本發明涉及一種通過組織培養的技術再生的方法，特別是涉及一種用于冰菜的通過組織培養的技術再生的方法。
背景技術：
隨著生物科學的發展和世界耕地及林地等鹽漬化程度的日益加重，引進耐鹽品種和提高植物耐鹽性的研究越來越受到重視，冰菜汁液中含有一定的鹽分，在鹽堿地改良、食用等方面具有較高的應用價值。
目前冰菜大規模生產中，培養基質中的含鹽量不易控制，且采用常規的種子和莖段組織培養的方法進行培養，效果并不理想，或者是所得植株不夠健壯，或者是長勢不佳，培育出的冰菜口感也不好。
技術實現要素：
本發明是為了解決的以上技術問題，而提供的一種冰菜種子和莖段組織培養的方法，本發明的冰菜種子組織培養的方法出芽率高、長勢好，本發明的冰菜莖段組織培養的方法得到的冰菜株高和鮮重均顯著高于常規方法。本發明通過在培養基中加入鹽溶液的培養方法，得到在較高含鹽量(0.9％)的條件下生長良好的冰菜組培苗，并將其應用于耐鹽生產。
本發明涉及一種冰菜種子組織培養的方法，所述方法包括以下步驟：
一、培養基的配制：調整MS培養基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養基中加入NaCl，并調整pH值為5.8，得到冰菜培養基；
二、種子的處理：將冰菜種子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐溫80(表面活性劑)，充分震蕩(5min)；然后用水沖洗冰菜種子5遍，瀝干水；在超凈工作臺中，用75％的酒精浸泡振蕩30s，用無菌水沖洗1次；用10％的次氯酸鈉溶液浸泡振蕩15min后，用無菌水沖洗4-5次；取出冰菜種子放入帶有無菌濾紙的培養皿中，吸干水分；
三、接種、培養：取步驟二處理得到的冰菜種子置于步驟一制得的培養基上，培養溫度為25～30℃；
其中，步驟一的冰菜培養基中蔗糖的質量分數為2％；瓊脂的質量分數為0.75％；NaCl的質量分數為0.9～1％。
優選地，所述步驟三中，培養過程中冰菜種子出芽前為避光，出芽后光照強度為2000-3000Lx，光照周期12h/12h。
優選地，所述步驟三中，接種量為每瓶6粒冰菜種子。
本發明還涉及一種冰菜莖段組織培養的方法，所述方法包括以下步驟：
一、培養基的配制：調整MS培養基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養基中加入NaCl，并調整pH值為5.8，得到冰菜培養基；
二、接種材料的制備：取冰菜種子接種于MS培養基中，培養42天，獲得組培苗，從組培苗上切取長1～2cm的帶葉片莖段，即為接種材料；
三、接種、培養：取步驟二得到的接種材料置于步驟一制得的培養基上，培養溫度為25～30℃，光照強度為2000-3000Lx；
其中，步驟一的冰菜培養基中蔗糖的質量分數為2％；瓊脂的質量分數為0.75％；NaCl的質量分數為0.9～1％。
優選地，所述步驟三中，光照周期12h/12h。
優選地，所述步驟三中，接種量為每瓶2個接種材料。
本發明的冰菜種子和莖段組織培養的方法與現有技術不同之處在于：
1.本發明的冰菜種子培養的方法出芽率高、長勢好，本發明的冰菜莖段組織培養的方法得到的冰菜株高和鮮重均顯著高于常規方法。本發明通過在培養基中加入鹽溶液的培養方法，得到在較高含鹽量(0.9％)的條件下生長良好的冰菜組培苗，并將其應用于耐鹽生產
2.本發明的方法培養得到的冰菜帶有大量冰晶，略帶咸味；移栽后產量高。
3.本發明的方法簡單，易操作掌握，效果顯著，具有很好的應用前景。
具體實施方式
通過以下實施例和驗證試驗對本發明的冰菜種子和莖段組織培養的方法作進一步的說明。
實施例1
本實施例的冰菜種子組織培養的方法，所述方法包括以下步驟：
一、培養基的配制：調整MS培養基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養基中加入NaCl，并調整pH值為5.8，得到冰菜培養基；
二、種子的處理：將冰菜種子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐溫80(表面活性劑)，充分震蕩(5min)；然后用水沖洗冰菜種子5遍，瀝干水；在超凈工作臺中，用75％的酒精浸泡振蕩30s，用無菌水沖洗1次；用10％的次氯酸鈉溶液浸泡振蕩15min后，用無菌水沖洗4-5次；取出冰菜種子放入帶有無菌濾紙的培養皿中，吸干水分；
三、接種、培養：取步驟二處理得到的冰菜種子置于步驟一制得的培養基上，接種量為每瓶6粒冰菜種子，培養溫度為25℃，避光培養1天，冰菜種子出芽；然后調整光照強度為2000Lx，光照周期12h/12h，繼續培養41天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長健壯的冰菜組培苗；
其中，步驟一的冰菜培養基中蔗糖的質量分數為2％；瓊脂的質量分數為0.75％；NaCl的質量分數為0.9％。
實施例2
本實施例的冰菜種子組織培養的方法，所述方法包括以下步驟：
一、培養基的配制：調整MS培養基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養基中加入NaCl，并調整pH值為5.8，得到冰菜培養基；
二、種子的處理：將冰菜種子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐溫80(表面活性劑)，充分震蕩(5min)；然后用水沖洗冰菜種子5遍，瀝干水；在超凈工作臺中，用75％的酒精浸泡振蕩30s，用無菌水沖洗1次；用10％的次氯酸鈉溶液浸泡振蕩15min后，用無菌水沖洗4-5次；取出冰菜種子放入帶有無菌濾紙的培養皿中，吸干水分；
三、接種、培養：取步驟二處理得到的冰菜種子置于步驟一制得的培養基上，接種量為每瓶6粒冰菜種子，培養溫度為28℃，避光培養1天，冰菜種子出芽；然后調整光照強度為3000Lx，光照周期12h/12h，繼續培養41天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長健壯的冰菜幼苗；
其中，步驟一的冰菜培養基中蔗糖的質量分數為2％；瓊脂的質量分數為0.75％；NaCl的質量分數為1％。
實施例3
本實施例的冰菜種子組織培養的方法，所述方法包括以下步驟：
一、培養基的配制：調整MS培養基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養基中加入NaCl，并調整pH值為5.8，得到冰菜培養基；
二、種子的處理：將冰菜種子放入三角瓶中，加入40mL水和2滴吐溫80(表面活性劑)，充分震蕩(5min)；然后用水沖洗冰菜種子5遍，瀝干水；在超凈工作臺中，用75％的酒精浸泡振蕩30s，用無菌水沖洗1次；用10％的次氯酸鈉溶液浸泡振蕩15min后，用無菌水沖洗4-5次；取出冰菜種子放入帶有無菌濾紙的培養皿中，吸干水分；
三、接種、培養：取步驟二處理得到的冰菜種子置于步驟一制得的培養基上，接種量為每瓶6粒冰菜種子，培養溫度為30℃，避光培養1天，冰菜種子出芽；然后調整光照強度為2500Lx，光照周期12h/12h，繼續培養41天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長健壯的冰菜組培苗；
其中，步驟一的冰菜培養基中蔗糖的質量分數為2％；瓊脂的質量分數為0.75％；NaCl的質量分數為0.95％。
對實施例1-3中得到的冰菜幼苗進行測定，所得結果如表1所示。
接種7天后統計發芽率和死亡率，NaCl脅迫42d后，分別統計各個處理的株高(去掉根系從莖基部到生長點的長度)和鮮重(將植株去掉根系，稱量鮮重)。
出芽率(％)＝出芽株數/接種株數×100％
成活率(％)＝成活株數/接種株數×100％
株高＝總高度/接種株數，取各瓶平均數
鮮重＝總的鮮重/接種株數，取各瓶平均數
表1實施例1-3中所得幼苗的出芽率、成活率、株高和鮮重
實施例4
本實施例的冰菜莖段組織培養的方法，所述方法包括以下步驟：
一、培養基的配制：調整MS培養基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養基中加入NaCl，并調整pH值為5.8，得到冰菜培養基；
二、接種材料的制備：取冰菜組織接種于MS培養基中，培養42天，獲得組培苗，從組培苗上切取長1～2cm的帶葉片莖段，即為接種材料；
三、接種、培養：取步驟二得到的接種材料置于步驟一制得的培養基上，接種量為每瓶2個接種材料，培養溫度為28℃，光照強度為2000Lx，光照周期12h/12h；培養42天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長健壯的冰菜組培苗；
其中，步驟一的冰菜培養基中蔗糖的質量分數為2％；瓊脂的質量分數為0.75％；NaCl的質量分數為0.9％。
實施例5
本實施例的冰菜莖段組織培養的方法，所述方法包括以下步驟：
一、培養基的配制：調整MS培養基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養基中加入NaCl，并調整pH值為5.8，得到冰菜培養基；
二、接種材料的制備：取冰菜組織接種于MS培養基中，培養42天，獲得組培苗，從組培苗上切取長1～2cm的帶葉片莖段，即為接種材料；
三、接種、培養：取步驟二得到的接種材料置于步驟一制得的培養基上，接種量為每瓶2個接種材料，培養溫度為30℃，光照強度為3000Lx，光照周期12h/12h；培養42天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長健壯的冰菜組培苗；
其中，步驟一的冰菜培養基中蔗糖的質量分數為2％；瓊脂的質量分數為0.75％；NaCl的質量分數為1％。
實施例6
本實施例的冰菜莖段組織培養的方法，所述方法包括以下步驟：
一、培養基的配制：調整MS培養基中蔗糖和瓊脂的濃度，然后向MS培養基中加入NaCl，并調整pH值為5.8，得到冰菜培養基；
二、接種材料的制備：取冰菜種子接種于MS培養基中，培養42天，獲得組培苗，從組培苗上切取長1～2cm的帶葉片莖段，即為接種材料；
三、接種、培養：取步驟二得到的接種材料置于步驟一制得的培養基上，接種量為每瓶2個接種材料，培養溫度為25℃，光照強度為2500Lx，光照周期12h/12h；培養42天，得到大型冰晶狀顆粒明顯，生長健壯的冰菜組培苗；
其中，步驟一的冰菜培養基中蔗糖的質量分數為2％；瓊脂的質量分數為0.75％；NaCl的質量分數為0.95％。
對實施例1-3中得到的冰菜組培苗進行測定，所得結果如表1所示。
NaCl脅迫培養結束后，分別統計各個處理的株高(去掉根系從莖基部到生長點的長度)和鮮重(將植株去掉根系，稱量鮮重)。
株高＝總高度/接種株數，取各瓶平均數
鮮重＝總的鮮重/接種株數，取各瓶平均數
表2實施例4-6中所得組培苗的株高和鮮重
驗證試驗1
分別將實施例1-3培養得到的冰菜幼苗和實施例4-6培養得到的冰菜組培苗在含0.9％鹽營養液中進行水培，并結合冰菜生長發育的特性，控制溫度、濕度、光照、pH值、EC值、鹽濃度等各項影響因子，具體按以下步驟進行。
移栽：采用海綿作為栽培基質。
提前一天準備兩塊育苗專用十字海綿(如無十字，可用剪刀按6cm×6cm剪出十字)，進行清洗，即將海綿放到加水的無孔育苗盤，反復擠壓后，更換新水，放置一夜，備用。
水培槽中加入營養液，水位離種植板約1cm的距離。半個小時后測電導度和pH值，調節Ec值為1200μs/cm左右，pH值在6.5-7.2之間(用硝酸和氫氧化鈉調節pH值)。
第二天用鑷子將組培苗插入海綿十字處，每十字處放1顆苗，帶海綿栽到種植板上，種植板上開直徑3cm的種植孔，孔距14cm，每孔栽一個苗，根系接觸到清水。
栽植后管理：
營養液的管理：緩苗后開始添加鹽溶液，鹽濃度為0.6％-0.9％，調好定時器，白天每隔50min供液1次，每次供液10min。每天要巡視系統水位。在定植緩苗后每周補充水槽里蒸發掉的水份和營養液，約一個月補充一次Na的水溶液。根據水槽中水量加入粗鹽或食鹽使營養液中NaCl濃度約為0.9％。
環境條件控制：氣溫白天控制在20-30℃，夜間15-18℃。高溫季節重點是遮陽、降溫。冬春季節白天氣溫保持在17-22℃，夜溫約15℃。營養液溫度15-22℃；濕度控制在70％-90％；光強控制在3 000-15000lx。
分栽：待植物長滿種植版，相互遮陰時分栽，隔一個種植孔取出一個苗，取出的苗移栽到新的育苗版上，增大植物的生長空間；及時摘掉病葉。
采收：定植30天后即可采收，在早晨溫度較低時先輕輕地摘下植株下部的大葉片，再采收側枝(要求嫩枝長15cm以上)，生長盛期每15d收獲1次，分別碼好放在包裝盒或筐內。
結果：
在含有0.9％NaCl溶液中，以上實施例1-6中培育得到的冰菜幼苗和組培苗成活率高，冰菜生長旺盛，冰晶明顯，口感好，產量高，具體數值如表3所示。
表3本發明培養得到幼苗移栽水培后的成活率和產量
通過以上驗證試驗可知，本發明方法培育得到的冰菜幼苗和冰菜組培苗在含鹽(NaCl)量0.9％的水溶液中生長健壯、產量高，所得冰菜的冰晶明顯、口感好；所述本發明培育得到的冰菜幼苗和冰菜組培苗耐鹽性強。
驗證試驗2
不同NaCl濃度脅迫下冰菜種子的出芽率和成活率
設置不同的NaCl濃度：0.3％(T1)、0.6％(T2)、0.9％(T3)、1.2％(T4)；驗證不同濃度的NaCl脅迫下冰菜種子的出芽率和成活率；其他參數與實施例1的方法相同。
冰菜種子用10％的次氯酸鈉溶液表面消毒15分鐘，效果很好，無污染，經觀察，接種第二天25瓶都有種子出芽，出芽率50-70％不等。第一周無死亡現象，出芽率和成活率見表1。第二周以后開始出現生長不均衡現象，個別苗生長緩慢，甚至黃化死亡，存活下來的苗生長健壯，葉片肥大，莖粗壯。每瓶存活數越少，存活的苗子越健壯。全部苗都存活的瓶苗相對細弱，葉片小。
表4不同NaCl脅迫冰菜的發芽率和成活率
注：與對照的差＝處理-對照
由表1可以看出只有NaCl濃度為0.6％(T2)出芽率和成活率超過對照，達到最高，其它處理均低于對照，NaCl濃度為1.2％(T4)出芽率最低；NaCl濃度為0.9％(T3)成活率與對照持平，而Nacl濃度為0.3％(T1)成活率最低。但成活下來的苗生長健壯。冰菜可以在NaCl濃度為0-1.2％范圍內生長，但達到1.2％時出芽率和成活率開始下降。
驗證試驗3
不同NaCl濃度脅迫下冰菜種子培養組胚苗的株高和鮮重
設置不同的NaCl濃度：0.3％(T1)、0.6％(T2)、0.9％(T3)、1.2％(T4)；驗證不同濃度的NaCl脅迫下組培苗的株高和鮮重；其他參數與實施例1的方法相同。
表5不同NaCl脅迫冰菜的株高和鮮重
注：與對照的差＝(處理-對照)/對照×100％
接種后第一周，對照植株最高，NaCl濃度越高，植株越矮。第一周株高Nacl濃度為1.2％(T4)與對照相差高達63.6％。經觀察子葉全部展開，但NaCl濃度越高，子葉越小。以后差異變小。至第六周，Nacl濃度為0.3％(T1)株高和鮮重最大，原因是T1瓶苗成活率低，生長空間大，生長健壯，單株株高和重量大。株高除T4外其它處理均高于對照，最高T1高出對照13.6％，T4株高和鮮重最小，較對照低27.1％。各處理單株鮮重均高于對照，T1最大，高于對照57.6％，其次T3高于對照52.9％。T4與對照差異最小，高于對照7.9％。
驗證試驗4
不同NaCl濃度脅迫下冰菜莖段培養組培苗的株高和鮮重
設置不同的NaCl濃度：0.3％(T1)、0.6％(T2)、0.9％(T3)、1.2％(T4)；驗證不同濃度的NaCl脅迫下冰菜莖段培養組培苗的株高和鮮重；其他參數與實施例4的方法相同。
表6 NaCl脅迫對冰菜株高和鮮重的影響
注：與對照的差＝(處理-對照)/對照×100％
莖段培養成活率均為100％，培養6周后，各處理株高和單株鮮重均高于對照，Nacl濃度為0.9％(T3)瓶苗株高和單株鮮重均最大，株高高出對照46.9％，單株鮮重高出對照90.8％。T1與對照相差最小，株高為4.9％，鮮重為0.7％。T2和T4與對照相差較小，株高分別為33.3％和46.9％；單株鮮重分別為27.7％和26.1％。
經觀察，T3的瓶苗冰晶最明顯，生長健壯。所有處理的瓶苗株高和單株鮮重均比對照大，生長健壯。說明冰菜不僅耐鹽，而且在培養基中適度添加Nacl溶液，有利于生長。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，本發明的保護范圍是由所附權利要求書限定的。本領域的技術人員在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式作出多種變更或修改，但這些變更和修改均落入本發明的保護范圍。