本發(fā)明涉及植物栽培技術領域，進一步涉及蘭科植物金線蓮種子的萌發(fā)誘導技術，具體涉及一種促進金線蓮種子萌發(fā)成苗的方法。

背景技術：

金線蓮(Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.)屬于蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)植物，為地生蘭。金線蓮不僅藥用價值高，在民間素有“藥王”、“金草”等美譽，同時也是一種極具觀賞價值的室內觀賞珍品。金線蓮種子發(fā)育不全，沒有胚乳，自然條件下很難獨立萌發(fā)成苗，再加上近年自然環(huán)境遭受嚴重破壞，鳥、蟲、蛇等為害，人工的過度挖掘，使野生金線蓮瀕臨滅絕。

在這種情況下，金線蓮的人工培養(yǎng)技術顯得尤為重要，而人工培養(yǎng)條件下，種子萌發(fā)成苗仍然是整個培養(yǎng)過程的技術瓶頸之一，由于缺乏有效的誘導方法，因此現(xiàn)有技術中金線蓮種子的萌發(fā)率較低。盡管有研究者進行了大量嘗試，但目前仍未取得有效的萌發(fā)促進方法，嚴重制約了金線蓮培養(yǎng)技術的規(guī)?；瘧?。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種促進金線蓮種子萌發(fā)成苗的方法，以解決現(xiàn)有技術中金線蓮種子自然萌發(fā)成苗效率低的技術問題。

本發(fā)明要解決的另一技術問題是現(xiàn)有技術中缺乏一種促進金線蓮種子萌發(fā)成苗的人工干預手段。

本發(fā)明要解決的再一技術問題是當采用與真菌共生的手段來促進金線蓮種子萌發(fā)成苗時，缺乏一套有效的真菌獲取方法及共生培養(yǎng)條件。

本發(fā)明要解決的又一技術問題是當采用與真菌共生的手段來促進金線蓮種子萌發(fā)成苗時，有效真菌的類別不明確。

為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種促進金線蓮種子萌發(fā)成苗的方法，該方法是從金線蓮植株的根部分離真菌，再將所得的真菌與消毒后的金線蓮種子在無菌基質中共生培養(yǎng)。

作為優(yōu)選，所述從金線蓮植株的根部分離真菌包括以下步驟：取野生金線蓮根，洗凈后利用濃度為75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后無菌水洗凈；將0.5～1cm長度的根段平放在無菌的PDA平板培養(yǎng)基上，封口膜封好后于28℃條件下避光培養(yǎng)；挑取菌落，即為分離得到的真菌。

作為優(yōu)選，所述從金線蓮植株的根部分離真菌包括以下步驟：

1)取野生金線蓮根，洗凈后利用濃度為75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后無菌水洗凈；將0.5～1cm長度的根段平放在無菌的PDA平板培養(yǎng)基上，封口膜封好后于28℃條件下避光培養(yǎng)；

2)挑取菌落，通過劃線的方法進行純化，得到若干純培養(yǎng)的不同種菌落；

3)分別挑取步驟2)所得的不同種菌落，即為若干分離得到的真菌。

作為優(yōu)選，步驟3)中所挑取的菌落僅有一種，該菌是立枯絲核菌。

作為優(yōu)選，所述無菌基質中含有木屑。

作為優(yōu)選，所述無菌基質是通過以下方法制備的：取發(fā)酵的木屑基質，加入蒸餾水潤濕，分裝于培養(yǎng)瓶中滅菌，冷卻。

作為優(yōu)選，所述共生培養(yǎng)的條件為：先于28℃、黑暗條件下培養(yǎng)1周；而后以12h/d的光照時長、2000-2500Lux的光照強度、24～28℃的溫度，培養(yǎng)至種子萌發(fā)。

本發(fā)明提供了一種促進金線蓮種子萌發(fā)成苗的方法，該技術方案首先通過實驗手段發(fā)現(xiàn)金線蓮種子需與真菌共生才能萌發(fā)，在這一思路的指引下，本發(fā)明摸索了一套真菌獲取方法及共生培養(yǎng)條件，同時明確了一種在木屑基質上對金線蓮種子萌發(fā)成苗具有突出促進作用的菌株。具體來看，該方法首先從野生金線蓮的根中分離得到內生真菌，而后取混生的真菌菌落或純化的特定菌落與消毒后的金線蓮種子在無菌的木屑基質中混合，混合后先在黑暗條件下培養(yǎng)1周，而后以特定的光照時間、光照強度及溫度培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)。該技術方案極大的提升了金線蓮種子的萌發(fā)速率，同時由于其原理明確因此具有良好的可重復性。本發(fā)明為金線蓮資源保護和規(guī)?；斯づ囵B(yǎng)奠定了堅實的技術基礎。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1中種子萌發(fā)進程圖。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。

實施例1

1材料

野生金線蓮，購自江西省銅鼓縣

2研究方法

2.1內生真菌的獲得

將野生金線蓮的根采下，自來水洗凈泥沙，肥皂水浸泡10-20min，沖洗干凈，75％酒精表面消毒30s，0.1％升汞消毒5min，最后無菌水沖洗5遍。將每條根剪成若干0.5-1.0cm的根段，平放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA平板培養(yǎng)基，事先滅菌，分裝在無菌的培養(yǎng)皿中)上，每個培養(yǎng)皿接5個根段。對照組為最后一次的清洗液，涂在培養(yǎng)皿中，接種40個培養(yǎng)皿，封口膜封好放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)。

待菌長出后，通過劃線的方法進行純化。在超凈工作臺上，用接種針輕輕挑起少許菌絲，在PDA平板培養(yǎng)基上劃斜線，隨后用封口膜封好培養(yǎng)皿。觀察菌產(chǎn)生的菌落形態(tài)，合并相同形態(tài)的菌，將分離出的純菌繼續(xù)用PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，純菌接種于試管中于-20℃冰箱中保存。

待金線蓮種子成熟時，將真菌從冰箱中取出，用接種針逐一挑出真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)。培養(yǎng)7-10d后進行共生培養(yǎng)研究。

2.2真菌與種子共生培養(yǎng)

將發(fā)酵好的牛糞和木屑基質，加入少量蒸餾水，用手握基質濕潤又捏不出水即可，分裝在若干培養(yǎng)瓶中，高溫高壓滅菌冷卻，備用。

按照常規(guī)蘭科種子消毒方法對金線蓮蒴果進行消毒，用解剖刀將蒴果劃開，將種子抖落在滅好菌的牛糞和木屑基質中。分別在PDA培養(yǎng)基上截取1cm×1cm真菌小塊，放于播完種的牛糞和木屑基質中，每種真菌在2種基質中各接種3瓶?？瞻讓φ罩徊シN不接種真菌。將接完菌和種子的培養(yǎng)瓶放于28℃黑暗條件下培養(yǎng)1周，隨后培養(yǎng)條件為光照時間12h/d，光照強度為2000-2500lx，培養(yǎng)溫度26±2℃，觀察種子萌發(fā)情況。

3結果

3.1內生真菌分離

共分離得到35株真菌，去掉部分生長過于旺盛的真菌，確定了25株真菌用于共生培養(yǎng)。

3.2內生真菌與種子共生培養(yǎng)

接種15d后，有17種真菌長滿了基質，有8種真菌在基質中生長緩慢，均未見有種子膨大現(xiàn)象(見圖1中A部分、B部分)。30d，在菌絲生長緩慢的基質中有種子吸水略微膨大的現(xiàn)象，尤其是在第20號真菌在木屑基質中種子膨大明顯，可以看到菌絲明顯纏繞在種子上，60d，種子形成原球莖并開始變綠，體視顯微鏡下觀察，可見菌絲緊密接觸著原球莖(見圖1中C部分)，90d，部分原球莖頂部分化出芽，并開始伸長，長出莖，但是原球莖變綠數(shù)量不到原球莖總數(shù)的一半(見圖1中D部分)，120d，部分原球莖已變成幼苗，而有的原球莖老化，基部變黃(見圖1中E部分)?？瞻讓φ辗N子均不萌發(fā)，另外，在牛糞基質中，25種真菌始終未見種子的萌發(fā)(見圖1中F部分)。

實施例2

一種促進金線蓮種子萌發(fā)成苗的方法，該方法是從金線蓮植株的根部分離真菌，再將所得的真菌與消毒后的金線蓮種子在無菌基質中共生培養(yǎng)。

所述從金線蓮植株的根部分離真菌包括以下步驟：取野生金線蓮根，洗凈后利用濃度為75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后無菌水洗凈；將0.5cm長度的根段平放在無菌的PDA平板培養(yǎng)基上，封口膜封好后于28℃條件下避光培養(yǎng)；挑取菌落，即為分離得到的真菌。

所述無菌基質中含有木屑。

所述無菌基質是通過以下方法制備的：取發(fā)酵的木屑基質，加入蒸餾水潤濕，分裝于培養(yǎng)瓶中滅菌，冷卻。

所述共生培養(yǎng)的條件為：先于28℃、黑暗條件下培養(yǎng)1周；而后以12h/d的光照時長、2000Lux的光照強度、24℃的溫度，培養(yǎng)至種子萌發(fā)。

實施例3

一種促進金線蓮種子萌發(fā)成苗的方法，該方法是從金線蓮植株的根部分離真菌，再將所得的真菌與消毒后的金線蓮種子在無菌基質中共生培養(yǎng)。

所述從金線蓮植株的根部分離真菌包括以下步驟：

1)取野生金線蓮根，洗凈后利用濃度為75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后無菌水洗凈；將1cm長度的根段平放在無菌的PDA平板培養(yǎng)基上，封口膜封好后于28℃條件下避光培養(yǎng)；

2)挑取菌落，通過劃線的方法進行純化，得到若干純培養(yǎng)的不同種菌落；

3)從步驟2)所得的若干菌落中挑取立枯絲核菌菌落，即為分離得到的真菌。

所述無菌基質是通過以下方法制備的：取發(fā)酵的木屑基質，加入蒸餾水潤濕，分裝于培養(yǎng)瓶中滅菌，冷卻。

所述共生培養(yǎng)的條件為：先于28℃、黑暗條件下培養(yǎng)1周；而后以12h/d的光照時長、2500Lux的光照強度、28℃的溫度，培養(yǎng)至種子萌發(fā)。

實施例4

一種促進金線蓮種子萌發(fā)成苗的方法，該方法是從金線蓮植株的根部分離真菌，再將所得的真菌與消毒后的金線蓮種子在無菌基質中共生培養(yǎng)。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。