本發明屬于果樹育種
技術領域：
，具體涉及日本栗2n花粉誘導方法及其應用。
背景技術：
：品種是一個產業得以健康發展的重要保證，也是永恒的基礎需求。目前，國內外培育新品種的方式有很多，主要包括：實生選種、芽變選種、雜交育種、輻射育種、轉基因育種、多倍體育種等，其中多倍體育種一直是應用普遍、育種效果突出的新品種培育方式之一。多倍體是指具有三套或者三套以上完整染色體組的所有個體。染色體組加倍使植物體可用的遺傳物質增加，重復的基因可能會發生功能分化，從而使多倍體物種在自然選擇中具有更大環境適應優勢，如更強的抗旱能力、抗病蟲害能力、無融合生殖等，使植物可以適應更廣泛的自然環境(Rieseberg等，2003)。目前，多倍體育種的途徑主要包括：從自然界選擇天然多倍體植株；利用不同倍性水平植株雜交；利用天然或人工誘導2n花粉(2n雄配子)授粉；利用天然或者人工誘導2n雌配子雜交以及體細胞染色體加倍等。業已證實，利用2n配子雜交是獲得植物多倍體的一種高效方式。2n配子是指在減數分裂過程中某些因素導致形成具有體細胞染色體數的花粉或卵細胞，其在植物界普遍發生，目前至少26個科的60個屬中發現能產生2n配子的植物種(張正海，2008；Nassar，2001)。特別是2n花粉(具有體細胞染色體數的花粉)，由于其與正常倍性花粉在形態及大小方面存在差異，易于識別和鑒定，廣泛應用于植物多倍體育種(楊倩等，2015)。國內外學者多年育種實踐證實，利用化學藥劑誘導出2n花粉與二倍體雌株雜交，是迅速獲得三倍體的有效途徑之一，而提高2n花粉產生頻率是利用2n花粉進行多倍體育種成敗的關鍵(向素瓊等，2005；楊倩等，2015)。在植物雌雄配子多倍化誘導過程中，由于各物種間遺傳物質、器官構成、發育時期和方式等因素千差萬別，其達到好的多倍化誘導效果所需的藥劑、劑量、時間、材料和方法等因素也各不相同(吳瀟等，2016)。栗屬植物的遺傳背景復雜，保守性強，其自然花粉中2n花粉的比率不足1‰，由于其比率過低，無法直接利用其自然花粉中2n花粉進行多倍體育種實踐；在目前的相關研究中，尚未發現有關成功誘導出栗屬植物大頻率2n花粉的報道。因此，選擇以日本栗(Castanrecrenata)為材料，篩選其適宜的誘導藥劑、劑量、時期、部位等因素，創建一套植株2n花粉誘導技術，獲得大頻率2n花粉，為今后提供一種切實可行的2n花粉誘導方法，從而為栗屬植物多倍體育種提供方法參考。技術實現要素：為了克服日本栗自然花粉中2n花粉比率過低(無法直接應用于育種實踐)，彌補大頻率日本栗2n花粉人工誘導方法空白，本發明旨在提供一種日本栗2n花粉誘導方法，該方法可以獲得大頻率2n花粉。實現本發明目的的技術方案為：一種日本栗2n花粉誘導方法，包括如下步驟：1)選擇誘導材料選擇花序長、花朵多、花粉量充足的日本栗‘XY-1’(Castaneacrenata)的雄花枝上的花序為誘導處理材料。2)配制誘導藥劑于采用誘導藥劑處理花序前2天配制好誘導藥劑，又到藥劑包括0.5％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亞砜；配置方法：稱取5g秋水仙素加蒸餾水溶解，之后加入1ml二甲基亞砜，最后用蒸餾水定容至1000ml]，置于4℃冰箱中備用。3)誘導藥劑浸漬花序選擇日本栗健康無病、生長健壯的雄花枝，每條雄花枝上保留5個花序為處理對象，多余疏除。誘導藥劑處理花序時期為每年4月25日前后，以日本栗花序基部直徑不超過3mm，長度不超過7cm，花朵未凸起為標準。將選用的雄花枝上的每條花序單獨用脫脂棉包好，棉層厚度1mm，保留花序著生部位葉片；之后用塑料條將雄花枝上所有包裹好脫脂棉的花序連同其著生部位葉片自下而上封好，留有適當透氣縫隙；塑料條厚度0.06mm，寬度3cm；用醫用一次性注射器將配置好的誘導藥劑注射在包裹好花序的脫脂棉上，直至脫脂棉吸收誘導藥劑至飽和狀態，如此使日本栗雄花枝上的花序在藥劑浸漬狀態下保持72h；之后拆除塑料條，去除花序上的脫脂棉，將藥劑處理后的花序重新暴露在空氣中。4)花序散粉前套袋在日本栗花朵開放前，大約每年6月5日，將誘導藥劑處理過的花序全部套入硫酸紙袋中，封口，以防止該花序上混入其它花粉。5)花粉收集待硫酸紙袋中花序處于雄花盛花期，此時花粉已成熟，將硫酸紙袋和花序一同采下，帶回實驗室，置于陰涼干燥處24h，之后收集袋中自然散落的花粉，即獲得大頻率日本栗2n花粉。本發明所述的一種日本栗2n花粉誘導方法是在日本栗多倍體育種中的應用。本發明的有益效果在于：日本栗花序采用此方法處理后，可以獲得大比率2n花粉，試驗證實：處理的日本栗花序所產生的花粉中2n花粉比率高達12.4％。自然界中的日本栗花粉中2n花粉的比率不足1‰，試驗證實：對照日本栗花序花粉中2n花粉的比率為0.03‰，無法直接利用其進行多倍體育種實踐。本發明日本栗2n花粉誘導方法：第一通過選擇花粉量充足的日本栗‘XY-1’的雄花枝上的花序為處理材料；第二選用以秋水仙素為誘導劑、二甲基亞砜為助滲劑的特定成分、特定濃度和特定配比的2n花粉誘導藥劑，誘導藥劑包括0.5％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亞砜；第三選擇誘導藥劑處理花序特定時期為每年5月17日前后；第四采用脫脂棉包裹花序并使其在藥劑浸漬狀態下保持72h。以上述4個綜合措施來共同達到誘導日本栗花粉中2n花粉比率提高的目的，獲得大比率日本栗2n花粉。具體實施方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。實施例及對比例中所用藥劑、脫脂棉、塑料條、醫用一次性注射器、硫酸紙袋等材料均可市購。對比例1對比例1所用試驗材料位于河北省昌黎果樹研究所板栗育種基地。按下述方法進行日本栗2n花粉誘導試驗。試驗隨機區組設計，單株小區，3次重復，以未處理‘XY-1’花序為對照。該試驗以誘導藥劑(4個水平)、誘導藥劑處理花序時期(5個水平)和藥劑浸漬花序時長(3個水平)為因素，進行完全試驗設計，共60個處理(見表1)。按照下述步驟進行日本栗2n花粉誘導操作：1)選擇誘導材料選擇花序長、花朵多、花粉量充足的日本栗‘XY-1’(Castaneacrenata)的雄花枝上的花序為處理材料。2)配制誘導藥劑于采用誘導藥劑處理花序前2天配制好各處理所需誘導藥劑(見表1)，置于4℃冰箱中備用。3)誘導藥劑浸漬花序選擇日本栗‘XY-1’健康無病，生長健壯的雄花枝，每條雄花枝上保留5個花序為處理對象，多余疏除。各處理的誘導藥劑處理花序時期按照表1所列執行。將選用的雄花枝上的每條花序單獨用脫脂棉包好，棉層厚度1mm，保留花序著生部位葉片；之后用塑料條(厚度0.06mm，寬度3cm)將雄花枝上所有包裹好脫脂棉的花序連同其著生部位葉片自下而上纏好，留有適當透氣縫隙；用醫用一次性注射器將配置好的誘導藥劑注射在包裹好花序的脫脂棉上，直至脫脂棉吸收誘導藥劑至飽和狀態，如此使日本栗雄花枝上的花序在藥劑浸漬狀態下保持24—72h(各處理所用時長見表1)；之后拆除塑料條，去除花序上的脫脂棉，將藥劑處理后的花序重新暴露在空氣中。4)花序散粉前套袋在日本栗花朵開放前(6月5日)，將誘導藥劑處理過的花序全部套入硫酸紙袋中，封口，以防止該花序上混入其它花粉。5)花粉收集待硫酸紙袋中花序處于雄花盛花期，此時花粉已成熟，將硫酸紙袋和花序一同采下，帶回實驗室，置于陰涼干燥處24h，之后收集袋中自然散落的花粉。6)2n花粉檢測隨機選取收集的部分花粉，經卡諾固定液V(乙醇)：V(乙酸)＝3：1固定24—48h。將固定好的花粉制成臨時涂片，45％醋酸洋紅染液染色20min，置于顯微鏡上觀察。根據花粉的直徑判斷是否為2n花粉，并計算比例。每個處理單次隨機檢測500個花粉，重復3次。SPSS20.0進行數據統計分析。所有花粉檢測均在OlympusBX-51光學顯微鏡下觀察，OlympusDP70照相系統數碼攝相。表1試驗設計各處理的相關因素7)實施效果由表2可見，不同處理誘導出的日本栗2n花粉比率不盡相同，處理ch-1～60誘導出的日本栗2n花粉比率均高于自然日本栗花粉(CK)，所有處理中誘導產生2n花粉比率最高的為ch-12，其誘導產生的日本栗2n花粉比率為12.4％，顯著高于對照(日本栗自然花粉中2n花粉比率為0.067％)，亦顯著高于其它處理產生的2n花粉。由此可見，以誘導產生的2n花粉比率為評價指標，ch-12處理中各因素組合為最佳，誘導產生的2n花粉比率是所有處理中最高的(可獲得高達12.4％的日本栗2n花粉)。換言之，在以獲得大頻率2n花粉為目的的前提下，選用誘導藥劑，誘導藥劑包括0.5％(W/V)秋水仙素、0.1％(V/V)二甲基亞砜，于4月25日處理花序，并保持藥劑浸漬花序72h的處理，可以取得理想的試驗結果。表2日本栗2n花粉誘導效果處理代號2n花粉比率(％)處理代號2n花粉比率(％)ch-10.33uvch-321.13mnopqch-20.4tuvch-332.86ghich-31.26mnoch-340.66qrstuch-40.6rstuvch-351.93klch-51.53lmch-365cdch-64.8dech-370.33uvch-70.33uvch-380.46tuvch-81nopqrsch-391.33mnoch-92.86ghich-400.33uvch-100.73pqrstuch-411.13mnopqch-112.66hijch-423ghch-1212.4ach-430.26uvch-130.26uvch-440.66qrstuch-140.86opqrstch-453.26fgch-153.53fch-460.73pqrstuch-160.6rstuvch-471.33mnoch-172.2jkch-484.53ech-185.4cch-490.26uvch-190.73pqrstuch-500.4tuvch-202.26jkch-511.4mnch-214.6dech-520.33uvch-221.06mnopqrch-530.53stuvch-232.86ghich-542.2jkch-247.6bch-550.26uvch-250.13vch-560.66qrstuch-260.73pqrstuch-572.46jkch-271.93klch-580.86opqrstch-280.33uvch-591.2mnopch-291nopqrsch-602.8ghich-302.26jkck0.067wch-310.46tuv注:表中數據后不同字母表示差異顯著(α＝0.05)。雖然，上文中已經用一般性說明、具體實施方式及實例，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對本方法的判別模型作出一定的補充和優化。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3