本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種珍稀蘭科名貴藥材鐵皮石斛蒴果及種子的長期保存方法。

背景技術：

鐵皮石斛是蘭科(Orchidaceae)石斛屬多年生附生蘭。《中國藥典》(2010版)將鐵皮石斛作為單列藥材品種，明確其基源植物為蘭科植物鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，其干燥莖或新鮮莖藥用(國家藥典委員會，2010)。鐵皮石斛含有多糖、芪類、生物堿、氨基酸和微量元素等多種成分，具有增強免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖和養陰生津等多種生物活性(李玲等，2011)。

目前關于鐵皮石斛組織培養所采用的外植體主要是種子、莖段、根尖、幼芽、葉片等，通過上述外植體先誘導原球莖，然后生產組培苗的方式居多，占76％以上(范俊安等，1999；杜剛等，2007)，而這些原球莖的獲得有80％是以種子為外植體誘導的(金銀兵，2009；李榮珍，2012)。所以真正在生產上大規模使用的外植體是種子，相比其他的繁殖方式，種胚產生原球莖的增殖途徑是叢芽增殖方式的數十倍，對鐵皮石斛的快速繁殖具有重要意義(蔣慧萍，2009；馮耀文等，2013)。通過莖段、根尖、葉片誘導類原球莖的方式，不適合大規模的生產，類原球莖繁殖多代后，分化成苗的潛力降低。

采用種子作為外植體，從種子播種到形成可以移栽的幼苗需要6-8個月的時間。鐵皮石斛果實的成熟期一般在10月下旬至11月上旬。鐵皮石斛蒴果以成熟未開裂前采收最好，種子易采收及消毒，且發芽率高。若等到果實成熟開裂時采收，不僅種子難以收集與消毒，且種子發芽率降低。將果實放入4℃的冰箱中保存，保存時間也不能超過1個月，否則易發霉腐爛或降低發芽率(蔣慧萍，2009)。因此在進行工廠化生產時，如何保存果實或種子，如何根據供苗時間自主地選擇種子的播種時間就顯得格外重要。關于鐵皮石斛種子的保存，僅見張治國等(1997)、王君暉等(1999)的干凍法保存，即通過硅膠脫水后的種子，不經過玻璃化保護劑PVS2處理，在液氮中保存24小時或1個月，種子萌發率為92％-95％，與未經冷凍的種子的萌發率一致。在石斛屬的其他種類中，Renato等(2014)報道了石斛雜交種“Dong Yai”的成熟種子放入PVS2溶液中處理1-3小時，再投入液氮中保存60分鐘后取出，進行種子萌發實驗。結果表明種子的萌發率最高為58％，流式細胞分析表明冷凍保存的種子萌發產生的幼苗沒有發生染色體的變化。

上述研究中，種子保存時間最長的為1個月，并且要使用液氮，對于一般的企業操作起來不是很方便，因此研究經濟、有效的鐵皮石斛果實或種子的保存方法尤為重要，這不僅對于種質資源的保存有重要意義，而且可以做到取材不受季節影響，有利于工廠化種苗的生產。

上文中涉及的參考文獻如下：

1、杜剛,楊海英,朱紹林等.鐵皮石斛種子誘導成苗試驗.中藥材,2007,30(10):1207-1208；

2、范俊安,張艷,李泉森,等.鐵皮石斛種子培養試驗研究.重慶中草藥研究,1999,(40):48-49；

3、國家藥典委員會.中華人們共和共藥典.北京:中國醫藥科技出版社,2010；

4、馮耀文,李澤生,耿秀英,等.鐵皮石斛組培苗工廠化生產技術關鍵問題探討.熱帶農業科技,2013,36(3):30-32；

5、蔣慧萍,庾韋花,張向軍,等.鐵皮石斛種子胚培養的產業化研究.江蘇農業科學,2009,(2):72-75；

6、金銀兵.鐵皮石斛的生物學特性與開花授粉技術研究.安徽農業科學,2009,37(11):5280-5282；

7、李玲,鄧曉蘭,趙興兵,等.鐵皮石斛化學成分及藥理作用研究進展.腫瘤藥學,2011,1(2):90-94；

8、李榮珍.鐵皮石斛種子試管苗的快速繁殖研究.廣東農業科學,2012,(14):22-24.

王君暉,張毅翔,劉峰,等.鐵皮石斛種子、原球莖和類原球莖體的超低溫保存研究.園藝學報,1999,26(1):59-61；

9、張治國,劉驊,夏志俊,等.鐵皮石斛種子的超低溫保存研究.安徽中醫學院學報,1997,16(5):40-41；

10、Galdiano Jr R F,de Macedo Lemos E G,de Faria R T,et al.Seedling development and evaluation of genetic stability of cryopreserved Dendrobium hybrid mature seeds.Applied Biochemistry and Biotechnology,2014,172(5):2521-2529.(玻璃化凍存的石斛屬雜交成熟種子的幼苗發育及遺傳穩定性評價.應用生物化學和生物技術,2014,172(5):2521-2529.)。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種鐵皮石斛蒴果/種子的長期保存方法，本發明利用現代生物技術，提高鐵皮石斛蒴果或種子的保存時間，既能滿足長期保存(可保存至少半年～1年)的需要，同時又能保證種子具有高的萌發率，使人們能夠根據供苗時間自主地選擇種子的播種時間。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種鐵皮石斛蒴果/種子的長期保存方法，將收獲的鐵皮石斛果實分成完整果實(未開裂果實)和開裂果實，對完整果實依次進行以下步驟：

1.1、果實消毒：

完整果實依次經酒精表面擦拭、酒精浸泡、無菌水沖洗、升汞滅菌、無菌水沖洗后，用無菌濾紙上吸干表面水分；

1.2、果實的脫水處理：

用濾紙包裹步驟1.1所得的無菌蒴果后一起放入密封袋中，并且在密封袋內放入用于吸濕的硅膠；每隔2～3天更換一次硅膠，直至硅膠的藍色不再發生變化為止，得脫水后蒴果；

1.3、對步驟1.2所得的脫水后蒴果進行水分含量的檢測；

當脫水后蒴果中的種子的含水量≤10％時，進行下述步驟1.4；

當脫水后蒴果中的種子的含水量＞10％時，返回至步驟1.2繼續進行脫水處理；

1.4、將被濾紙包裹的果實放入密封袋中，且在密封袋中裝有硅膠；所述脫水后蒴果的個數與密封袋中的硅膠的重量比為30個/100～150g；

將至少一個的密封袋放入密封容器中，且在密封容器裝有硅膠；所述脫水后蒴果的個數與密封容器中的硅膠的重量比為60個/200～250g；

將整個密封容器置于-80℃～-20℃保存。

作為本發明的鐵皮石斛蒴果/種子的長期保存方法的改進：

所述步驟1.1為：

將完整果實先用體積濃度為65～75％(較佳為70％)的酒精進行表面擦拭，然后在無菌環境(例如為超凈工作臺)中，用體積濃度為65～75％(較佳為70％)的酒精浸泡上述擦拭后果實，浸泡時間為30～60秒；接著用無菌水沖洗，再用質量濃度0.1％升汞(100ml上述升汞中加3～5滴吐溫)滅菌10～12分鐘，無菌水沖洗干凈后，置于無菌濾紙上吸干水分。

作為本發明的鐵皮石斛蒴果/種子的長期保存方法的改進：

所述步驟1.2為：

將無菌蒴果每30～50個放入長、寬各為30cm的濾紙(預先高壓滅菌，烘干備用)內，用棉紗線捆好，形成濾紙袋，將濾紙袋放入自封袋中，在自封袋中放入硅膠，使硅膠蓋住濾紙袋，室溫放置；前3天每天更換一次硅膠，第4天起每2天更換一次，直至硅膠的藍色不再發生變化為止(此過程一般需要7-10天)。

作為本發明的鐵皮石斛蒴果/種子的長期保存方法的改進：

對開裂果實依次進行以下步驟：

2.1、果實的消毒：

將開裂果實用體積濃度為65～75％(較佳為70％)的酒精進行表面擦拭；

2.2、果實的脫水處理：

在平底容器中加入硅膠，在硅膠上鋪一層濾紙，切開步驟1)所得的消毒后果實，倒出果實內的種子并平鋪在濾紙上，將平底容器密封；每2～3天更換一次硅膠；直至硅膠的藍色不再發生變化為止，得脫水后種子；

2.3、對步驟2.2所得的脫水后種子進行水分含量的檢測；

當脫水后種子的含水量≤10％時，進行下述步驟2.4；

當脫水后種子的含水量＞10％時，返回至步驟2.2繼續進行脫水處理；

2.4、將脫水后種子裝入密封管(例如為離心管)，直至占密封管容積的50±5％，在密封管內的剩下空間放置被濾紙包裹的硅膠從而實現密封填充；

然后將至少一個的整個密封管裝入內設硅膠的密封袋中，所述脫水后種子與密封袋中的硅膠的用量比為1g/20-50g；

最終將整個密封袋置于-80℃～-20℃保存。

備注說明：需要使用種子時，用含0.5％-0.75％有效氯的次氯酸鈉溶液(每100ml內加2～3滴洗潔精)消毒滅菌10-15分鐘，然后將種子連同滅菌劑一起倒入裝有無菌濾紙的漏斗中(預先高壓滅菌，烘干后備用)，用無菌水充分沖洗至沒有次氯酸鈉味道。再將濾紙撕成1-2厘米的濾紙片，將有種子的一面貼在培養基上培養。

作為本發明的鐵皮石斛蒴果/種子的長期保存方法的改進：所述步驟2.2中，種子為單層平鋪在濾紙上。

在本發明中，鐵皮石斛蒴果在10月下旬或11月上旬采收，即，鐵皮石斛果實成熟尚未開裂時收獲果實，如果部分果實開裂，也及時收獲；然后經挑選后分成完整果實、開裂果實這2類，分別采用各自不同的保存方法。

種子含水量的測定(此為常規技術)：超凈工作臺上，打開濾紙包裝，隨機抽取一個果實，剝開果皮，將種子取出，稱重，放入105℃烘干的放在干燥器中冷卻的稱量瓶(稱量瓶重量要預先稱量)中進行稱重，然后將稱量瓶放入105℃烘箱中烘至重量不再減少時，測定種子中的含水量，種子的含水量％＝[(烘干前種子和稱量瓶的重量-烘干后種子和稱量瓶的重量)/烘干前種子的重量]*100。

在本發明中，種子活力的測定和種子萌發實驗：分別于保存6個月和1年的蒴果或種子進行種子活力測定和萌發實驗。

蒴果內種子活力的測定：

蒴果由于是無菌的，直接在超凈臺上取出蒴果，放入無菌培養皿中，切去頭部，將部分種子抖落在鋪有濾紙的9厘米培養皿內，上面再蓋一層濾紙，然后加入無菌水，蓋上皿蓋，放在25℃的培養室中，吸漲培養16小時后，將無菌水去掉，加入0.5％TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)法(pH 6.7)放置于30℃的搖床中暗培養24小時后，置于生物顯微鏡下檢查種子活力。用移液槍吸取混勻的種子置于載玻片上，隨機選擇5個視野，進行統計。胚被染上紅色的種子為有生活力的種子。種子的生活力(％)＝(胚被染上紅色的種子/所檢測的種子數)*100。

種子的萌發培養：

將其余種子抖落在1/2MS+土豆80g/l+NAA 0.2mg/l+白砂糖25g/l的培養基中萌發。

開裂的蒴果的種子先滅菌：將種子取出部分，放入15毫升離心管，種子量約到離心管1毫升刻度處，加入有效氯濃度為0.5％-0.75％的次氯酸鈉溶液(內加2-3滴洗潔精)9-10毫升，蓋上試管蓋，上下顛倒搖晃滅菌10-15分鐘，然后將種子連同滅菌劑一起倒入裝有無菌濾紙的漏斗中，用無菌水充分沖洗，將濾紙放入12厘米滅菌的培養皿中，用刀和鑷子配合，將濾紙撕成1-2厘米的濾紙片，取一片帶有種子的濾紙放入9厘米的帶有濾紙的培養皿中，在濾紙片上再覆蓋一層濾紙，然后加入無菌水，吸漲培養16小時后，然后同上述種子活力的測定。

種子萌發：將其它濾紙片有種子的一面在培養基表面上貼，種子就轉移到培養基表面，然后將濾紙片取出。

常規技術中，新鮮果實采收后放4℃冰箱，只能保存一個月，在保存的過程中，容易發霉，導致種子的損失；蒴果容易開裂，造成消毒的不徹底以及隨保存時間的延長，種子的活力降低等不利因素。而本發明的鐵皮石斛成熟未開裂的果實先消毒再干燥后冷凍保存的方式，能延長種子的保存時間，并且能維持種子高的活力和萌發率。

本發明的從開裂果實(種子發育較老)中取出種子，干燥后再冷凍保存。實際需要使用種子時，用有效氯濃度為0.5％-0.75％的次氯酸鈉溶液消毒后接種，既可以消毒種子，又可以腐蝕種皮，促進種子的萌發。常規的果實室溫干燥，再冷凍保存的方式，容易導致果實的開裂，造成日后培養時消毒的困難，并且果皮與種子混雜在一起，也容易造成消毒的不徹底，導致種子培養時的污染。

本發明的優點：操作簡單、方便，所需要的儀器設備簡單；保存時間長，種子活力高，萌發率高。本發明的研究結果有效地解決了鐵皮石斛果實和種子的長期保存，使企業能夠根據自身的發展需要，隨時取材播種，不受季節的影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。

實施例1、鐵皮石斛蒴果的保存方法，鐵皮石斛蒴果在10月下旬采收，選擇未開裂的果實(即，完整果實)，依次進行以下步驟：

1)、果實消毒：

蘸取70％(體積％)酒精棉球進行果實表面擦拭，然后轉移到超凈工作臺，將果實用70％的酒精浸泡30秒，無菌水沖洗1次，然后用含0.1％(質量％)升汞(每100mL0.1％升汞加3～5滴吐溫20)滅菌10min，無菌水沖洗干凈后，置于無菌濾紙上吸干水分。

吐溫20，即，TWEEN-20(上海生工生物工程有限公司，AMRESCO分裝)。

2)、果實的脫水處理：

將步驟1)所得的無菌蒴果每30個放入滅過菌的正方形濾紙(30厘米*30厘米)中包好，用棉紗線扎緊從而形成濾紙袋，然后放入自封袋中，在自封袋中放入硅膠(約250g)，使硅膠蓋住濾紙袋，室溫放置。前3天每天更換一次硅膠，第4天起每2天更換一次，第7天時(此時硅膠的藍色不再發生變化)在超凈工作臺上對脫水后蒴果進行水分含量的檢測；

3)、打開濾紙袋，隨機抽取一個果實，剝開果皮，將種子取出，進行種子含水量的測定。種子的含水量％＝[(烘干前種子和稱量瓶的重量-烘干后種子和稱量瓶的重量)/烘干前種子的重量]*100。經過7天的硅膠干燥，種子的含水量為8.3％。

4)、將裝有30個果實的濾紙包放入加有150g硅膠的自封袋中，將2個自封袋放入塑料飯盒中，在飯盒的四周撒入一些硅膠(250g)，蓋上盒蓋密封后，置于-80℃或-20℃的冰箱中保存備用。

保存6個月后，-80℃冰箱中保存的種子活力為97.6％，-20℃冰箱保存的種子活力平均為93.5％；種子萌發率-80℃冰箱中保存的種子萌發率平均為93.6％，-20℃冰箱保存的種子萌發率平均為91.8％。

保存1年后，-80℃冰箱中保存的種子活力為96.8％，-20℃冰箱保存的種子活力平均為92.0％；種子萌發率-80℃冰箱中保存的種子萌發率平均為94.3％，-20℃冰箱保存的種子萌發率平均為90.4％。

實施例2、一種鐵皮石斛種子的保存方法，鐵皮石斛蒴果在10月下旬采收，從收獲的鐵皮石斛果實挑出開裂果實；對開裂果實依次進行以下步驟：

1)、果實的消毒：

將開裂果實用70％(體積％)的酒精進行表面擦拭；

2)、果實的脫水處理：

在直徑15厘米的大培養皿內倒入100克的硅膠，在硅膠上面鋪一層12厘米大小的方形濾紙，將上述表面擦拭消毒后的果實切開，將種子抖落在培養皿的濾紙上，直至整個濾紙上有薄薄的一層種子。然后用保鮮膜將培養皿的上下蓋接觸處密封好，置于室溫下，每2天更換一次硅膠，4天后，結束此脫水處理(此時，硅膠不再變色)。

3)、4天后，隨機抽取少量種子進行含水量的測定，種子的平均含水量為8.2％。

4)、將干燥好的種子分裝到15毫升的離心管中，裝入總容量的一半(種子的重量約在1.01g～1.15g)，然后將9cm大小的濾紙裝入4g左右的硅膠，用細線綁成濾紙包，塞入離心管中，從而將離心管的剩余空間密封。將5個離心管置于自封袋中，自封袋中加入約200g的硅膠，置于-80℃或-20℃的冰箱中保存。

保存6個月后，分別將-80℃和-20℃冰箱中存放的種子取出部分，放入15毫升離心管，種子量約到離心管1毫升刻度處，加入有效氯濃度為0.5％的次氯酸鈉(內加2～3滴洗潔精)溶液10毫升，蓋上試管蓋，上下顛倒搖晃滅菌15分鐘，然后將種子連同滅菌劑一起倒入裝有無菌濾紙的漏斗中，用無菌水充分沖洗，將濾紙取下放入12厘米滅過菌的培養皿中，用刀片和鑷子將濾紙撕成1-2厘米的濾紙片，一張濾紙片加入蒸餾水吸漲培養16小時后進行種子活力測定，其余的濾紙片接入培養基中進行萌發實驗。

結果保存6個月后，-80℃冰箱中保存的種子活力為94.7％，-20℃冰箱保存的種子活力平均為91.6％；種子萌發率-80℃冰箱中保存的種子萌發率平均為91.2％，-20℃冰箱保存的種子萌發率平均為88.5％。保存1年后，-80℃冰箱中保存的種子活力為93.5％，-20℃冰箱保存的種子活力平均為92.5％；種子萌發率-80℃冰箱中保存的種子萌發率平均為90％，-20℃冰箱保存的種子萌發率平均為85.3％。

對比例1-1、相對于實施例1而言，減少脫水處理的時間(即，脫水時間由7天改成4天)，第4天時進行種子的含水量測定，此時種子的含水量維持在15％，其余等同于實施例1。

對比例1-2、將實施例1的步驟4)改成以下內容：將裝有30個果實的濾紙包直接放入塑料飯盒中，蓋上盒蓋密封后，置于-80℃或-20℃的冰箱中保存備用。即，取消了自封袋(及其自封袋中的硅膠)、塑料飯盒中的硅膠的使用，其余等同于實施例1。

對比例1-3、將實施例1的步驟4)改為：將裝有30個果實的濾紙包和硅膠400g直接混合后放入塑料飯盒中；其余等同于實施例1。

將上述對比例1-1～對比例1-3所得的種子，按照實施例1所述方法進行檢測，不同保存溫度、時間下對應的種子活力、萌發率如下表1所述。

表1、不開裂蒴果不同對比例處理的種子活力和萌發率比較

對比例2-1、相對于實施例2而言，減少脫水處理的時間，2天后進行含水量的測定，從而控制種子的含水量為15％。其余等同于實施例2。

對比例2-2、取消實施例2步驟4)中的自封袋中的硅膠的使用，其余等同于實施例2。

將上述對比例2-1～對比例2-2所得的種子，按照實施例2所述的方法進行檢測，不同保存溫度、時間下對應的種子活力、萌發率如下表2所述。

表2、開裂蒴果不同對比例處理的種子活力和萌發率比較

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。