本發明涉及植物育種
技術領域：
，具體地，涉及一種從倍性嵌合體植物中分離純合體以及建立全同胞或異同胞細胞型群體的方法。
背景技術：
：多倍體育種是植物遺傳改良的重要手段，尤其對于異花授粉的木本植物而言，多倍體育種綜合了倍性優勢和雜合優勢，改良效果顯著(康向陽.關于楊樹多倍體育種的幾點認識.北京林業大學學報,2010,32(5):149-153)。三倍體毛白楊、四倍體刺槐等多倍體品種在生長量、木材品質、代謝產物含量等方面均表現出了顯著的優勢，已在我國林業生產中廣泛應用。四倍體植株通常通過對種子、莖尖等分生組織區施加處理誘導體細胞染色體加倍的途徑獲取。然而，由于植物分生組織區細胞有絲分裂的不同步性，不同細胞的加倍效果存在差異，往往導致倍性嵌合體的存在，純四倍體的誘導率較低，影響倍性效應的發揮和育種效率。盡管Wang等通過單細胞合子染色體加倍的方式獲得了楊樹純四倍體植株，并避免了嵌合體的產生，但是由于合子休眠期的存在，難以準確把握合子休眠后第一次有絲分裂的時機，因此，合子染色體加倍的四倍體誘導率也僅為3.13％(WangJ,ShiL,SongSY,TianJ,KangXY.TetraploidproductionthroughzygoticchromosomedoublinginPopulus.SilvaFennica,2013,47(2):id932)，而且無法同時獲取相同基因型的二倍體細胞型材料。此外，Cai等利用秋水仙堿處理離體培養的葉片，誘導不定芽染色體加倍也獲得了楊樹四倍體植株(CaiX,KangXY.InvitrotetraploidinductionfromleafexplantsofPopuluspseudo-simoniiKitag.PlantCellReports,2011,30(9):1771-1778)，但是，該方法需將材料進行同步化預培養并掌握合適的處理時機，而且不可避免的也會產生倍性嵌合體植株，同時，大量的工作量僅能完成單個基因型的四倍體誘導，試驗操作步驟繁雜，試驗周期長，四倍體誘導效率較低，不利于大群體四倍體植株的獲得。劉孟軍等在田間利用秋水仙堿處理枝條愈傷組織可獲得高比率純四倍體，但是也不能完全避免嵌合體的發生，同時還觀察到了八倍體、六倍體、五倍體和三倍體的存在，而且需要經歷后期發育過程的形態學鑒定(劉孟軍，劉平，王玖瑞，石慶華，徐娟，寧強.棗田間愈傷組織途徑免嵌合體純化快速誘導同源多倍體.園藝學報，2013，40(S):2610)。如能充分利用容易誘導獲得的倍性嵌合體為材料，將倍性嵌合體中的四倍體細胞純化并再生為完整植株，必將極大地提高植物四倍體育種的效率和效果，并且在可能同時純化出相同基因型的二倍體植株，構建全同胞二倍體和四倍體異細胞型群體，滿足深入開展林木倍性效應遺傳分析的需要，推動林木遺傳改良理論發展。Chen等對黃芪倍性嵌合體材料利用愈傷組織分化并再生的方式，實現了四倍體的純化，但是由于愈傷組織再生過程非單細胞再生，導致同時產生了嵌合體的植株(ChenLL,GaoSL.InvitrotetraploidinductionandgenerationoftetraploidsfrommixoploidsinAstragalusmembranaceus.ScientiaHorticulturae,2007,112:339-344)。多次繼代培養被認為可以實現嵌合體的分離純化(向素瓊，梁國魯，郭啟高，李曉林，何橋.辣木組織培養與四倍體植株誘導.熱帶亞熱帶植物學報,2007,15(2):141-146)，但是時間周期很長，而且由于不同倍性細胞發育的競爭性因素，可能導致最終僅能獲得二倍體植株，因此，研發更加高效、適宜的嵌合體純化技術十分必要。技術實現要素：本發明的目的是針對目前林木四倍體誘導效率低，體細胞染色體加倍易產生倍性嵌合體，難以建立四倍體大群體的問題，提供一種從倍性嵌合體植物中分離純合體的方法。本發明提供的一種從倍性嵌合體植物中分離純合體的方法，根據植物不定芽是單細胞起源(BroertjesC,vanHartenAM.Singlecelloriginofadventitiousbuds[J].Euphytica,1985,34:93-95.)的原理，是利用不定芽誘導培養基對倍性嵌合體植物的組培苗葉片進行不定芽誘導，對同一個體植株葉片再生的不定芽進行倍性檢測，篩選分離出不同倍性純合體的不定芽，并分別進行再生培養，獲得不同倍性的純合體植株。所述不定芽誘導培養基是經過篩選得到，篩選方法為：將倍性嵌合體植物子代植株的組培苗第2-4片成熟葉片接種于不同配方的誘導培養基上，選擇25-40天后葉片分化率高且再生系數高的誘導培養基作為不定芽誘導培養基。本發明的方法中，當同一個體植株葉片再生的不定芽長出3-4片真葉后，對單個不定芽采集其不同葉片混合后，使用流式細胞儀對其進行倍性檢測，以判斷整個不定芽的倍性水平。本發明提供了上述方法在植物育種中的應用。本發明還提供一種植物全同胞異細胞型群體的構建方法，包括以下步驟：(1)人工控制兩種不同植物的雌株和雄株進行雜交；或人工控制兩種不同植物的雌株和雄株進行雜交；(2)采集雜交種子進行加倍處理，獲得倍性嵌合體植株；(3)以步驟(1)所獲得未經加倍處理的種子無菌播種苗為材料，篩選適合步驟(2)的倍性嵌合體植株子代多基因型葉片的不定芽誘導培養基；(4)利用篩選得到的不定芽誘導培養基對倍性嵌合體植株子代的組培苗葉片進行不定芽誘導，對同一個體植株葉片再生的不定芽進行倍性檢測，篩選分離出不同基因型的不同倍性純合體的不定芽，并分別進行再生培養，獲得不同倍性的純合體，進而構建全同胞異細胞型群體。上述構建方法中，步驟(1)控制雌花(或雌株)僅接受目標雄花(或雄株)的花粉，防止外源花粉污染。上述構建方法中，步驟(2)雜交種子進行加倍處理的方法為將授粉后獲得的雜交種子無菌處理后，采用0.1-0.3％的秋水仙堿處理1-3天。上述構建方法中，不定芽誘導培養基的篩選方法為：未經加倍處理的種子無菌播種苗第2-4片成熟葉片接種于不同配方的誘導培養基上，選擇25-40天后葉片分化率高且再生系數高的誘導培養基作為不定芽誘導培養基。本發明進一步提供了上述構建方法在植物加倍育種中的應用，該方法能快速、高效地創建林木全同胞二倍體和四倍體異細胞型群體，為林木多倍體遺傳改良和倍性效應遺傳分析等研究提供材料。在本發明的一個實施例中，使用小青楊雌株和鉆天楊雄株進行授粉雜交，分別于授粉后37、40、43天采集雜交種子，分別用0.1％、0.2％、0.3％的秋水仙堿處理獲得的雜交種子1、2、3天，用流式細胞儀檢測后確定誘變植株的倍性，發現在授粉后第43天，用0.1％秋水仙堿處理24小時，小青楊×鉆天楊種子存活率83.33％，獲得的嵌合體數量最多，達15株。選擇未經秋水仙堿加倍處理的種子無菌播種生長40天的組培苗第2-4片成熟葉片，過葉片主脈將其剪成1cm左右長，葉面向下接種于含細胞分裂素6-BA(0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L)和生長素NAA(0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L)的MS固體培養基上，30天后統計葉片分化情況。發現適合小青楊×鉆天楊的多基因型葉片不定芽再生培養基為MS+0.4mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，在此條件下葉片分化率為83.33±6.80％，不定芽再生系數為6.80±7.05個/片。以該培養基作為不定芽誘導培養基。將生根培養40d的青楊倍性嵌合體組培苗葉片接種至篩選得到的葉片不定芽誘導培養基中，40d后將再生的不定芽轉接至MS+0.1mg/LNAA培養基中進行壯苗培養，待長出3-4片真葉后使用流式細胞儀進行倍性檢測。共檢測26個基因型的嵌合體的72株再生苗，其中7個基因型獲得四倍體再生苗，14個基因型獲得二倍體再生苗，5個基因型同時得到了二倍體和四倍體再生苗，證明了從倍性嵌合體中純化四倍體植株的可行性，通過進一步擴展基因型數量，可建立起全同胞二倍體和四倍體異細胞型群體。本發明的有益效果在于：1、本發明方法充分利用了常規體細胞染色體加倍所獲得的大量倍性嵌合體材料，建立了林木倍性嵌合體純化技術體系，純化效率達100％。2、本發明方法通過對倍性嵌合體材料的純化，可同步獲得相同基因型的二倍體和四倍體、以及其他倍性的細胞型材料，為開展倍性效應的遺傳分析提供理想的研究材料。3、本發明方法操作簡單、工作量少、周期短、效率高，在半年內可獲得多個基因型二倍體和四倍體異細胞型材料，從而實現全同胞二倍體和四倍體異細胞型群體的構建，為從群體層面探討多倍體植物的遺傳效應奠定了基礎。附圖說明圖1為種子加倍得到的倍性嵌合體組培苗及其流式細胞分析圖，圖1A，在培養皿中用固體培養基進行種子加倍得到的倍性嵌合體組培苗圖；圖1B，倍性嵌合體組培苗；圖1C，倍性嵌合體流式細胞分析圖。圖2為生長于多基因型葉片不定芽誘導培養基上的嵌合體葉片。圖3為倍性嵌合體純化獲得的二倍體和四倍體組培苗圖，圖3A，純化的二倍體組培苗；圖3B，純化的二倍體流式細胞分析圖；圖3C，純化的四倍體組培苗；圖3D，純化的四倍體流式細胞分析圖。具體實施方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的化學試劑、植株均為常規市售，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1本發明具體實施方式的試驗材料選擇小青楊雌株和鉆天楊雄株，分別采集花枝水培于溫室內促花。1、控制授粉雜交與溫室內收集雄株鉆天楊的花粉，待雌株小青楊雌蕊進入可授期時，利用毛筆蘸取花粉進行授粉。整個過程注意對雌蕊進行套袋隔離，防止外源花粉的污染。雌蕊柱頭萎蔫后，取下套袋讓雌花序繼續正常發育。2、種子加倍處理分別于授粉后37、40、43天，采集成熟但未飛絮的雌花序，在超凈工作臺中用75％酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，1.0％次氯酸鈉浸泡10min后用無菌水浸泡沖洗3次。用鑷子剝開蒴果，取出種子并除去楊絮，將種子接種于分別含0.1％、0.2％、0.3％秋水仙堿的空白MS固體培養基中處理1-3d，每處理種子數為30粒，共處理1350粒種子。避光培養1-3天后將其轉接至不含秋水仙堿的MS+0.1mg/lIBA固體培養基中進行見光培養，待長出3-4片真葉后，在超凈工作臺內取其幼嫩的對生兩片葉子，置于含空白MS培養基的6×6格細胞板上，一株組培苗葉片占用一格，并在原株組培瓶和取樣培養皿上做好標記。在細胞核裂解液中用鋒利的刀片快速將其切碎，用30μm尼龍網過濾后加入熒光染色液DAPI染色后上樣。用流式細胞儀進行檢測，以確定誘變植株的倍性，結果分別見圖1A、圖1B、圖1C。通過處理共獲得嵌合體212株，四倍體14株。其中，在授粉后第43d，用0.1％秋水仙堿處理24h，小青楊×鉆天楊種子存活率83.33％，獲得的嵌合體數量最多，達15株(表1)。表1授粉后時間、秋水仙堿濃度和處理時間對加倍效果的影響3、多基因型葉片不定芽誘導培養基篩選隨機選取80個未經秋水仙堿處理的雜交后獲得的子代植株的生長40d的組培苗第2-4片成熟葉片，過葉片主脈將其剪成1cm左右長，葉面向下接種于含細胞分裂素6-BA(0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L)和生長素NAA(0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L)的MS固體培養基上，30天后統計葉片分化情況，見圖2。由表2可知，適合小青楊×鉆天楊的多基因型葉片不定芽再生培養基為MS+0.4mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，在此條件下葉片分化率為83.33±6.80％，不定芽再生系數為6.80±7.05個/片。表26-BA和NAA對青楊雜種多基因型不定芽誘導的影響編號6-BA(mg/L)NAA(mg/L)分化率(％)再生系數(個)10.30.0576.67±2.972.97±1.1920.30.176.67±3.473.47±1.9930.30.270.00±4.004.00±0.9240.40.0576.67±3.973.97±3.5050.40.183.33±6.806.80±7.0560.40.283.33±6.076.07±3.5470.50.0566.67±1.871.87±1.0380.50.183.33±4.004.00±2.2190.50.266.67±2.302.30±0.964、倍性嵌合體純化從步驟2中隨機選擇了26個青楊雜種倍性嵌合體組培苗，取葉片接種至葉片不定芽誘導培養基(MS+0.4mg/L6-BA+0.1mg/LNAA)中，40d后將再生的不定芽轉接至MS+0.1mg/LNAA培養基中進行壯苗培養，待長出3-4片真葉后使用流式細胞儀進行倍性檢測。通過不定芽再生共獲得72個再生苗(表3)，利用流式細胞儀對這72個再生苗進行倍性檢測，發現表3中Q1-Q7這7個基因型的全部14個再生苗都為四倍體，Q8-Q21的14個基因型的全部29個再生苗均為二倍體，Q22-Q26的5個基因型的29再生苗中，既有二倍體又有四倍體。純化的二倍體組培苗見圖3A，純化的二倍體流式細胞分析圖見圖3B，純化的四倍體組培苗見圖3C，純化的四倍體流式細胞分析圖見圖3D。證明了采用本發明的方法從倍性嵌合體中純化四倍體植株是可以實現的，通過進一步擴展基因型數量，可建立起全同胞二倍體和四倍體異細胞型群體。表3小青楊×鉆天楊嵌合體純化檢測結果以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3