本發明屬于植物保護技術領域，進一步屬于農藥防治技術領域，具體涉及一種害蟲驅避劑。

背景技術：

化學農藥是控制植物蟲害的主要手段之一，然而化學農藥，尤其是化學殺蟲劑在消滅蟲害的同時，會帶來環境污染和害蟲抗性等的問題。隨著現代農業和生態環境對化學農藥品種性能的要求日益提高，化學農藥新品種的研制和開發風險也在增加。而植物源農藥具有生物活性多樣性(殺蟲、殺菌、除草且作用方式多種多樣)、無殘留、對環境安全、對高等動物及天敵安全、害蟲不易產生抗藥性等優點，目前已成為人們研究的熱點。特別是已有許多研究表明：專性寄生真菌侵染寄主植物對昆蟲造成不利影響，即在植物病原菌-寄主植物-昆蟲組成的三元系統中，通過寄主植物介導作用，植物病原菌可能對共同寄主上的昆蟲產生不利的影響。

前期研究發現：中國月季感染白粉菌后甜菜夜蛾發生少，表明甜菜夜蛾能夠識別感病寄主并避免在其上產卵，但識別的化學機理仍不清楚。甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)屬鱗翅目、夜蛾科，是一種世界性頑固害蟲，特別是中國月季(即玫瑰)大棚生產過程中，甜菜夜蛾危害十分嚴重。進一步研究發現：白粉菌侵染中國月季后，中國月季植物體內會合成一些種揮發性次生代謝產物，通常情況下健康中國月季植株不會合這些化合物，只有在中國月季感染白粉菌后，在白粉菌誘導下才會合成。這類白粉菌誘導的新出現的化合物可能對昆蟲產生不利影響。同時，結合感染白粉菌后中國月季上甜菜夜蛾顯著減少的現象來看，這些揮發性化合物有可能是甜菜夜蛾用于識別感染了白粉菌的寄主植物的重要信息化合物之一。這些化合物作為植物的次生代謝產物，在自然界有著完整降解途徑，如能通過研究證實這類化合物對某種有害生物有較強的活性，則在有害生物無公害防治中將發揮重要作用。

為此，研制開發一種利用植物病原真菌誘導寄主植物合成的信息化合物為主要成分的害蟲驅避劑。

技術實現要素：

本發明第一目的在于提供一種植物源無公害害蟲驅避劑；第二目的在于提供一種所述害蟲驅避劑的制備方法；第三目的在于提供一種所述驅避劑的使用方法。

本發明第一目的這樣實現的，所述害蟲驅避劑包含十八烷酸丁酯。

本發明第二目的這樣實現的，所述害蟲驅避劑的制備方法包括如下步驟：

(1)母液A的配制：準確稱取1.12～8.52g十八烷酸丁酯，用乙醇溶解；

(2)輔助液B的配制：用去離子水配制質量分數為10％的吐溫-80溶液；

(3)取10mL B溶液與A溶液混合，超聲波5min混勻；

(4)定容至1L，得到所述害蟲驅避劑。

本發明第三目的這樣實現的，所述害蟲驅避劑的使用方法為將所述害蟲驅避劑用乙醇或水稀釋0～8倍后，直接均勻噴灑在植株的花蕾和枝葉上。

白粉菌侵染中國月季后，在中國月季植物體內合成了一些揮發性次生代謝產物，本發明從中分離得到活性成分十八烷酸丁酯。通常情況下健康中國月季植株不會合成該化合物，只有中國月季感染白粉菌后，在白粉菌誘導下才會合成。經過嗅覺行為生物測試和田間產卵試驗，十八烷酸丁酯對害蟲，特別是甜菜夜蛾雌蟲具有很好的驅避效果。并且由于十八烷酸丁酯是天然次生代謝產物，在自然界有著完整降解途徑；因此，以十八烷酸丁酯作為主要成分制成害蟲驅避劑，從而實現害蟲的無公害防治。

附圖說明

圖1為甜菜夜蛾成蟲對健康月季揮發性成分的嗅覺反應；

圖2為甜菜夜蛾成蟲對感病月季揮發性成分的嗅覺反應；

圖3為甜菜夜蛾成蟲對健康和感病月季揮發性成分的嗅覺反應；

圖4為甜菜夜蛾成蟲在Y型管兩側枝中的停留時間；

圖5為十八烷酸丁酯對甜菜夜蛾產卵量的抑制作用；

圖中，不同小寫字母表示同一時段內十八烷酸丁酯各質量濃度分別與對照(CK)相比差異顯著(P≤0.05)；不同大寫字母表示與對照(CK)相比差異達到極顯著水平(P≤0.01)。

圖6為不同質量濃度十八烷酸丁酯對甜菜夜蛾交配雌蛾嗅覺行為的影響；

圖中，嗅覺行為生物測試中驅避率的計算公式為

RR(％)＝(N_CK－N_T)/(N_CK+N_T)×100％，

其中，RR為驅避率(repellent rate)，N_CK為乙醇對照一側的雌蛾數，N_T為十八烷酸丁酯一側的雌蛾數，N_N為未反應蟲數。采用χ²檢驗進行統計分析，P<0.05表示差異顯著。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明作進一步說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明所做的任何變換，均落入本發明保護范圍。

本發明所述的一種害蟲驅避劑包含十八烷酸丁酯。本發明可直接使用十八烷酸丁酯作為驅避劑，也可以添加溶劑及其他輔助成分。所述的溶劑為乙醇、甲醇、二氯甲烷。另外，可加入輔助成分如吐溫-80等，吐溫-80不會影響十八烷酸丁酯的驅蟲效果，但能夠增加十八烷酸丁酯在水中的溶解度、在實際使用中，加入吐溫-80的所述驅避劑可以水來稀釋。

作為本發明的一種優選，所述溶劑為乙醇。十八烷酸丁酯用乙醇配制而成的溶液的質量濃度為1.12～8.52mg/mL。

作為本發明的一種優選，所述溶液的質量濃度為4.06mg/mL。

一種所述害蟲驅避劑的制備方法包括如下步驟：

(1)母液A的配制：準確稱取1.12～8.52g十八烷酸丁酯，用乙醇溶解；

(2)輔助液B的配制：用去離子水配制質量分數為10％的吐溫-80溶液；

(3)取10mL B溶液與A溶液混合，超聲波5min混勻；

(4)定容至1L，得到所述害蟲驅避劑。

所述害蟲驅避劑的使用方法為將所述害蟲驅避劑用乙醇或水稀釋0～8倍后，直接均勻噴灑在植株的花蕾和枝葉上。

本發明所述的害蟲驅避劑對甜菜夜蛾，特別是對其雌蟲的驅避效果最佳。

本發明的工作原理：

中國月季(Rosa chinensis Jacq.，俗稱玫瑰)是世界四大鮮切花之一，深受人們喜愛，在全世界廣為栽培。但是中國月季上的病蟲害發生也十分嚴重，主要包括月季白粉菌[Sphaerotheca pannosa(Wallr.：Ex Fr.)Lév.]、甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]等。有研究表明：病害對蟲害可能存在有利的或不利的影響，并且在病蟲互作過程中，植物揮發性成分及其變化對昆蟲的寄主選擇起著至關重要的作用。白粉菌侵染中國月季對甜菜夜蛾造成影響的研究已有少量報道，已證明白粉菌對甜菜夜蛾會產生不利的影響。因此，分別提取健康月季和白粉菌侵染的月季的揮發性成分，結果表明：健康月季揮發性成分對甜菜夜蛾成蟲表現出明顯的引誘作用；感病月季揮發性成分則對甜菜夜蛾成蟲表現出明顯的驅避作用。進一步對感病月季揮發性成分進行分離鑒定，發現其中的十八烷丁酯是產生驅避作用的主要活性物質。

本發明的特點：

十八烷丁酯作為一種甜菜夜蛾用于識別感病寄主的信息化合物，用來代替化學農藥對甜菜夜蛾進行防治，不會對月季植株產生不良影響、不會導致該蟲產生抗藥性。同時，十八烷酸丁酯來自寄主植物，在自然界中有著天然的完整的降解途徑，不會對環境產生不良影響，是一種環境友好型的活性成分，具有廣闊的應用前景。

實施例1：害蟲驅避物質的發現

(1)揮發性成分的提取

采用頂空動態吸附法提取健康中國月季葉片和感染白粉菌的中國月季葉片的揮發性成分，將收集到的揮發性成分在-20℃冰箱中保存備用。

(2)甜菜夜蛾飼養方法

將采回的甜菜夜蛾老熟幼蟲放入墊有潮濕沙土的250mL燒杯中，用紗布封口，待化蛹、羽化后，將成蟲轉入另一個250mL燒杯中。用10％的蜂蜜水補充營養，使其在健康中國月季葉片上產卵、孵化，并飼養至老熟幼蟲(飼養條件：27℃、70％RH、12h光周期)。同法讓其化蛹，將蛹取出在體視鏡下區分雌雄，雌雄蛹分開飼養，羽化后用于生物測試。

(3)甜菜夜蛾成蟲嗅覺行為測試

將提取的2種揮發性成分分別用去離子水進行系列稀釋(1:0、1:100、1:200、1:500、1:800、1:1000、1:2000，揮發性成分/去離子水，V/V)，共14份溶液。使用Y型嗅覺儀進行嗅覺行為生物測試。生測選擇在室溫(25℃)、無風條件下，晚上19:00～24:00之間成蟲活動頻繁的時段進行。先將7份健康中國月季揮發性成分的溶液各取0.1mL，按稀釋倍數由大到小順序每次將1種溶液置入其中一支味源瓶中，另一支味源瓶以空氣作對照。待氣流穩定5min后，將同一天羽化的甜菜夜蛾成蟲(僅雌蟲)從基部口放入，每次8只，用具小孔(2mm)的黑紗封口防成蟲逃出。飛蛾識別并選擇后，可逆風爬向或飛向氣味源。30min后記錄Y型管兩側枝中和仍處于基部未做出反應的蟲數，從兩側枝交叉口處前進3cm或以上記作陽性反應。每種溶液重復4次，取平均值。每做完一次生測后，將樣品與對照互換位置。用過的雌蛾不再重復使用。再將從感染白粉菌的中國月季葉片中提取配制的7份揮發性成分溶液各取0.1mL，同法進行生物測定。

最后將稀釋倍數相同的2種溶液對應地置入左右兩邊的味源瓶中，即一邊是健康月季揮發性成分，另一邊是感病月季揮發性成分，共7組配對的溶液，同法進行生物測定。

(4)停留時間測定

據步驟(3)的試驗結果，分別選擇2種揮發性成分效果最佳的稀釋倍數，按此稀釋倍數重新配制溶液，進行生物測定，在健康月季揮發性成分與空氣對照、感病月季揮發性成分與空氣對照、健康月季揮發性成分與感病月季揮發性成分3個組合之間進行比較，分別記錄飛蛾的反應時間和在兩側枝中的停留時間。每次放入4只雌蛾，測定時間1h，重復4次，計算每只飛蛾總停留時間的平均值。

(5)結果

結果(圖1～3)表明：稀釋200～2000倍時，在健康月季揮發性成分一側的蟲數顯著多于空氣對照(P≤0.015)或感病月季揮發性成分(P≤0.003)一側，其停留時間也顯著長于后者(P≤0.008)，表明健康月季揮發性成分對甜菜夜蛾成蟲表現出明顯的引誘作用，其中稀釋800倍時引誘作用最強。反應蟲數和停留時間(圖4)的結果均表明：感病月季揮發性成分在所測定各劑量下均對甜菜夜蛾成蟲表現出明顯的驅避作用。因此，中國月季揮發性成分在甜菜夜蛾成蟲產卵地選擇中起著極為重要的作用，而月季植株感染白粉菌后的揮發性成分則對甜菜夜蛾成蟲表現出抑制作用。

實施例2：驅避物質的分離與鑒定

對健康和感染白粉菌的中國月季的揮發性成分，用頂空動態吸附法提取，進行GC-MS鑒定，得到中國月季活體植株揮發物的具體化學成分。如表1所示：HRP、IRP分別是從健康中國月季植株(healthy rose plant,HRP)、感染白粉菌后中國月季植株(infected rose plant,IRP)中鑒定出的揮發性成分。“－”表示未從該種材料中鑒定出。GC-MS鑒定發現：感病月季植株提取物的天然化合物中含有十八烷酸丁酯(表1：No.88)，表明它可能是甜菜夜蛾雌蛾識別感病寄主的信息化合物之一。

表1 HRP、IRP的揮發性成分的GC-MS分析

實施例3：十八烷酸丁酯的驅避作用試驗

在2支500mL燒杯內墊約3cm厚滅菌土，適量無菌水濕潤。將兩束各5支長約20cm、葉數基本相同的健康無病蟲害的新鮮中國月季枝條，分別插入2支燒杯內的土壤中，將兩燒杯分別標記為1、2號。用乙醇作溶劑將十八烷酸丁酯配制成1.12mg/mL溶液，取5mL該溶液均勻噴施1號燒杯中的枝葉，另用5mL乙醇同法噴施2號燒杯中的枝葉作對照。將兩燒杯放入細鐵絲網制成的產卵籠中，相距約50cm。

人工飼養甜菜夜蛾至化蛹，將蛹取出在體視鏡下區分雌雄，雌雄蛹分開單獨飼養至羽化。挑選7對同一天羽化、發育正常、雌雄配對的甜菜夜蛾成蟲放入籠中產卵，在枝條上懸掛蘸有適量蜂蜜水(10％)的棉花，作為成蟲營養源。每日記錄兩種枝條上的總產卵量至所有雌蛾不再產卵。每次檢查產卵數量后，更換新鮮枝條并噴灑十八烷酸丁酯溶液和無水乙醇。室溫、遮光、空氣濕度75％。統計每日產卵的總卵塊數和總產卵量。重復5次，SPSS 17.0做統計分析。另兩種濃度(4.06、8.52mg/mL)的十八烷酸丁酯溶液同法測試。結果如圖5和表2所示。

表2十八烷酸丁酯對卵塊數(塊)的影響(mean±SD)

注：不同小寫字母表示在同一質量濃度、相同時間內十八烷酸丁酯與乙醇對照(CK)相比差異顯著(P≤0.05)；不同大寫字母表示差異達到極顯著水平(P≤0.01)。驅避率根據甜菜夜蛾的卵塊數總量(Total)計算，公式為：RR(％)＝(N_CK－N_T)/(N_CK+N_T)*100％，其中，RR為驅避率(repellent rate,％)，N_CK為對照組的總卵塊數，N_T為十八烷酸丁酯處理組的總卵塊數。

圖5和表2結果顯示：無論是從卵塊數還是從產卵量來看，十八烷酸丁酯對甜菜夜蛾產卵地選擇有著十分明顯的驅避作用。當質量濃度為4.06mg/mL時驅避效果最好。按圖5中產卵量總值計算，最大驅避率為60.9％。

實施例4：甜菜夜蛾雌蟲對十八烷酸丁酯的嗅覺行為

所用的主要儀器為Y型嗅覺儀。其中的Y型管主枝22cm、兩側枝均為17cm，內徑均為5cm，兩臂夾角75度。將Y型管洗凈，用無水乙醇消毒后烘干。將Y型嗅覺儀按空氣泵、活性炭、蒸餾水、LZB-II玻璃轉子流量計、三通管、Y型管順序用硅膠管連接，水平放置，黑布遮光，調節氣流量為300mL/min。氣流交匯于Y型管主枝，從基部口流出。實驗開始前先通入潔凈空氣10分鐘。

為了氣體緩慢溢出，將裝有1.12mg/mL十八烷酸丁酯溶液的帶有小孔的小玻璃瓶，放入Y型嗅覺儀的一側枝中，另一側枝同法用乙醇作對照，并將已交配雌蛾從Y型管基部口放入，每次10只，用具2mm小孔的黑紗封口防成蟲逃出。飛蛾可逆風爬向或飛向氣味源，識別氣味源并做出反應。分別記錄30min時Y型管兩側枝中和仍處于基部中未做出反應的蟲數，從兩側枝交叉口處前進3cm及以上記作陽性反應。4.06、8.52mg/mL溶液同法測試。重復5次生測，取平均值，SPSS 17.0做統計分析。結果如圖6所示。

每做完一次生測后，交換Y型管和氣味源的方向。做完兩次測試后，將Y型管和味源瓶取下，洗凈、消毒、烘干，再做下一次生測。用過的雌蛾不再重復使用。生測在無風、室溫25℃、遮光、空氣濕度75％條件下、晚上7:00～12:00之間成蟲活動頻繁的時段進行。從基部入口處到氣味源，十八烷酸丁酯形成由小到大的濃度梯度，甜菜夜蛾交配雌蛾能識別信息化合物種類及其濃度梯度，并做出相應的反應，即與在自然界中甜菜夜蛾識別感染了白粉菌的寄主的原理一致。

由圖6可見：在嗅覺行為測試中，十八烷酸丁酯對甜菜夜蛾雌蟲顯示出明顯的驅避作用，質量濃度越大驅避效果越好。當質量濃度為4.06mg/mL時驅避率最大，達42.9％。結合產卵量測試結果可以看出，十八烷酸丁酯質量濃度在4.06mg/mL時，對甜菜夜蛾產卵和嗅覺行為的抑制作用最強。

實施例5：田間實驗

十八烷酸丁酯對甜菜夜蛾產卵的驅避活性的田間實驗在云南省昆明市呈貢區玫瑰種植基地的大棚中進行。實驗開始前14d之內不使用任何農藥，進行正常水肥管理。實驗開始時中國月季平均株高50cm，處理小區與對照小區面積各4m²，間隔2m。其中，處理小區每株用4.06mg/mL的十八烷酸丁酯溶液1mL噴施中國月季全株，對照小區僅用同體積的乙醇同法噴施。在大棚中放入10對人工飼養的雌雄配對的甜菜夜蛾成蟲，每天收集、統計蟲卵量和卵塊數，5d后統計總產卵量和總卵塊數。每濃度設3次重復。大棚中濕度75％～95％，溫度18～40℃，其他方法和條件與室內產卵量測試實驗相同。無須進行土壤和植株的消毒等工作，結果如表3所示。

從表3中卵塊數和產卵量的總值可以看出：在大棚中玫瑰種植實際生產條件下，十八烷酸丁酯同樣顯示出對甜菜夜蛾產卵的明顯的驅避作用。從產卵量來看，驅避率可達40.6％。十八烷酸丁酯對甜菜夜蛾雌蛾的驅避作用在田間實驗中同樣得到驗證。在驅避劑中加入吐溫-80，從驅蟲效果來看，并沒有發現顯著差異，但是它增加了十八烷酸丁酯在水中的溶解度，由此可在實際使用過程中用水作為溶劑。

表3十八烷酸丁酯活性田間實驗驗證結果

四種數據均為根據乙醇對照算出的結果。

綜上所述，十八烷酸丁酯能夠有效地對甜菜夜蛾產卵地選擇行為起到調控作用，如果甜菜夜蛾探測到十八烷酸丁酯的存在，則會避免在該植株上產卵，在甜菜夜蛾產卵地選擇過程中起到關鍵作用，可以將該信息化合物用于甜菜夜蛾等害蟲的無公害防治、應用前景廣闊。