本發(fā)明涉及一種利用秋水仙堿誘變選育桑樹品種的方法，屬于植物品種培育技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

桑(學(xué)名：Morus alba L.)：桑科桑屬，落葉喬木或灌木，高可達(dá)15米。樹體富含乳漿，樹皮黃褐色。葉卵形至廣卵形，葉端尖，葉基圓形或淺心臟形，邊緣有粗鋸齒，有時有不規(guī)則的分裂。葉面無毛，有光澤，葉背脈上有疏毛。雌雄異株，5月開花，葇荑花序。果熟期6～7月，聚花果卵圓形或圓柱形，黑紫色或白色。喜光，幼時稍耐陰。喜溫暖濕潤氣候，耐寒。耐干旱，耐水濕能力極強(qiáng)。原產(chǎn)中國中部和北部。中國東北至西南各省區(qū)，西北直至新疆均有栽培。朝鮮、日本、蒙古、中亞各國、俄羅斯、歐洲等地以及印度、越南亦均有栽培。葉為桑蠶飼料。木材可制器具，枝條可編籮筐，桑皮可作造紙原料，桑椹可供食用、釀酒，葉、果和根皮可入藥。

選育桑樹品種的方法中，以化學(xué)誘變法的突變率高，選育周期短等優(yōu)勢，成為選育桑樹品種的主要手段。中國專利文獻(xiàn)CN105123511A(申請?zhí)?01510562489.6)公開了一種化學(xué)誘變選育桑樹多倍體的方法，用0.4％秋水仙堿(colchicine)加3％二甲亞砜(DMSO)混合液作為誘變劑，對2年以上的生長旺盛、生長點飽滿、無病蟲害的成齡桑樹新梢進(jìn)行化學(xué)誘變處理，通過世代選擇而獲得遺傳穩(wěn)定的具有優(yōu)良或是特殊生物學(xué)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀的桑樹新品系。本方法能夠獲得較高頻率的多倍體突變植株，且變異譜較廣，可獲得遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良桑樹新品系，有利于桑樹品種的改良；同時可以根據(jù)蠶桑生產(chǎn)實際需求定向選擇親本，進(jìn)而獲得在生物學(xué)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀更為優(yōu)良的新品種，以適應(yīng)多元化和全年多次養(yǎng)蠶生產(chǎn)對桑品種的要求，提高了蠶桑業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

但上述方法存在正向突變率低、致死率高等缺陷，從而導(dǎo)致篩選率低的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用秋水仙堿誘變選育桑樹品種的方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種利用秋水仙堿誘變選育桑樹品種的方法，步驟如下：

(1)扦插苗苗高50cm以上，幼齡桑、成齡桑春伐或夏伐后長出的新梢，選取枝條健壯、頂芽飽滿、無病蟲害的頂芽，采用誘變劑處理頂芽，2～5天后重復(fù)處理一次，獲得誘變材料；

所述的誘變劑為含有質(zhì)量濃度為0.3～0.5％秋水仙堿和1.5～2.5mg/L 6-芐基嘌呤(6-BA)的乙醇溶液；

(2)將步驟(1)獲得的誘變材料培養(yǎng)15～20天后，選取變異條，經(jīng)染色體鑒定，確定染色體變異的材料，然后進(jìn)行誘導(dǎo)枝的繁育，經(jīng)性狀正突變篩選和遺傳穩(wěn)定篩選后，獲得新品種，嫁接擴(kuò)繁建立良種接穗園。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的新梢為開五葉后的新梢。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的誘變劑處理為將誘變劑注入頂芽的空隙，注射量為0.8～1.2ml。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中采用誘變劑處理頂芽，3天后重復(fù)處理一次。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中誘變劑為含有質(zhì)量濃度為0.4％秋水仙堿和2mg/L 6-芐基嘌呤的乙醇溶液。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，染色體鑒定采用去壁低滲法。去壁低滲法為植物染色體鑒定常規(guī)技術(shù)，可參見《蠶學(xué)通訊》1996年第一期，出版號ISSN:1006-0561，作者余茂德。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，性狀正突變篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：

①葉片，形狀及葉脈不紊亂、葉面積增加15％以上、厚度大于200μm；

②枝條上皮孔數(shù)為10～15個/cm²，皮孔大小為2～6mm；

③節(jié)間距小于4cm；

④誘導(dǎo)后枝條長至50cm以上時，枝條固定成穩(wěn)定的葉序；

⑤枝條較未誘導(dǎo)枝直徑長1～3mm。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，誘導(dǎo)枝的繁育為通過無性繁殖方式進(jìn)行。無性繁殖方式如嫁接、扦插等，可以繼承和保持親本性狀，不產(chǎn)生分離，再通過試驗鑒定比較分析等方法，確定其遺傳是否穩(wěn)定。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，遺傳穩(wěn)定篩選采用AMMI模型穩(wěn)定性分析方法。AMMI模型穩(wěn)定性分析方法為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，可參見《蠶業(yè)科學(xué)》2008年第一期，出版號:ISSN0257-4799，CN32-1115/S，作者孫日彥。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，嫁接擴(kuò)繁步驟如下：

春季誘導(dǎo)成的變異枝，在夏秋季采用“T”形芽接法嫁接；第二年春，取誘導(dǎo)枝的中上部，用袋接法進(jìn)行嫁接；第二年桑樹夏伐前，取變異枝生長芽，采用管狀芽接法嫁接。

上述“T”形芽接法、袋接法、管狀芽接法均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，“T”形芽接法可參見《中國桑樹栽培學(xué)》(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所主編：1985，出版號16119·447)、袋接法可參見《實用桑樹栽培學(xué)》(吳仁儒主編：1989，出版號ISBN7-5364-1453-6/S·224)、管狀芽接法可參見《桑樹栽培與育種學(xué)》(柯益富主編：1997，出版號ISBN7-109-04315-0/S·2673)。

有益效果

本發(fā)明首次采用秋水仙堿和6-芐基嘌呤作為誘變劑處理特殊時期的桑樹頂芽，較現(xiàn)有常規(guī)誘變方法，顯著提高了正突變率，降低了誘變致死率，可以顯著提高新品種的培育速度和幾率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中誘導(dǎo)桑品種“選792”獲得的新品種“魯誘3號”；

圖2為本發(fā)明所述誘導(dǎo)后枝條長至20cm左右時葉序紊亂。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

實施例1

一種利用秋水仙堿誘變選育桑樹品種的方法，步驟如下：

(1)扦插苗苗高50cm以上，幼齡桑、成齡桑春伐或夏伐后長出的開五葉后的新梢，選取枝條健壯、頂芽飽滿、無病蟲害的頂芽，將誘變劑注滿頂芽(用4號針頭進(jìn)行注射，量以注滿頂芽不溢出為準(zhǔn)，注射量為1ml)，3天后重復(fù)處理一次，獲得誘變材料；

所述的誘變劑為含有質(zhì)量濃度為0.4％秋水仙堿和2mg/L 6-芐基嘌呤(6-BA)的乙醇溶液；

(2)將步驟(1)獲得的誘變材料培養(yǎng)15～20天后，選取變異條，經(jīng)染色體鑒定，確定染色體變異的材料，然后進(jìn)行誘導(dǎo)枝的繁育，經(jīng)性狀正突變篩選和遺傳穩(wěn)定篩選后，獲得新品種，進(jìn)行嫁接擴(kuò)繁建立良種接穗園。

所述步驟(2)中，性狀正突變篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：

①葉片，形狀及葉脈不紊亂、葉面積增加15％以上、厚度大于200μm；

②枝條上皮孔數(shù)為10～15個/cm²，皮孔大小為2～6mm；

③節(jié)間距小于4cm；

④誘導(dǎo)后枝條長至50cm以上時，枝條固定成穩(wěn)定的葉序；

⑤枝條較未誘導(dǎo)枝直徑長1～3mm。

所述步驟(2)中，誘導(dǎo)枝的繁育為通過扦插的繁殖方式進(jìn)行。

所述步驟(2)中，遺傳穩(wěn)定篩選采用AMMI模型穩(wěn)定性分析方法。

所述步驟(2)中，嫁接擴(kuò)繁步驟如下：

春季誘導(dǎo)成的變異枝，在夏秋季采用“T”形芽接法嫁接；第二年春，取誘導(dǎo)枝的中上部，用袋接法進(jìn)行嫁接；第二年桑樹夏伐前，取變異枝生長芽，采用管狀芽接法嫁接。

所述步驟(2)中，染色體鑒定采用去壁低滲法，去壁低滲法為植物染色體鑒定常規(guī)技術(shù)，可參見《蠶學(xué)通訊》1996年第一期，出版號ISSN:1006-0561，作者余茂德；具體步驟如下：

(i)取待鑒定桑樹的幼葉、頂芽、葉原基或腋芽原基部分，置于飽和對二氯苯溶液中，處理2～4h，制得預(yù)處理樣品；

(ii)將步驟(i)制得的預(yù)處理樣品水洗后，置于固定液中，在5～10℃條件下固定4～24h，制得固定后樣品；

所述固定液由冰醋酸與乙醇按體積比1：3的比例混合；

(iii)將步驟(ii)制得的固定后樣品經(jīng)體積百分比濃度為85％的酒精浸漬10min，體積百分比濃度為70％的酒精浸漬10min，體積百分比濃度為50％的酒精浸漬10min，體積百分比濃度為35％的酒精浸漬10min，水洗后，轉(zhuǎn)入1N鹽酸中，在60℃條件下，恒溫處理10min，制得解離樣品；

(iv)將步驟(iii)制得的解離樣品水洗后，移至載玻片上，用改良苯酚品紅染色液染色5min后，經(jīng)壓片，觀察確定染色體數(shù)目。

所述步驟(2)中，嫁接擴(kuò)繁步驟如下：

春季誘導(dǎo)成的變異枝，在夏秋季采用“T”形芽接法嫁接；第二年春，取誘導(dǎo)枝的中上部，用袋接法進(jìn)行嫁接；第二年桑樹夏伐前，取變異枝生長芽，采用管狀芽接法嫁接。

實施例2

如實施例1所述的利用秋水仙堿誘變選育桑樹品種的方法，不同之處在于，

誘變劑分別為質(zhì)量濃度0.4％秋水仙堿和濃度為1.5、2、2.5mg/L 6-芐基嘌呤三個配比的乙醇溶液，對桑品種選792成齡桑誘導(dǎo)，當(dāng)年變異率、致死率、正突變率實驗結(jié)果如表1所示：

表1

實施例3

如實施例1所述的利用秋水仙堿誘變選育桑樹品種的方法，不同之處在于，

對成齡桑、幼齡桑、扦插苗進(jìn)行處理，應(yīng)用spss19軟件進(jìn)行配對樣本T檢驗變異率、致死率、正突變率，結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明三處理類型不存在顯著差異，即本誘導(dǎo)劑對成齡桑、幼齡桑、扦插苗進(jìn)行處理，效果差異不顯著。

表2

注：成齡桑品種為選792，幼齡桑及扦插苗為魯插1號。

對比例1

如實施例1所述的利用秋水仙堿誘變選育桑樹品種的方法，不同之處在于，

秋水仙堿乙醇溶液(下同)質(zhì)量濃度配比分別為0.3％、0.4％、0.5％，對桑品種選792成齡桑誘導(dǎo)，使用注射法進(jìn)行，3天后重復(fù)注射，當(dāng)年變異率、致死率、正突變率結(jié)果如表3所示：

表3

對比例2

如實施例1所述的利用秋水仙堿誘變選育桑樹品種的方法，不同之處在于，

誘變劑含有質(zhì)量濃度0.4％秋水仙堿和質(zhì)量濃度分別為1％、2％、3％的二甲亞砜的混合液，分別用上述誘變劑對桑品種選792成齡桑誘導(dǎo)，當(dāng)年變異率、致死率、正突變率實驗結(jié)果如表4所示：

表4

結(jié)果分析

由以上結(jié)果可以看出，以0.4％濃度的秋水仙堿配比，正突變率最高(如表3所示)；由表1可知，以0.4％秋水仙堿和2mg/L 6-芐基嘌呤乙醇溶液作為誘變劑效果最好。由表4可知，以0.4％秋水仙堿和2％二甲亞砜混合液表現(xiàn)最好。通過表1和表4對比可以看出，0.4％秋水仙堿和2mg/L 6-芐基嘌呤乙醇溶液作誘導(dǎo)劑可顯著提高枝條存活率及正突變率。