本發明提供一種莼菜叢生芽的誘導方法，屬于植物組織培養
技術領域：
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背景技術：
：莼菜，屬睡蓮科的一種水草，列入中國國家Ⅰ級重點保護野生植物（國務院1999年8月4日批準），是珍貴的野生水生蔬菜，含有酸性多糖、蛋白質、氨基酸、維生素、組胺和微量元素等，其價值主要體現在醫用價值和食用價值。莼菜含有豐富的膠質蛋白、碳水化合物，脂肪、多種維生素和礦物質，常食莼菜具有藥食兩用的保健作用，是珍貴的水生蔬菜之一。但是由于多年未做有效的品種提純復壯和品種保護，莼菜種性退化已經比較嚴重，質量和產量都在下降。目前尚缺乏成熟技術，可以大規模擴繁莼菜優質工程苗，同時克服該物種在自然環境中種源有限且品種逐漸退化的問題。技術實現要素：本發明提供了一種莼菜叢生芽誘導的培養基及誘導方法，該方法是在無菌條件下，采取控溫措施，給予固定光照，誘導莼菜叢生芽，逐步成績無菌苗體系，后期可常年提供大量無菌幼苗。方法易行，操作方便，產量高。為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施：一種莼菜叢生芽的誘導方法，包括以下步驟：A、外植體選擇與預處理：選擇顏色鮮綠、淤泥覆蓋少的可萌發腋芽的莼菜莖段作為外植體，用堿性洗滌劑浸泡10min，用軟毛刷輕輕刷掉表面淤泥至莖段呈綠色，用自來水沖洗1小時，用蒸餾水反復沖洗4-5次，用無菌水再反復清洗4-5次，待用；B、外植體滅菌：在無菌操作臺上首先用75%乙醇浸泡30秒，用無菌水沖洗4-5次，再用0.1%氯化汞(加入幾滴吐溫80)進行表面消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5次，在無菌濾紙上將水吸干，待用；C、芽誘導：選擇1.0mg/L6-BA和0.15mg/LNAA的MS固體培養基，蔗糖質量濃度為3%，活性炭質量濃度為0.4%，pH調至5.8-6.0，固體培養基裝于組培瓶中；固體培養基經過120℃滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌后的1-1.5cm的莼菜外植體，加入無菌水超過固體培養基面3-4cm，置于光照培養箱中培養，待幼芽長至2.0-3.0cm進行增殖培養；D、芽增殖培養：選擇蔗糖質量濃度3%，活性炭質量濃度為0.4%的MS固體培養基，添加0.5-2.00mg/L6-BA、2-4mg/L2,4-D、0.1-0.50mg/LNAA的激素；培養基分裝、培養基滅菌方式與芽誘導相同，加入無菌水超過固體培養基面3-4cm，接入長2.0-3.0cm的幼芽于光照培養箱中，進行增殖培養；所述的步驟C、D均為無菌環境，光照60-70μE/（m2·s），光照周期為12h/d，室內溫度（25±2）℃。優選的，步驟B中，用0.1%氯化汞（加入幾滴吐溫80）進行表面消毒10min，步驟C中，6-BA的濃度為1.0mg/L，NAA的濃度為0.15mg/L。本發明具有以下有益效果：目前關于莼菜組織培養的技術未見報道，也沒有系統的對莼菜作出研究。該技術能直接誘導莼菜幼芽的生長，不斷產生叢生芽，為莼菜無菌繁殖體系的建立提供技術攻關。莼菜一年四季均可栽植，尤以春季萌發前移栽成活率最高，又可當年收獲，利用本發明可以不受季節、溫度、地域影響，獲得大量的叢生芽，后期再進行生根培養等，可快速建立莼菜的無菌繁殖體系，為保持莼菜優良的種性提供技術支持，可為廣大的養殖戶提供源源不斷地無菌種苗。一個為長1.5cm的外植體經過一個月的培養芽增殖系數最高可達到8倍。以一個芽30d繼代一次，每次的芽增殖系數為8計算，預期結果如下表1所示。表1天數/d3090150210270330360苗數/棵883858789811812附圖說明圖1是實施例一中莼菜30d增殖情況，圖2是實施例二中莼菜30d增殖情況。具體實施方式本發明實施例所使用的試劑，如未特別說明，市售的均可實現本發明，所涉及的技術方案，如未特別說明，均可采用本領域的常規技術。實施例中采用的MS培養基配方如下：單位mg/LKNO31900NH4NO31650MgSO4?7H2O370KH2PO4170CaCl2?2H2O440MnSO4?4H2O22.3ZnSO4?7H2O8.6H3BO36.2KI0.83Na2MoO4?7H2O0.25CuSO4.5H2O0.025CoCL2.6H2O0.025Na2-EDTA37.3FeSO4?7H2O27.8甘氨酸2.0鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫銨素0.1煙酸0.5肌酸100。MS固體培養基為上述培養配方中加入7g/L瓊脂。實施例一A、外植體選擇與預處理：選擇顏色鮮綠、淤泥覆蓋少的可萌發腋芽的莼菜莖段作為外植體，用堿性洗滌劑浸泡10min，用軟毛刷輕輕刷掉表面淤泥至莖段呈綠色，用自來水沖洗1小時，用蒸餾水反復沖洗4-5次，用無菌水再反復清洗4-5次，待用；B、外植體滅菌：在無菌操作臺上首先用75%乙醇浸泡30秒，用無菌水沖洗4-5次，再用0.1%氯化汞(加入幾滴吐溫80)進行表面消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5次，在無菌濾紙上將水吸干，待用；C、芽誘導：選擇1.0mg/L6-BA和0.15mg/LNAA的MS固體培養基，蔗糖質量濃度為3%，活性炭質量濃度為0.4%，pH調至5.8-6.0，固體培養基裝于組培瓶中；固體培養基經過120℃滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌后的1-1.5cm的莼菜外植體，加入無菌水超過固體培養基面3-4cm，置于光照培養箱中培養，待幼芽長至2.0-3.0cm進行增殖培養；D、芽增殖培養：選擇蔗糖質量濃度3%，活性炭質量濃度為0.4%的MS固體培養基，添加0.5mg/L6-BA、4mg/L2,4-D、0.1mg/LNAA的激素；培養基分裝、培養基滅菌方式與芽誘導相同，加入無菌水超過固體培養基面3-4cm，接入長2.0-3.0cm的幼芽于光照培養箱中，誘導大量叢生芽；所述的步驟C、D、均采用無菌環境，光照60-70μE/（m2·s），光照周期為12h/d，室內溫度（25±2）℃。本方法可以由一個外植體直接誘導出幼芽，再不斷繁殖得到更多的叢芽，30d的增殖系數達到8，存活率大于90%。圖1是實施例一中莼菜30d增殖情況。實施例二A、外植體選擇與預處理：選擇顏色鮮綠、淤泥覆蓋少的可萌發腋芽的莼菜莖段作為外植體，用堿性洗滌劑浸泡10min，用軟毛刷輕輕刷掉表面淤泥至莖段呈綠色，用自來水沖洗1小時，用蒸餾水反復沖洗4-5次，用無菌水再反復清洗4-5次，待用；B、外植體滅菌：在無菌操作臺上首先用75%乙醇浸泡30秒，用無菌水沖洗4-5次，再用0.1%氯化汞(加入幾滴吐溫80)進行表面消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5次，在無菌濾紙上將水吸干，待用；C、芽誘導：選擇1.0mg/L6-BA和0.15mg/LNAA的MS固體培養基，蔗糖質量濃度為3%，活性炭質量濃度為0.4%，pH調至5.8-6.0，固體培養基裝于組培瓶中；固體培養基經過120℃滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌后的1-1.5cm的莼菜外植體，加入無菌水超過固體培養基面3-4cm，置于光照培養箱中培養，待幼芽長至2.0-3.0cm進行增殖培養；D、芽增殖培養：選擇蔗糖質量濃度3%，活性炭質量濃度為0.4%的MS固體培養基，添加2.00mg/L6-BA、2mg/L2,4-D、0.50mg/LNAA的激素；培養基分裝、培養基滅菌方式與芽誘導相同，加入無菌水超過固體培養基面3-4cm，接入長2.0-3.0cm的幼芽于光照培養箱中，進行增殖培養；所述的步驟C、D均采用無菌環境，光照60-70μE/（m2·s），光照周期為12h/d，室內溫度（25±2）℃。本方法由一個外植體直接誘導出幼苗，30d的增殖系數可以達到6倍，存活率大于85%。圖2是實施例二中莼菜30d增殖情況。本發明采用現代生物技術手段，對莼菜進行組織培養誘導叢生芽，逐步建立快速繁殖無菌體系，使優良品種能迅速推廣種植，生產成本低，培養周期短，實現工廠化生產的目的，具有廣闊的應用前景和較高的推廣價值，經濟效益顯著。當前第1頁1 2 3