本發(fā)明涉及生物技術領域，具體來說涉及一種，同時還涉及該含嘧菌酯的殺菌劑組合物的制備方法，及該含嘧菌酯的殺菌劑組合物在防治煙草赤星病、煙草白粉病及煙草灰霉病方面的用途。

背景技術：

煙草赤星病(brown spot)和煙草白粉病(white powder)是煙草生長期發(fā)生的分別由煙草赤星病菌Alternaria alternata(Fr.)Keissl和煙草白粉病菌Erysiphe cichoracearum DC引起的真菌性病害。它們均具有間歇性和爆發(fā)性的特點，嚴重時煙葉發(fā)病率可高達90％，使烤煙質(zhì)量下降1-2個等級，重病區(qū)減產(chǎn)、減收達50％以上。近年來，煙草赤星病和煙草白粉病一直是嚴重威脅我國煙草生產(chǎn)的主要病害之一。此外，由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.:Fr)引起的煙草灰霉病也是煙草上的重要病害之一，煙草整個生育期內(nèi)均可發(fā)病，以苗期及現(xiàn)蕾期發(fā)生較重。苗期主要發(fā)生于近地面的葉片上，高濕環(huán)境下病斑迅速擴展，直徑可達5厘米以上，病斑呈濕腐狀，其上布滿灰色霉層。在集約化漂浮育苗的情況下，病菌很快擴散，嚴重威脅著煙苗的生產(chǎn)。因此，對煙草赤星病、白粉病、灰霉病的防治迫在眉睫。

長期以來，生產(chǎn)上主要靠化學防治藥劑依靠菌核凈來防治煙草赤星病，多菌靈、三唑酮等來防治煙草白粉病與灰霉病。由于病菌具有繁殖速率高、遺傳變異大和適合度高的特性，多年連續(xù)大量使用化學藥劑使得病原菌對主要防治殺菌劑產(chǎn)生嚴重的抗藥性。因此，亟待尋找新的病害防治解決方案。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯是一種現(xiàn)代廣譜、高效、內(nèi)吸性殺菌劑，純品為淺綜合結晶固體，別名為(E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯，相對密度為1.34g/cm³，溶解度20℃時為6mg/L，蒸氣壓20℃為1.1×10^-7mPa，沸點為581.3℃。還未用于煙草病害的防治；同時，微生物菌劑可與病原菌競爭營養(yǎng)、空間位點，誘導植物產(chǎn)生抗病性，其次生代謝產(chǎn)物對病原菌具有抑制作用、對植物具有促生作用，且綠色、環(huán)保、安全，在植物病害的防治中具有重要的應用價值。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述問題而提供的一種對煙草赤星病、煙草白粉病及煙草灰霉病具有較好的防治效果，環(huán)境友好的含嘧菌酯的殺菌劑組合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供該嘧菌酯組合物的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供該含嘧菌酯的殺菌劑組合物在防治煙草赤星病、煙草白粉病及煙草灰霉病方面的用途。

本發(fā)明的一種含嘧菌酯的殺菌劑組合物，其中：含嘧菌酯濃度為20-300μg/ml，解淀粉芽孢桿菌X60的濃度為1×10⁶-1×10¹⁰CFU/ml。

上述的一種含嘧菌酯的殺菌劑組合物，其中：解淀粉芽孢桿菌X60，其形態(tài)特征：在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時后產(chǎn)生單菌落，菌落為乳白色，圓形，邊緣有細齒，中間隆起，表面光滑，菌體為短直桿狀，革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生芽孢，可分泌蛋白酶、纖維素酶等。

該菌種已于2013年8月13日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：湖北省武漢市武昌珞珈山，武漢大學)，保藏號：CCTCC M 2013375，名稱為：解淀粉芽孢桿菌X60(Bacillus amyloliquefaciens X60)。

(一)解淀粉芽孢桿菌X60(Bacillus amyloliquefaciens)的分離步驟：

采用“稀釋分離法”稱取10g煙草根圍土壤于潔凈燒杯中，加于90ml無菌水，磁力攪拌使其充分混勻，靜置20分鐘后吸取0.5ml上清液于15×150mm潔凈試管中，添加4.5ml無菌水充分混勻得10^-1濃度母液，再從稀釋后的試管中吸取0.5ml上清液，再加入4.5ml無菌水充分混勻制得10^-2濃度溶液，依次稀釋至10^-9不同濃度的土壤溶液待用。分別吸取上述不同濃度土壤溶液100μl，均勻涂布于培養(yǎng)細菌的NA平板上，28℃黑暗培養(yǎng)，待細菌長出后挑取單菌落純化。

(二)培養(yǎng)基：

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(NA)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，瓊脂粉16g，水1000ml，pH 6.8-7.2。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(NB)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，pH 6.8-7.2。

(三)菌種的保種和傳代：

用18×180mm的試管，盛NA培養(yǎng)基9ml，做成斜面，接種細菌，28℃培養(yǎng)2-3天，置4℃保存，3個月轉(zhuǎn)種一次。

將純化后的細菌在NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，待細菌長出后挑出單菌落，用滅菌的牙簽將細菌單菌落挑至裝有5ml NB培養(yǎng)基的試管(15×150mm)里搖培24h，吸取700μl菌液至2ml菌株保存管中，再向保存管中添加700μl30％滅菌甘油，置于-20℃冰柜中長期保存。

(四)菌種的形態(tài)特征：

該菌形成的菌落在NA平板上，30℃，培養(yǎng)2d，菌落直徑5-15mm，菌落近圓形、白色、半透明、光滑濕潤、稍隆起，菌體為短直桿狀，為好氧細菌，革蘭氏反應陽性。經(jīng)細菌鑒定手冊描述，結合Biolog鑒定結果及16S rDNA序列分析結果，將這一菌株記為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens X60)。

(五)菌種的培養(yǎng)特性

培養(yǎng)溫度20-50℃，最適溫度范圍30-37℃；培養(yǎng)初始pH4.0-9.0，最適6.0-7.0；培養(yǎng)鹽濃度0.5-5％，最佳0.5％；可培養(yǎng)碳源有葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、纖維二塘、淀粉，其中葡萄糖最佳；可培養(yǎng)氮源有牛肉膏、蛋白胨、KNO₃、NH₄NO₃、(NH₄)₂SO₄和NaNO₂，其中牛肉膏和蛋白胨最佳。

本發(fā)明的一種含嘧菌酯的殺菌劑組合物的制備方法。包括以下步驟：

(1)將質(zhì)量濃度為95％嘧菌酯原藥用甲醇配成1×10⁴μg/ml母液，4℃低溫保存；

(2)在NB培養(yǎng)液中搖培解淀粉芽孢桿菌X60，10000rpm下離心10分鐘收集解淀粉芽孢桿菌X60濕菌體；將解淀粉芽孢桿菌X60在NB培養(yǎng)液中30℃180rpm振蕩培養(yǎng)36-48小時，然后10000rpm離心10分鐘，取X60濕菌體與菌體保藏液，按質(zhì)量體積比為1:50配成菌劑，菌劑成品活菌濃度為1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml；

(3)將嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60濕菌體混合，配制成含嘧菌酯濃度為20-300μg/ml，解淀粉芽孢桿菌X60的濃度范圍為1×10⁶-1×10¹⁰CFU/ml。

上述的的一種含嘧菌酯的殺菌劑組合物的制備方法，其中NB培養(yǎng)液的配制方法為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去離子水至1L，pH 6.8-7.2，經(jīng)120℃滅菌20分鐘。

上述的的一種含嘧菌酯的殺菌劑組合物的制備方法，其中：菌體保藏液含0.01mol/L磷酸鹽緩沖液、0.001mol/L的Tween 40非離子型表面活性劑。

本發(fā)明的一種含嘧菌酯的殺菌劑組合物在防治煙草赤星病、煙草白粉病及煙草灰霉病方面的用途。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有明顯的有益效果，從以上技術方案可知：本發(fā)明經(jīng)活體試驗表明，嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌菌株X60組合物對煙草赤星病、煙草白粉病及煙草灰霉均具有較好的抑制作用，且具有較長時間的預防作用。病害防治效果比嘧菌酯單獨作用、及解淀粉芽孢桿菌單獨作用時的防治效果好。該組合物中解淀粉芽孢桿菌用濕菌與菌種保藏液配制而成，菌體保藏液為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液、及0.001mol/L的Tween 40非離子型表面活性劑；嘧菌酯先用甲醇(分析純)配成1×10⁴μg/ml的母液，使用時用含0.01％吐溫40的無菌水稀釋。該組合物可以直接噴霧大田期的煙葉及漂浮育苗苗床上的煙苗。本發(fā)明是專門針對煙草赤星病、煙草白粉病及煙草灰霉病開發(fā)的防病組合物。由于組合物對病原菌的作用位點多，對環(huán)境友好，可有效解決煙草赤星病菌和煙草白粉病菌對傳統(tǒng)防治藥劑產(chǎn)生的抗藥性問題，有利于煙葉的安全可持續(xù)發(fā)展。

具體實施方式

實施例1

一種含嘧菌酯的殺菌劑組合物的制備方法。包括以下步驟：

(1)將質(zhì)量濃度為95％嘧菌酯原藥用甲醇配成1×10⁴μg/ml的母液，4℃低溫保存；

(2)將解淀粉芽孢桿菌X60(Bacillus amyloliquefaciens X60)在NB培養(yǎng)液(配制方法為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去離子水至1L，pH6.8-7.2，經(jīng)120℃滅菌20分鐘)，30℃180rpm振蕩培養(yǎng)36-48小時，然后10000rpm離心10分鐘，取X60濕菌體與菌體保藏液(菌體保藏液含0.01mol/L、磷酸鹽緩沖液0.001mol/L的Tween 40非離子型表面活性劑)，按質(zhì)量體積比為1:50配成菌劑，菌劑成品活菌濃度為1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml；

(3)將嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60濕菌體混合，配制成含嘧菌酯濃度為20μg/ml，解淀粉芽孢桿菌X60的濃度范圍為1×10¹⁰CFU/ml。

實施例2

一種含嘧菌酯的殺菌劑組合物的制備方法。包括以下步驟：

(1)將質(zhì)量濃度為95％嘧菌酯原藥用甲醇配成1×10⁴μg/ml的母液，4℃低溫保存；

(2)將解淀粉芽孢桿菌X60(Bacillus amyloliquefaciens X60)在NB培養(yǎng)液(配制方法為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去離子水至1L，pH6.8-7.2，經(jīng)120℃滅菌20分鐘)，30℃180rpm振蕩培養(yǎng)36-48小時，然后10000rpm離心10分鐘，取X60濕菌體與菌體保藏液(菌體保藏液含0.01mol/L磷酸鹽緩沖液0.001mol/L的Tween 40非離子型表面活性劑)，按質(zhì)量體積比為1:50配成菌劑，菌劑成品活菌濃度為1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml；

(3)將嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60濕菌體混合，配制成含嘧菌酯濃度為300μg/ml，解淀粉芽孢桿菌X60的濃度范圍為1×10⁶CFU/ml。

實施例3

一種含嘧菌酯的殺菌劑組合物的制備方法。包括以下步驟：

(1)將質(zhì)量濃度為95％嘧菌酯原藥用甲醇配成1×10⁴μg/ml的母液，4℃低溫保存；

(2)將解淀粉芽孢桿菌X60(Bacillus amyloliquefaciens X60)在NB培養(yǎng)液(配制方法為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去離子水至1L，pH6.8-7.2，經(jīng)120℃滅菌20分鐘)，30℃180rpm振蕩培養(yǎng)36-48小時，然后10000rpm離心10分鐘，取X60濕菌體與菌體保藏液(菌體保藏液含0.01mol/L磷酸鹽緩沖液0.001mol/L的Tween 40非離子型表面活性劑)，按質(zhì)量體積比為1:50配成菌劑，菌劑成品活菌濃度為1×10¹⁰-1×10¹²CFU/ml；

(3)將嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60濕菌體混合，配制成含嘧菌酯濃度為100μg/ml，解淀粉芽孢桿菌X60的濃度范圍為1×10⁷CFU/ml。

試驗例1：對煙草赤星病的抑制試驗

赤星病的防治試驗在大田中進行，待成熟期煙葉上開始零星出現(xiàn)煙草赤星病病斑時開始實驗。生防菌處理組Ⅰ，將上述生防菌液均勻噴霧至煙苗葉片表面，直至流失；嘧菌酯處理組Ⅱ，200μg/ml的嘧菌酯噴霧，直至流失；實施例1處理組Ⅲ-1(20μg/ml的嘧菌酯與1×10¹⁰CFU/ml解淀粉芽孢桿菌混合物)、實施例2處理組Ⅲ-2(300μg/ml的嘧菌酯與1×10⁶CFU/ml解淀粉芽孢桿菌混合物)、實施例3處理組Ⅲ-3(100μg/ml的嘧菌酯與1×10⁷CFU/ml解淀粉芽孢桿菌混合物)噴霧，直至流失；菌核凈對照處理組Ⅳ，40％菌核凈可濕性粉劑1500倍液噴霧，直至流失；空白對照組Ⅴ，噴霧無菌水。每處理處理煙苗60株。煙葉于自然條件下發(fā)病。20天后觀察記錄葉片發(fā)病情況，并調(diào)查病情指數(shù)，計算防效。

按照以下的病情統(tǒng)計分級，根據(jù)葉片發(fā)病面積進行病情統(tǒng)計：

0級：全葉無病斑；

1級：病斑面積占葉片面積的1％以下；

3級：病斑面積占葉片面積的2％-5％；

5級：病斑面積占葉片面積的6％-10％；

7級：病斑面積占葉片面積的11％-20％；

9級：病斑面積占葉片面積的21％以上。

田間試驗表明，嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60菌劑組合物組能夠很好的預防煙草赤星病的發(fā)生。

表1嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60菌劑組合物施用20天后對煙草赤星病的防效

試驗例2：對煙草白粉病的抑制試驗

白粉病的防治試驗在大田中進行，待旺長期煙葉上開始零星出現(xiàn)煙草白粉病病斑時開始實驗。生防菌處理組Ⅰ，將上述生防菌液均勻噴霧至煙苗葉片表面，直至流失；嘧菌酯處理組Ⅱ，200μg/ml的嘧菌酯噴霧，直至流失；嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌組合物處理組Ⅲ，100μg/ml的嘧菌酯與1×10¹⁰CFU/ml解淀粉芽孢桿菌混合物噴霧，直至流失；多菌靈對照處理組Ⅳ，80％多菌靈可濕性粉劑1000倍稀釋噴霧，直至流失；空白對照組Ⅴ，噴霧無菌水。每處理處理煙苗60株。煙葉于自然條件下發(fā)病。20天后觀察記錄葉片發(fā)病情況，并調(diào)查病情指數(shù)，計算防效。

按照以下的病情統(tǒng)計分級，根據(jù)葉片發(fā)病面積進行病情統(tǒng)計：

0級：全葉無病斑；

1級：病斑面積占葉片面積的1％以下；

3級：病斑面積占葉片面積的2％-5％；

5級：病斑面積占葉片面積的6％-10％；

7級：病斑面積占葉片面積的11％-20％；

9級：病斑面積占葉片面積的21％以上。

田間試驗表明，嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60菌劑組合物組能夠很好的預防煙草白粉病的發(fā)生，其防治效果達到91.09％

表2嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60菌劑組合物施用20天后對煙草白粉病的防效

試驗例3：對煙草灰霉病的抑制試驗

灰霉病菌孢子懸浮液的制備：將煙草灰霉病菌接種于PDA培養(yǎng)基平板，25℃黑暗條件下培養(yǎng)6d，然后將平板置于15℃黑暗條件下誘導分生孢子的形成，3d后用無菌紗布濾去菌絲得到分生孢子懸浮液。用血球計數(shù)板測定孢子懸浮液的濃度，并將孢子懸浮液濃度調(diào)至10⁵個孢子/ml，備用。

在烤煙漂浮育苗盤中育苗(品種：紅花大金元)，待煙苗長至5-6葉時備用。生防菌處理組Ⅰ，將上述生防菌液均勻噴霧至煙苗葉片表面，直至流失；嘧菌酯處理組Ⅱ，200μg/ml的嘧菌酯噴霧，直至流失；嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌組合物處理組Ⅲ，100μg/ml的嘧菌酯與1×10¹⁰CFU/ml解淀粉芽孢桿菌混合物噴霧，直至流失；多菌靈對照處理組Ⅳ，80％多菌靈可濕性粉劑1000倍稀釋噴霧，直至流失；空白對照組Ⅴ，噴霧無菌水。處理24小時后，將上述煙草灰霉病菌孢子懸浮液均勻噴霧至葉片表面，每處理處理煙苗60株。接菌后將煙苗置于自然光照下，15-27℃，RH>80％培養(yǎng)。10天后觀察記錄葉片發(fā)病情況，并調(diào)查病情指數(shù)，計算防效。

按照以下的病情統(tǒng)計分級，根據(jù)葉片發(fā)病面積進行病情統(tǒng)計：

0級--全株無病；

1級--病斑面積占葉片面積的5％以下，或莖部病斑不超過莖圍的1/3；

3級--病斑面積占葉片面積的6％-10％，或莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3-1/2；

5級--病斑面積占葉片面積的11％-20％，或莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍；

7級--病斑面積占葉片面積的21％-40％，或莖部病斑全部環(huán)繞莖圍；

9級--病斑面積占葉片面積的41％以上，或莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，植株凋萎甚至枯死；

漂浮育苗煙苗溫室試驗結果表明，嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60菌劑混合物處理組能夠很好的預防煙草灰霉病的發(fā)生，其防治效果達到92.09％

表3嘧菌酯與解淀粉芽孢桿菌X60菌劑組合物施用10天后對煙草灰霉病的防效

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術方案的范圍內(nèi)。