本發明涉及農業生物技術中植物組織培養的方法，具體地說，涉及苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法。

背景技術：

苗族藥材槍墻葉即青莢葉(Helwingia japonica.japonica)，為山茱萸科青莢葉屬落葉灌木。青莢葉屬有青莢葉、中華青莢葉、西藏青莢葉、浙江青莢葉和峨眉青莢葉等5種，主要分布于亞洲東部的尼泊爾、錫金、不丹、印度北部、緬甸北部、越南北部、中國和日本等國。我國5種均產，主要分布于陜西、河南、長江流域及華南地區等海拔1500米以上的原始森林中。由于青莢葉雌花無梗，花和果實在葉面中央的主脈上生長，又被稱為葉上花或葉上果。其根莖葉入藥，具有舒筋活絡、調經、止咳等功效，苗族民間常以葉上花、無花果、月季花搭配治療月經不調,以葉上花、矮陀陀、土三七搭配治療勞傷,單獨使用青莢葉來治療年久咳喘。此外，青莢葉為落葉小灌木，雌雄異株，雌株的花和雄株的果均具有很強的直觀性，這種奇特的現象總能吸引路人的駐足觀賞。景觀配置上，種植在陰濕肥沃處，如配植紫丁香、垂絲海棠樹下，或種植于水塘、墻邊或臺階前，或盆栽于室內，均有良好的觀賞效果。

目前，青莢葉尚處于引種階段，少量栽培于貴州、廣西苗族地區。青莢葉主要采用種子繁殖，但由于其種子常被鳥類采食，難以獲得足夠用于繁殖的種子。因此，為了解決青莢葉規?；N植中其種苗缺乏的問題，有必要建立青莢葉的組織培養快繁體系，本發明選擇青莢葉帶節莖段為外植體，經不定芽誘導培養、繼代培養、生根培養以及移栽等步驟，實現了苗族藥材青莢葉的快速繁殖。本發明具成本低、工藝簡單、成苗快等特點，可直接用于青莢葉種苗的工廠化生產，對于青莢葉的遺傳改良和種質資源保護具有重要的現實意義。

目前，國內外尚未有青莢葉組織培養技術的報道，也未有青莢葉組培快繁專利的申請。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法，本發明選擇青莢葉帶節莖段為外植體，經不定芽誘導培養、繼代培養、生根培養以及移栽等步驟，實現了苗族藥材青莢葉的快速繁殖，從而實現了本發明的目的。

本發明提供的技術方案為：一種苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法，包括依次進行的如下步驟：獲取青莢葉的外植體、不定芽誘導、不定芽的繼代培養、不定芽的生根培養、試管苗移栽；

所述的不定芽誘導的誘導培養基包括：MS培養基、0.5～1.0mg/L ZT、0.1～0.3mg/L NAA、25～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L瓊脂、0.5～1.0g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的不定芽誘導的方法為：將青莢葉的外植體經清洗消毒處理后切成1.0～1.5cm左右的帶節莖段并接種到誘導培養基中，在25～28℃進行全暗培養25～30天即可誘導形成不定芽。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，不定芽的繼代培養所用的繼代培養基包括：MS培養基、0.5～1.0mg/L 6-BA、0.1～0.5mg/L NAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L瓊脂、0.1～0.5g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的不定芽的繼代培養的方法具體為：將經過不定芽誘導得到的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到繼代培養基中培養25～30天即可實現不定芽的繼代。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，不定芽的生根培養所用的生根培養基包括：1/2MS、0.1～0.3mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/L IBA、0.5～1.0mg/L NAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L瓊脂，pH為5.4～5.8。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的不定芽的生根培養的方法為：將經過不定芽的繼代培養得到的長約2.0～3.0cm的不定芽從基部切取并接種到生根培養基中培養25～30天即能實現試管苗的生根。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的試管苗移栽的方法具體為：將經過不定芽的生根培養得到的生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1～3天，洗凈根部的培養基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹皮混合基質中栽培成苗即得種苗。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，所述的不定芽誘導、不定芽的繼代培養的培養條件均為：培養溫度為25～28℃，光照強度為2000～2500lx，光照時間為10～12小時/天。

在上述的苗族藥材青莢葉的快速繁殖方法中，獲取青莢葉的外植體的具體方法為：在野外選取生長健壯、無病害的青莢葉植株的帶節莖段為外植體，采集后立即進行保水保濕處理。

有益效果：

本發明利用植物組織培養技術實現了苗族藥材青莢葉的快速繁殖，本發明具成本低、工藝簡單、成苗快等特點，成活率達到91％以上，可直接用于青莢葉種苗的工廠化生產。

具體實施方式

下面結合具體實施方式，對本發明的技術方案作進一步的詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。

實施例一

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無病害的青莢葉植株的帶節莖段為外植體，采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。

(2)不定芽誘導：當步驟(1)采集回實驗室外植體先用10％的洗衣粉溶液清洗3次后，在自來水下沖洗20分鐘后置于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒15秒鐘，無菌水沖洗2次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分鐘，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.0～1.5cm左右的帶節莖段并接種到不定芽誘導培養基中，在25℃進行全暗培養25天即可誘導形成不定芽，誘導率為82.8％，污染率低于20％。所述的不定芽誘導培養基為：MS培養基+1.0mg/L ZT(玉米素)+0.3mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，pH為5.4。

(3)繼代培養：將步驟(2)誘導得到的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到繼代培養基中培養25天即可實現不定芽的繼代，增殖系數達到7倍。所述的繼代培養基為：MS培養基+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.1g/L活性炭，pH為5.4。

(4)生根培養：將步驟(3)繼代得到的長約2.0～3.0cm的不定芽從基部切取并接種到生根培養基中培養25天即能實現試管苗的生根，生根率為89.5％。所述的生根培養基為：1/2MS+0.3mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA+1.0mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂，pH為5.4。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗1天，洗凈根部的培養基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹皮混合基質中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為91.8％。

上述步驟(3)～(4)的培養條件為：培養溫度為25℃，光照強度為2000lx，光照時間為10小時/天。

實施例二

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無病害的青莢葉植株的帶節莖段為外植體，采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。

(2)不定芽誘導：當步驟(1)采集回實驗室外植體先用10％的洗衣粉溶液清洗4次后，在自來水下沖洗25分鐘后置于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒23秒鐘，無菌水沖洗2次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒24分鐘，無菌水沖洗4次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.0～1.5cm左右的帶節莖段并接種到不定芽誘導培養基中，在27℃進行全暗培養27天即可誘導形成不定芽，誘導率為81.3％，污染率低于15％。所述的不定芽誘導培養基為：MS培養基+0.8mg/L ZT(玉米素)+0.2mg/L NAA+23g/L蔗糖+3.7g/L瓊脂+0.7g/L活性炭，pH為5.6。

(3)繼代培養：將步驟(2)誘導得到的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到繼代培養基中培養27天即可實現不定芽的繼代，增殖系數達到6倍。所述的繼代培養基為：MS培養基+0.7mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.7g/L瓊脂+0.3g/L活性炭，pH為5.6。

(4)生根培養：將步驟(3)繼代得到的長約2.0～3.0cm的不定芽從基部切取并接種到生根培養基中培養28天即能實現試管苗的生根，生根率為90％。所述的生根培養基為：1/2MS+0.2mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.8mg/L NAA+17g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂，pH為5.6。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗2天，洗凈根部的培養基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹皮混合基質中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為93％。上述步驟(3)～(4)的培養條件為：培養溫度為26℃，光照強度為2700lx，光照時間為11小時/天。

實施例三

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無病害的青莢葉植株的帶節莖段為外植體，采集后立即進行保水保濕處理并及時帶回實驗室。

(2)不定芽誘導：當步驟(1)采集回實驗室外植體先用10％的洗衣粉溶液清洗5次后，在自來水下沖洗30分鐘后置于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒30秒鐘，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后切成1.0～1.5cm左右的帶節莖段并接種到不定芽誘導培養基中，在28℃進行全暗培養30天即可誘導形成不定芽，誘導率為80.9％，污染率為9.2％。所述的不定芽誘導培養基為：MS培養基+0.5mg/L ZT(玉米素)+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+1.0g/L活性炭，pH為5.8。

(3)繼代培養：將步驟(2)誘導得到的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到繼代培養基中培養30天即可實現不定芽的繼代，增殖系數達到5倍。所述的繼代培養基為：MS培養基+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，pH為5.8。

(4)生根培養：將步驟(3)繼代得到的長約2.0～3.0cm的不定芽從基部切取并接種到生根培養基中培養30天即能實現試管苗的生根，生根率為86.1％。所述的生根培養基為：1/2MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂，pH為5.8。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗3天，洗凈根部的培養基移栽于體積比為1:1的腐殖土、樹皮混合基質中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為93.7％。

上述步驟(3)～(4)的培養條件為：培養溫度為28℃，光照強度為2500lx，光照時間為12小時/天

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。