是實驗性提取及含量測定較好的方法。雖然超聲場的介入可有效強化總黃酮 有效成分的提取過程，縮短提取時間，提高提取率，但超聲波設備目前難以工業化，只適合 實驗室研究，而不適合大批量的工業生產?；亓鞣ǖ奶崛⌒Ч谏鲜霰容^中僅次于超聲法， 所用設備也較簡單，提取周期不長，溶劑量也不大，對有效成分的質量及含量產生不良影響 較小，在工業大生產中較常應用，易開展較大規模的工業生產，不失為木姜葉柯黃酮有效成 分工業提取的一種有效方法。而冷浸法和滲漉法的效果都不如回流法。綜合考慮，提取方法以加熱回流法為佳。1. 3乙醇提取工藝條件的優化以根皮苷的提取量為考察指標，采用正交試驗，優 選回流提取法的最佳提取工藝條件。1. 3. 1正交試驗設計與因素水平選擇在材料粉碎度以及所用溶劑一定條件下， 溶劑的濃度、回流時間、提取溫度、提取次數以及溶媒量等因素都會對提取產生影響，本試 驗選用乙醇為提取溶劑，為了盡可能地不破壞有效成分，回流提取溫度控制在80-90°C，因 此，選取乙醇濃度、乙醇用量、提取次數、提取時間作為考察因素，每個因素設計3個水平， 按1^9(34)進行試驗。因素水平表見表3。表3 因素水平表 1. 3. 2試驗方法稱取同一批木姜葉柯嫩葉粗粉9份，每份100g，按正交設計進行 回流提取，提取液回收乙醇濃縮至稠膏，真空干燥，稱重，計算得膏率，測定根皮苷的含量， 計算根皮苷提取量。結果見表4。表4 L9 (34)正交試驗計算表 經直觀比較分析正交試驗結果，同時結合生產實際，木姜葉柯總黃酮提取的最佳 工藝條件為A2B2C2D3，即木姜葉柯，加10倍量70%乙醇回流提取三次，每次2小時，回流提 取溫度控制在80-90°C。1. 3. 3最佳提取條件確認性試驗
取同一批木姜葉柯嫩葉粗粉，稱取100g，共3份，按上述優選的最佳方案進行提取 后，濃縮、干燥，測定根皮苷的含量，計算根皮苷提取量，結果見表5。表5最佳提取方案確認性試驗結果

試驗結果表明，按優選得到的工藝條件進行提取，其根皮苷的含量穩定在較優水 平，說明優選得到的工藝條件合理穩定可行。本提取工藝簡單，耗能低，在工藝過程中主要采用乙醇提取，使原料中有害溶劑的 殘留量少，符合國家對食品及藥品的要求。2.木姜葉柯總黃酮的分離純化工藝研究2. 1木姜葉柯總黃酮的提取取木姜葉柯嫩葉粗粉300g，加10倍量70%乙醇回流提取三次，每次2小時，合并 提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水至300mL(即原生藥含量為lg/mL)，搖勻， 測定其根皮苷含量為76. 80mg/mL，備用。2. 2木姜葉柯總黃酮的分離純化黃酮類化合物的分離方法一般有聚酰胺吸附法、溶劑萃取法、鉛鹽法、硼酸絡合 法、PH梯度萃取法、大孔樹脂法、柱色譜法等[2]。而木姜葉柯總黃酮的分離純化方法主要有 大孔吸附樹脂分離法[9_1(1]、離子交換樹脂法[3]。上述有些方法普遍存在所需溶劑、設備昂貴，方法繁瑣的缺點，且無法對木姜葉柯 總黃酮進行大規模的分離純化，在實際生產中難以得到應用。溶劑萃取法是較簡單的分離方法，而大孔吸附樹脂法和聚酰胺吸附法不僅操作簡 單，而且價格低，市售的經過一般處理就可以使用，一般用乙醇水溶液洗脫，不使用較貴重 的溶劑，對環境友好，設備要求也不高，分離純化效果佳，在實際工業化生產中應用較多。所 以選用以上三種方法進行比較，優選出其中較好的分離純化方法。2. 2. 1分離純化方法的選擇以主要有效成分根皮苷的含量及總黃酮的純度為考核指標，比較溶劑萃取法、大 孔吸附樹脂法和聚酰胺樹脂吸附法對木姜葉柯總黃酮的分離純化效果。2. 2. 1. 1大孔吸附樹脂預處理取大孔吸附樹脂，用95%乙醇溶液浸泡樹脂24小時，充分溶脹后用濕法裝柱，用 95%乙醇以2BV(V為樹脂體積，下同)/h的流速清洗，至流出液與水混合(1 5)不呈白色 混濁為止，再用蒸餾水清洗柱子至流出液無醇味，備用。量取樹脂時以樹脂在水中溶脹后的 體積(mL)為單位。2. 2. 1.2聚酰胺樹脂預處理取聚酰胺樹脂，用95 %乙醇溶液浸泡樹脂24小時，充分溶脹后用濕法裝柱，用 95%乙醇以2BV/h的流速清洗，洗至流出液透明，再用蒸餾水清洗柱子至流出液無醇味，備用。量取樹脂時以樹脂在水中溶脹后的體積(mL)為單位。2. 2. 1.3溶劑萃取法分離取4. 1項下的提取液20mL，用石油醚萃取二次，每次20mL，石油醚萃取液棄去，再 用水飽和正丁醇萃取三次，每次20mL，合并萃取液，減壓回收正丁醇，真空干燥，測定根皮苷 的含量和總黃酮純度。2. 2. 1.4大孔吸附樹脂分離取已處理好的大孔吸附樹脂(DM-130) IOOmL,濕法裝柱(3. 4cmX45cm)，取4. 1項 下的提取液20mL，加水至IOOmL,攪勻，放置24小時，濾過，濾液以2BV/h的流速連續通過樹 脂柱，用2BV的水洗脫，水洗脫液棄去，用50%乙醇以2BV/h的流速洗脫，收集25BV的洗脫 液，洗脫液減壓回收乙醇至稠膏，真空干燥，測定根皮苷的含量和總黃酮純度。2. 2. 1. 5聚酰胺樹脂分離取已處理好的聚酰胺樹脂(100-200目)IOOmL,濕法裝柱(3. 4cmX 45cm)，取4. 1 項下的提取液20mL，加水至IOOmL,攪勻，放置24小時，濾過，濾液以2BV/h的流速連續通過 樹脂柱，用2BV的水洗脫，水洗脫液棄去，用50%乙醇以2BV/h的流速洗脫，收集25BV的洗 脫液，洗脫液減壓回收乙醇至稠膏，真空干燥，測定根皮苷的含量和總黃酮純度。三種分離方法比較結果見表6。表6三種不同分離方法試驗結果 實驗結果顯示，三種方法中，聚酰胺樹脂法分離效果較佳，經聚酰胺樹脂分離后 的木姜葉柯總黃酮，根皮苷含量和總黃酮純度均比其余兩種方法的高，且總黃酮純度大于 50%，符合國家有效部位新藥申報規定要求，故木姜葉柯總黃酮的分離純化采用聚酰胺樹 脂法。2. 2. 2聚酰胺樹脂的篩選通過對不同規格的聚酰胺樹脂對木姜葉柯總黃酮中根皮苷的靜態吸附_洗脫性 能的研究來篩選最適樹脂規格。取4. 1項下的提取液30mL，加水至150mL，攪勻，放置24 小時，濾過，濾液均分3份，作為供試液。量取已處理好的不同規格(30-60目、80-100目、 100-200目)的聚酰胺樹脂各20mL，分別置于IOOmL具塞磨口錐形瓶中，分別加入上述供試 液，浸漬24小時(每隔4小時振搖一次)，充分吸附后，濾過，濾液減壓濃縮，真空干燥，稱 重，測定其中的指標成分根皮苷含量，按下式計算靜態飽和吸附量。過濾所得樹脂另置于 IOOmL具塞磨口錐形瓶中，加50%乙醇50mL，每隔20分鐘振搖1次，持續4小時，然后靜置 12小時，濾過，濾液減壓濃縮，真空干燥，稱重，測定其中的指標成分根皮苷含量，按下式計 算靜態洗脫率。結果見表7。
表7不同規格聚酰胺樹脂的靜態吸附_洗脫研究 實驗結果顯示聚酰胺樹脂80-100目和100-200目的吸附量明顯高于30_60目， 雖然100-200目的吸附量最高，但洗脫率卻比較低，而且由于其樹脂粉末過細，流速太慢且 容易堵塞，因此，綜合考慮各樹脂的靜態吸附與洗脫性能，選擇80-100目的聚酰胺樹脂作 為木姜葉柯總黃酮分離純化的適用樹脂規格。2. 2. 3聚酰胺樹脂吸附條件的考察2. 2. 3. 1上樣液濃度的考察取4. 1項下的提取液10mL，共4份，分別稀釋配成2. 5倍、5倍、7. 5倍、10倍濃度的 溶液，搖勻，放置24小時，濾過，濾液分別作為上樣液。量取已處理好的聚酰胺樹脂(80-100 目)20mL，共4份，分別濕法裝柱(1.3CmX30Cm)，取上述上樣液以同樣的流速分別上柱，收 集過柱流出液，減壓濃縮，真空干燥，稱重，測定其中的指標成分根皮苷含量，按下式計算動 態飽和吸附量。結果見表8。 表8不同上樣液濃度的動態飽和吸附量
實驗結果顯示，稀釋10倍的濃度(即上樣液中每mL含根皮苷7mg，約相當于0. Ig 原生藥)時，動態飽和吸附量最大，故選擇根皮苷濃度為7mg/mL(即相當于0. Ig原生藥/ mL)的上樣液為佳。2. 2. 3. 2上樣流速的考察取4. 1項下的提取液40mL，加水至400mL，攪勻，放置24小時，濾過，濾液均分為 4份，作為上樣液。量取已處理好的聚酰胺樹脂(80-100目)20mL，共4份，分別濕法裝柱 (1.3CmX30Cm)，取上述上樣液分別進行上樣吸附，控制一定流速(分別取流速為1、2、3、 4BV/h)，收集流出液，減壓濃縮，真空干燥，稱重，測定其中的指標成分根皮苷含量，計算動 態飽和吸附量，結果見表9。表9不同上樣速度的動態飽和吸附量 實驗結果顯示，隨著上柱吸附流速的加快，動態飽和吸附量也隨著減少，當吸附流 速為lBV/h時，動態飽和吸附量最大，故選擇吸附流速為lBV/h。2. 2. 3. 3上樣量的選擇根據4. 2. 3. 2項下的實驗結果，當選擇最佳上樣液濃度為7. 68mg根皮苷/mL(即 相當于0. Ig原生藥/mL)、上柱吸附流速為lBV/h時，動態飽和吸附量為22. 92mg/mL,即每 mL聚酰胺樹脂(80-100目)對根皮苷的飽和吸附量為22. 92mg(約相當于0. 3g原生藥)， 因此，上柱根皮苷量(mg)與所用樹脂(mL)的比例應<23 1 (即相當于0. 3g原生藥/mL 樹脂)。2. 2. 3. 4最佳吸附條件的確定綜合以上吸附條件的實驗結果，聚酰胺樹脂(80-100目)純化木姜葉柯總黃酮的 最佳吸附條件為上柱根皮苷量(mg)與所用樹脂(mL)的比例應< 23 1 (即相當于0. 3g 原生藥/mL樹脂)，上樣液根皮苷濃度為7mg/mL(相當于0. Ig原生藥/mL)，上柱流速為IBV/ h。這樣可達到最佳吸附效果。
2. 2. 4聚酰胺樹脂洗脫條件的考察2.2.4. 1洗脫劑濃度的考察取4. 1項下的提取液40mL，加水至400mL，攪勻，放置24小時，濾過，濾液均分 4份，作為上樣液。量取已處理好的聚酰胺樹脂(80-100目)20mL，共4份，分別濕法裝 柱(1.3CmX30Cm)，取上述上樣液以lBV/h的流速分別上柱吸附，然后分別用20%、40%、 60%、80%乙醇以同樣的洗脫流速進行洗脫，分別收集25BV的洗脫液，洗脫液減壓濃縮，真 空干燥，稱重，測定其中的指標成分根皮苷含量，比較洗脫液中根皮苷的總量。結果見表10。表10不同濃度的乙醇溶液的洗脫效果 實驗結果顯示，用20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇洗脫時，洗脫液中根皮苷量沒有 明顯的差異，但均比用80%乙醇洗脫的高，考慮到溶劑的成本等因素，故選擇20%乙醇為 最適洗脫劑濃度。2. 2. 4. 2洗脫劑用量的考察取2. 1項下的提取液10mL，加水至IOOmL,攪勻，放置24小時，濾過，濾液作為上樣 液。量取已處理好的聚酰胺樹脂(80-100目)20mL，濕法裝柱(1. 3cmX30cm)，取上述上樣 液以lBV/h的流速上柱吸附，然后用20%乙醇以同樣的洗脫流速進行洗脫，分段(0-10BV、 10BV-15BV、15BV-20BV,20BV-25BV,25BV-30BV)收集洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，稱重，測 定其中的指標成分根皮苷含量，比較洗脫液中根皮苷的總量。結果見表11。表11不同體積的20%乙醇的洗脫效果
實驗結果顯示，當洗脫液體積增加時，根皮苷的量也隨著增加。當體積達到20BV 后，增加緩慢。因此考慮到溶劑的用量、耗時、成本等方面，故選擇最佳的洗脫劑用量為 20BV。2. 2. 4. 3洗脫劑流速的考察取4. 1項下的提取液40mL，加水至400mL，攪勻，放置24小時，濾過，濾液均分4 份，作為上樣液。量取已處理好的聚酰胺樹脂(80-100目)20mL，共4份，分別濕法裝柱 (1.3CmX30Cm)，取上述上樣液以lBV/h的流速分別上柱吸附，然后用20%乙醇分別以1、2、 3、4BV/h的速度洗脫，分別收集20BV的洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，稱重，測定其中的指標成分根皮苷含量，比較洗脫液中根皮苷的總量。結果見表12。表12不同洗脫速度的洗脫效果 實驗結果顯示，洗脫流速為2BV/h時，洗脫液中根皮苷總量為最大，即洗脫效果最 好，故確定洗脫流速為2BV/h。2. 2. 4. 4最佳洗脫條件的確定綜合以上洗脫條件的實驗結果，聚酰胺樹脂(80-100目)純化木姜葉柯總黃酮的 最佳洗脫條件為以20%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為2BV/h，洗脫劑用量為20BV。這樣可達 到最佳洗脫效果。3木姜葉柯總黃酮的制備工藝的確定經過對木姜葉柯總黃酮的分離純化工藝的系統研究及放大驗證試驗，篩選出分離 純化效果最佳的聚酰胺樹脂規格為80-100目，其最佳工藝條件為上柱根皮苷量(mg)與 樹脂(mL)的比例應<23 1(即相當于0.3g原生藥/mL樹脂)，上樣液中根皮苷濃度為 7. 68mg/mL(即相當于0. Ig原生藥/mL)，吸附流速為lBV/h，洗脫劑乙醇濃度為20%，洗脫 流速為2BV/h，洗脫劑用量為20BV，這樣純化后得到的木姜葉柯總黃酮的純度可達80%以 上，根皮苷含量達65%以上。本發明具有如下優點1.本發明的木姜葉柯總黃酮的制備的技術方案，其根皮苷的含量穩定在較優水 平，工藝條件合理穩定可行。2.本提取工藝簡單，耗能低，在工藝過程中主要采用乙醇提取，使原料中有害溶劑 的殘留量少，符合國家對食品及藥品的要求。3.以本發明獲得的木姜葉柯總黃酮為主要原料，制備降血糖藥物能夠給糖尿病人 提供方便的，比較容易接受的和長期服用的口服降糖藥制劑。
具體實施例實施例1取木姜葉柯嫩葉粗粉1500g，加10倍量70% (體積濃度，以下相同)乙醇回流提 取三次，每次2小時，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水稀釋至15000mL， 攪勻，放置24小時，濾過，濾液作為上樣液；分別量取已處理好的聚酰胺樹脂(80-100 目)5100mL，濕法裝柱，上柱根皮苷量(mg)與樹脂體積(mL)的比例為23 1，上樣液以IBV/ h的流速進行吸附，用2BV的水洗脫，水洗脫液棄去，用20%乙醇以2BV/h的流速洗脫，收集 20BV的洗脫液，洗脫液減壓回收乙醇，濃縮，真空干燥，得到本發明的降血糖提取物，測定結 果，總黃酮的純度88. 77%，根皮苷含量75. 39%。將上述提取物制成(膠囊、片劑、顆粒劑、口服液等)降血糖的藥物制劑。實施例2
取木姜葉柯干葉粗粉100g，加10倍量70%乙醇回流提取三次，每次2小時，合并 提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水稀釋至IOOOmL,攪勻，放置24小時，濾過， 濾液作為上樣液；分別量取已處理好的聚酰胺樹脂(80-100目)340mL，濕法裝柱，上柱根皮 苷量(mg)與樹脂體積(mL)的比例為23 1，上樣液以lBV/h的流速進行吸附，用2BV的水 洗脫，水洗脫液棄去，用20%乙醇以2BV/h的流速洗脫，收集20BV的洗脫液，洗脫液減壓回 收乙醇，濃縮，真空干燥，得到本發明的降血糖提取物-木姜葉柯總黃酮。測定結果，總黃酮 的純度85. 13%，根皮苷含量67. 46%。實施例3取木姜葉柯嫩葉粗粉300g，加10倍量70%乙醇回流提取三次，每次2小時，合并 提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水稀釋至3000mL，攪勻，放置24小時，濾過， 濾液作為上樣液；分別量取已處理好的聚酰胺樹脂(80-100目)1050mL，濕法裝柱，上柱根 皮苷量(mg)與樹脂體積(mL)的比例為23 1，上樣液以lBV/h的流速進行吸附，用2BV的 水洗脫，水洗脫液棄去，用20%乙醇以2BV/h的流速洗脫，收集20BV的洗脫液，洗脫液減壓 回收乙醇，濃縮，真空干燥，得到本發明的降血糖提取物-木姜葉柯總黃酮。測定結果，總黃 酮的純度86. 74 %，根皮苷含量69. 53 %。木姜葉柯總黃酮應用于制備降血糖各種制劑的藥品或保健食品，如膠囊劑、片劑、 顆粒、口服液等制劑。用上述提取物制成的膠囊劑，進行毒理學、藥效學和臨床試驗，結果如下長期毒性試驗摘要以臨床日劑量的120倍、60倍、30倍三個劑量分別給大鼠灌胃給藥，每天1 次，每周給藥6天，連續26周。各組動物血液學、血液生化學指標、臟器系數、體重增長以及 病理組織學指標均未見明顯毒性性改變，各指標均在正常范圍。表明本品按臨床擬用給藥 方案應用應是安全的。受試藥物木姜葉柯流浸膏，每ml相當生藥3. 828g，批號20000801。臨用時以水 稀釋成所需濃度的混懸液，按10ml/kg體重灌胃。本試驗劑量以“生藥g/kg體重”表示。動物=Wistar大鼠體重100士20g，160只，雌雄各半，廣西中醫學院動物實驗中心 提供，普通級，合格證號桂醫動字第11005號。分籠飼養，每籠5只。喂標準顆粒飼料，試 驗室溫度25 士 3 °C，相對濕度70 士 5 %。試劑與儀器由澳斯邦生物工程有限公司提供試劑，用生化測定儀和血球計數儀 分別測定血液生化學和血液學指標。試驗方法=Wistar大鼠160只，隨機均分四組，每組40只，雌雄各半。設對照組、 本品28g/kg、14g/kg和7g/kg組(分別為臨床日劑量的120倍、60倍和30倍)。大鼠每周 灌胃給藥6天，每天一次，每次10ml/kg體重，連續用藥26周。每天觀察動物的進食、活動、 糞便等。前8周，每周稱體重1次，8周后，每兩周稱體重1次，同時調整給藥量。末次給藥 后24小時處死大鼠20只/組(雌雄各半)。取血測定血液學和血液生化學指標。剖取主 要臟器(心、肝、脾、肺、腎、睪丸或子宮、卵巢)稱重，計算每IOOg體重的臟器系數和作病理 組織學檢查。以各指標與對照組比較，用t’或t值法檢驗組間差異的顯著性。剩余每組雌 雄各10只大鼠，停藥繼續觀察2周，以同樣方法觀察上述指標。試驗結果
a給藥期間及停藥觀察期間，各組大鼠的外觀行為、呼吸、四肢活動、糞便均未見異 常，無動物死亡。體重增長率在正常范圍。b血液學檢查指標紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血小板計數(PLT)、白 細胞計數(WBC)、淋巴細胞計數(LYM)、單核細胞+嗜酸細胞+嗜堿細胞計數(MID)、嗜中性 粒細胞計數(GRA)和凝血時間(CT)。給藥26周各劑量組的各檢測指標與對照組的差異均 無顯著性意義，且均在正常范圍(3)。c血液生化學檢查指標總蛋白含量(TP)，白蛋白含量(ALB)，球蛋白含量(GLO)， 谷丙轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)，堿性磷酸酶(ALP)，總膽固醇(T_ch)，甘油三脂(TG)， 葡萄糖(GLU)，尿素氮(Urea)，肌酐(Cr)。給藥26周和停藥2周的各檢測指標中，各劑量組 與對照組之間的差異均無顯著性意義，且都在正常范圍(3)。d主要臟器系數給藥26周和停藥2周各給藥組與對照組之間的差異無顯著性意 義。e病理組織學檢查各組動物諸臟器未見與藥物毒性有關的病理改變.結論以臨床日劑量的120、60和30倍劑量分別給大鼠灌胃給藥，每天1次，每周 給藥6天，連續26周。各組動物血液學、血液生化學指標、臟器系數、體重增長以及病理組 織學指標均未見病理性改變，各指標均在正常范圍。表明本品按臨床擬用給藥方案應用應 是安全的。藥效學試驗1對四氧嘧啶誘發小鼠高血糖的影響取雄性小鼠60只，留10只作空白對照組， 其余iv四氧嘧啶80mg/kg體重造高血糖模型，7天后測空腹血糖值。選取空腹血糖值在 12. Ommol/L以上的小鼠50只，按血糖水平均勻分為5組模型對照組、優降糖對照組、提取 物低劑量、中劑量和高劑量組，每組10只。除空白對照組和模型對照組ig蒸餾水外，其余 4個給藥組動物按體重分別給優降糖0. 3g/kg、提取物0. 2,0. 4和0. 8g/kg。給藥容積均為 0. lml/10g體重，每天給藥一次，連給7天，末次給藥后1. 5小時，眼內眥取血，分離血清。按 照試劑盒說明書輸入參數，用全自動生化分析儀測血清葡萄糖。與模型對照組比較，空腹血 糖值降低有顯著性意義，判定受試藥物具有降低血糖作用。結果，木姜葉柯高、中劑量組和優降糖組的血糖均低于模型對照組，組間差異具有 顯著性意義(表1)。提示，提取物具有降低血糖作用。表1提取物對四氧嘧啶型高血糖小鼠空腹血糖的影響(χ士S) 注*P< 0. 05，**P < 0. 01，***P < 0. 001，與模型對照組比較，下同2對高血糖小鼠糖耐量的影響小鼠禁食24小時iv給予四氧嘧啶，造高血糖模 型，造模型成功后分組方法同2. 1，分組后各組小鼠禁食3 5小時，然后提取物和優降糖組 分別ig給予不同劑量的提取物和優降糖，模型對照組給予蒸餾水，20分鐘后，各組ig給予 葡萄糖溶液2. Og/kg。給葡萄糖溶液后測定0、0.5、2小時的血糖值，計算各個動物血糖曲線 下面積(=0. 25X (0小時血糖值+4X0. 5小時血糖值+3 X 2小時血糖值)。與模型對照組 比較，如果血糖曲線下面積降低有顯著性意義，判定受試藥物具有提高糖耐量作用。結果，木姜葉柯高、中劑量組和優降糖組的血糖曲線下面積均低于模型對照組，組 間差異具有顯著性意義(表2)。提示，提取物具有提高小鼠糖耐量作用。表2提取物對四氧嘧啶型高血糖小鼠糖耐量的影響(χ士S) 3對鏈脲菌素誘發大鼠高血糖的影響。取雄性大鼠60只，留10只作空白對照組， 其余iv鏈脲菌素80mg/kg體重造高血糖模型，7天后測空腹血糖值。選取空腹血糖值在 12. Ommol/L以上的大鼠50只，按血糖水平均勻分為5組模型對照組、優降糖對照組、提取 物低劑量、中劑量和高劑量組，每組10鼠。除空白對照組和模型對照組ig蒸餾水外，其余4 個給藥組動物按體重分別給優降糖0. 15g/kg、提取物0. lg、0. 2和0. 4g/kg。給藥容積均為 1. Oml/lOOg體重，每天給藥一次，連給7天，末次給藥后1. 5小時，眼內眥取血，分離血清。 按照試劑盒說明書輸入參數，用全自動生化分析儀測血清葡萄糖。與模型對照組比較，空腹血糖值降低有顯著性意義的，判定受試藥物具有降低血糖作用。結果，木姜葉柯高、中劑量組和優降糖組的血糖均低于模型對照組，組間差異具有 顯著性意義(表3)，提示，提取物具有降低血糖作用。表3提取物對鏈脲菌素型高血糖大鼠空腹血糖的影響(χ士S) 4對高血糖大鼠糖耐量的影響大鼠禁食24小時給予鏈脲菌素80mg/kg靜脈注射 造模，造模型成功后分組方法同2. 3，分組后各組大鼠禁食3 5小時，然后優降糖和提取 物組分別ig給予不同劑量的提取物和優降糖，空白對照和模型對照組給予蒸餾水，20分鐘 后，各組灌胃給予葡萄糖溶液2. 0g/kgo給葡萄糖溶液后測定0、0. 5、2小時的血糖值，計算 各個動物血糖曲線下面積(=0. 25X (0小時血糖值+4X0. 5小時血糖值+3X2小時血糖 值)。與模型對照組比較，如果血糖曲線下面積降低有顯著性意義，判定受試藥物具有提高 糖耐量作用。結果，木姜葉柯高、中劑量組和優降糖組的血糖曲線下面積均低于模型對照組，組 間差異具有顯著性意義(表4)。提示，提取物具有提高大鼠糖耐量作用。表4提取物對鏈脲菌素型高血糖大鼠糖耐量的影響(χ士S) 臨床試驗對象選擇年齡在45 75歲、非胰島素依賴型糖尿病20例。各病例均未用過胰 島素。血糖分別在llmmol/L-28mm0l/L。男10例，女10例，病程最長者12年，最短者2年，均有典型的“三多”表現，血糖最高者28mmol/L 5例。全部病例無嚴重心、肝、腎并發癥，且 一個月內無酮癥酸中毒表現。診斷標準參照衛生部《中藥新藥治療消渴癥的臨床研究指導原則》進行。觀察方法每個病人于用藥前測定空腹血糖值，然后給予木姜葉柯膠囊口服，每次 3粒，每天3次，用藥1周和1個月后，復查血糖，并記錄其他癥狀體征(包括多飲、多食、多 尿、消瘦、乏力等)。療效標準參照衛生部1993年制訂的《中藥新藥臨床研究指導原則》中的“治療 消渴癥(糖尿病)的臨床研究指導原則”所規定的療效評定標準。顯效癥狀消失、空腹血 糖降至7. 2mmol/L以下，餐后2小時血糖在8. 3mmol/L以下，24小時尿糖在10. Og以下，或 者空腹血糖較治療前下降55%以上；有效臨床癥狀明顯改善，空腹血糖降至8. 3mmol/L以 下，餐后2小時血糖在10. Ommol/L以下，或者空腹血糖較治療前下降35%以上；無效治療 后癥狀無明顯改善，血糖、尿糖下降未達到上述標準。治療結果20例結果表明木姜葉柯膠囊每次3粒，每天3次，連續1個月，有顯著 的降糖作用，未見任何毒副作用(表1)。表1木姜葉柯膠囊的降糖效果 根據療效評定標準評定，木姜葉柯膠囊療效為顯效10例(50% )，有效9例 (45% ),無效1例(5% )?？傆行?5%。典型病例例1，岑某，會計，女性，57歲。因口干多飲10年，加重1個月就診。證見口渴喜 飲，倦怠乏力、自汗盜汗、心煩盜汗，心煩失眠，尿黃便結，舌質紅，舌體胖、苔花剝，脈細數。 空腹血糖14. 2mmol/L，餐后2小時血糖20. lmmol/L,24小時尿糖定量19. 7g。中醫診斷消 渴病(氣陰兩虛證)。西醫診斷糖尿病。予以木姜葉柯膠囊服用。每次3粒，每天3次， 服藥1周后，口干多飲癥狀明顯減輕，空腹血糖11. 2mmol/L，餐后2小時血糖15. 6mmol/L, 24小時尿糖定量15g。服藥4周后，自覺癥狀基本消失，空腹血糖5. 5mmol/L，餐后2小時血 糖5. 6mmol/L,24小時尿糖定量1. 2g。療效評定顯效。例2，廖某，干部，男性，62歲。因口干多飲2年，加重2個月就診。證見口渴喜飲， 倦怠乏力、尿黃便結、自汗盜汗，舌質紅，苔花剝，脈細數。化驗檢查空腹血糖12. 2mmol/L, 餐后2小時血糖19. lmmol/L，24小時尿糖定量29.7g。中醫診斷消渴病(氣陰兩虛證)。 西醫診斷糖尿病(II型)。予以木姜葉柯膠囊，連續1個月。服藥1周后，口干多飲癥狀 明顯減輕，空腹血糖9. 2mmol/L,餐后2小時血糖10. 6mmol/L, 24小時尿糖定量6g。服藥4 周后，自覺癥狀基本消失，空腹血糖5. 2mmol/L，餐后2小時血糖6. 6mmol/L,24小時尿糖定量0.8g。療效評定顯效。例3，張某，技術員，男性，56歲。因多飲、多食、多尿2年余就診。主訴2年來多飲、 多食、多尿、口干咽燥，牙松，易餓，倦怠乏力。檢查，舌紅少津，舌體胖大，苔薄而白，脈細數； 化驗檢查空腹血糖13. 2mmol/L,餐后2小時血糖18. lmmol/L, 24小時尿糖定量17. 9g。中 醫診斷消渴病(氣陰兩虛證)。西醫診斷糖尿病(II型)。予以木姜葉柯膠囊，連續1個 月。服藥1周后，口干、多飲、多食、多尿癥狀明顯減輕，空腹血糖8. 2mmol/L，餐后2小時血 糖12.6mmol/L，24小時尿糖定量10g。服藥4周后，自覺癥狀基本消失，空腹血糖5. 9mmol/ L,餐后2小時血糖6. 6mmol/L, 24小時尿糖定量1. 0g。療效評定顯效。例4，覃某，技術工人，男性，66歲。因多飲、多食、多尿6年余就診。主訴6年來多 尿、多飲、多食，牙松，易餓，倦怠乏力。檢查，舌體胖大，舌紅少津，脈細數；化驗檢查空腹 血糖18. 2mmol/L，餐后2小時血糖22. lmmol/L，24小時尿糖定量27. 9g。中醫診斷消渴病 (氣陰兩虛證)。西醫診斷糖尿病(II型)。予以木姜葉柯膠囊，連續1個月。服藥1周 后，口干、多飲、多食、多尿癥狀明顯減輕，空腹血糖9. 2mmol/L，餐后2小時血糖14. 2mmol/ L，24小時尿糖定量12. 3g。服藥4周后，自覺癥狀基本消失，空腹血糖6. 3mmol/L,餐后2小 時血糖7.2mmol/L，24小時尿糖定量1.5g。療效評定顯效。例5，梁某，干部，男性，62歲。 因口干多飲10多年，加重1個月就診。證見口渴喜飲，多食而無力、多汗、心煩失眠，尿黃 便結，舌大、質紅，苔花，脈細。空腹血糖16. 5mmol/L，餐后2小時血糖23. lmmol/L，24小時 尿糖定量29. 2g。中醫診斷消渴病。西醫診斷糖尿病。予以木姜葉柯膠囊服用。每次3 粒，每天3次，服藥1周后，口干多飲癥狀明顯減輕，空腹血糖12. 2mmol/L，餐后2小時血糖 15. lmmol/L，24小時尿糖定量12g。服藥4周后，自覺癥狀基本消失，空腹血糖6. 5mmol/L， 餐后2小時血糖6. 6mmol/L, 24小時尿糖定量1. 6g。療效評定顯效。
權利要求
一種木姜葉柯總黃酮制備方法，包括提取、濃縮、真空干燥工序，其特征在于以乙醇為溶劑，對木姜葉柯干葉進行加熱回流提取，提取液經處理后再用聚酰胺樹脂吸附分離，最后再以乙醇為洗脫劑將聚酰胺樹脂上的木姜葉柯總黃酮洗脫。
2.根據權利要求1所述的一種木姜葉柯總黃酮制備方法，其特征在于(1)乙醇加熱回流提取a.木姜葉柯干葉，按重量加5-15倍量20-70%體積濃度的乙醇；b.回流提取1—4次，每次0.5—3小時；c.回流提取溫度為50-90°C；(2)聚酰胺樹脂法分離純化a.吸附上柱根皮苷與聚酰胺樹脂的質量體積比<23 1;上樣液根皮苷濃度為 6-8mg/mL ；上柱流速為 0. 5_2BV/h ；b.洗脫以乙醇為洗脫劑；洗脫劑用量為10-30BV；洗脫流速為l-3BV/h。
3.根據權利要求1所述的木姜葉柯總黃酮制備方法，其特征在于(1)乙醇加熱回流提取a.木姜葉柯干葉，按重量加10倍量70%體積濃度的乙醇；b.回流提取三次，每次2小時；c.回流提取溫度為80-90°C；(2)聚酰胺樹脂法分離純化a.吸附上柱根皮苷與聚酰胺樹脂質量體積比<23 1 ；上樣液根皮苷濃度為7mg/ mL ；上柱流速為lBV/h ；b.洗脫20%乙醇為洗脫劑；洗脫劑用量為20BV；洗脫流速為2BV/h。
4.根據權利要求1所述的一種木姜葉柯總黃酮制備方法，其特征在于聚酰胺樹脂規 格為80-100目。
5.木姜葉柯總黃酮在制備降血糖藥品或保健食品方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種以植物木姜葉柯為原料提取的木姜葉柯總黃酮，開發一種降血糖的新藥，提供了一種制備木姜葉柯總黃酮的方法，用本發明的方法獲得的木姜葉柯總黃酮的純度可達80％以上，根皮苷含量達65％以上，工藝簡單，耗能低，工藝條件合理穩定可行。用木姜葉柯總黃酮，開發的降血糖膠囊能夠給糖尿病人提供了一種方便，容易接受和能長期服用的口服降糖制劑。
文檔編號A61K36/185GK101904882SQ20101023840
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者曾憲彪, 李茂 , 蔣珍藕, 邱宏聰, 韋寶偉 申請人:廣西壯族自治區中醫藥研究院