本發明屬于生物農藥領域，具體涉及防治蘋果樹腐爛病的生物農藥，還涉及該農藥的制備方法和應用。
背景技術：
：蘋果樹腐爛病菌(CytosporamandshuricaMiura)屬于子囊菌綱，座囊菌目，囊抱菌屬。蘋果樹腐爛病俗稱水爛病、爛果病、爛皮病，該病在美國、加拿大、日本和我國均有發生，我國尤以遼寧、山東、河北發病嚴重。腐爛病菌寄生范圍很廣，除蘋果外還能為害梨、桃、李、杏等多種果樹。蘋果樹腐爛病菌主要危害果實。發病初期在果面部分出現圓形、黑至黑褐色小斑，逐漸擴大成輪紋狀。隨著癥狀的進一步發展，病斑呈淡褐至黑褐色，整個果實即變為水漬狀軟化腐爛。發病后期在病斑表面形成黑色小粒點狀的分生抱子器，偶爾從抱子器中溢出白色線頭狀抱子角。蘋果樹腐爛病菌不僅侵染田間生長的蘋果，引起20％-30％的爛果，由于其潛伏侵染特性，還可引起蘋果采后腐爛，成為貯藏期的重要病害，嚴重影響果實的產質量，給果農造成了很大的經濟損失。目前蘋果樹腐爛病在生產上主要以化學藥劑防治為主，而化學農藥的廣泛應用使公眾越來越擔心其安全性和對環境造成的污染問題；同時化學防治容易引起抗藥性產生，大量使用時會造成農藥殘留物超標，危害人類及其他生物的生存，引起環境污染，破壞生態平衡。隨著人們環保意識的增強和對綠色無公害農產品需求的擴大，使得植物病害的生物防治越來越受到人們的關注，生物防治因其具有對環境、生態和人類健康安全的優點，在世界各國得到了廠泛的重視并發揮著越來越重要的作用。利用生物農藥防治植物病害是當今植病界十分活躍的研究領域之一，并已顯示出良好的應用前景。生物農藥是公認的很有前途的生防因子。生物農藥以其種類和數量眾多、分布廣泛、作用方式多樣、對非靶標生物安全及不污染環境等優點而倍受重視。在國內外的研究中，利用生物農藥防治植物病害特別是土傳病害的報道很多且都取得了良好的效果。但目前并未見用于防治蘋果樹腐爛病菌的生物農藥。技術實現要素：本發明的目的之一在于提供一種防治蘋果樹腐爛病的生物農藥，它具有安全、防治蘋果樹腐爛病效果好，環境友好等特點，降低了多菌靈的使用次數，減少多菌靈的抗性藥；本發明的目的之二在于提供防治蘋果樹腐爛病的生物農藥的制備方法，工藝簡單，適合于工業生產；本發明的目的之三在于提供生物農藥在防治蘋果樹腐爛病中的應用。為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：1、防治蘋果樹腐爛病的生物農藥，其特征在于，按重量百分比計由以下組分組成：乳酸菌發酵液200-300倍稀釋液5％-10％、酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液200-300倍稀釋液10％-25％，細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液10％-25％，煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物3％-5％，余量為水。優選的，按重量百分比計由以下組分組成：乳酸菌發酵液200-300倍稀釋液6％-8％、酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液200-300倍稀釋液15％-23％，細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液12％-20％，煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物3.5％-4.5％，余量為水。優選的，按重量百分比計由以下組分組成：乳酸菌發酵液200-300倍稀釋液7％、酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液200-300倍稀釋液18％，細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液15％，煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物4％，余量為水。本發明中，所述乳酸菌發酵液由以下方法制備：將乳酸菌劃線培養后挑取單菌落接種于液體培養基內，然后在25-35℃下在搖床中培養20-30小時獲得種子液，然后將種子液按重量比為l:8-20接種于液體培養基內，再在25-35℃下在搖床中60-80小時得乳酸菌發酵液；所述酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液由以下方法制備：將酪酸梭狀芽孢桿菌劃線培養后挑取單菌落于液體培養基內，在25-35℃下在搖床中培養20-30小時獲得種子液，然后將種子液按重量比為l:8-20接種于液體培養基內，再在25-35℃下在搖床中60-80小時得酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液；所述細黃連霉菌發酵液由以下方法制備：將細黃連霉菌劃線培養后挑取單菌落于液體培養基內，在25-35℃下在搖床中培養30-80小時獲得種子液，然后將種子液按重量比為l:8-20接種于液體培養基內，再在25-35℃下在搖床中60-80小時得細黃連霉菌發酵液；所述煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物由以下方法制備：按重量比為1～2:1～2:1～2分別取煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草干品混合，加入相當于混合物重量3～5倍的水浸泡1～3小時，然后90～100℃保持10～30分鐘，冷卻，過濾棄殘渣，收集濾液即可。進一步，所述液體培養基由以下方法制備：按重量份取淀粉10-30份，牛肉膏10-30份，蛋白胨10-30份，NaCl4-8份，水1000-3000份；充分溶解后加入NaOH調pH至7-7.5，過濾，經濕熱滅菌，冷卻至18～35℃即得液體培養基。2、所述防治蘋果樹腐爛病的生物農藥的制備方法，包括如下步驟：a、按配方取乳酸菌發酵液的200-300倍稀釋液，然后加入配方量的酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液200-300倍稀釋液和細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液，獲得培養液A；b、按重量比為1～2:1～2:1～2分別取煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草干品混合，加入相當于混合物重量3～5倍的水浸泡1～3小時，然后90～100℃保持10～30分鐘，冷卻，過濾棄殘渣，收集濾液獲得煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物；c、將培養液A與煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物混合攪拌均勻后，于30℃-50℃放置48h以上即得防治蘋果樹腐爛病的生物農藥。本發明中，所述乳酸菌發酵液由以下方法制備：將乳酸菌劃線培養后挑取單菌落接種于液體培養基內，然后在25-35℃下在搖床中培養20-30小時獲得種子液，然后將種子液按重量比為l:8-20接種于液體培養基內，再在25-35℃下在搖床中60-80小時得乳酸菌發酵液；所述酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液由以下方法制備：將酪酸梭狀芽孢桿菌劃線培養后挑取單菌落于液體培養基內，在25-35℃下在搖床中培養20-30小時獲得種子液，然后將種子液按重量比為l:8-20接種于液體培養基內，再在25-35℃下在搖床中60-80小時得酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液；所述細黃連霉菌發酵液由以下方法制備：將細黃連霉菌劃線培養后挑取單菌落于液體培養基內，在25-35℃下在搖床中培養30-80小時獲得種子液，然后將種子液按重量比為l:8-20接種于液體培養基內，再在25-35℃下在搖床中60-80小時得細黃連霉菌發酵液。優選的，所述液體培養基由以下方法制備：按重量份取淀粉10-30份，牛肉膏10-30份，蛋白胨10-30份，NaCl4-8份，水1000-3000份；充分溶解后加入NaOH調pH至7-7.5，過濾，經濕熱滅菌，冷卻至18～35℃即得液體培養基。本發明的有益效果在于：本發明通過將拮抗細菌發酵液與中藥提取物按一定比例制成微生物農藥，具有防效好、安全、環境友好等特點，降低了化學農藥的使用次數，減少抗性藥，是生產綠色食品所必須的生物農藥。為了證明本發明對蘋果樹腐爛病的效果進行了多次試驗，防治效果效好，試驗結果如下：田間實驗4年總計實驗示范339畝2524棵有腐爛病的蘋果樹，每棵樹只噴施一次，實驗結果表明，本發明對蘋果腐爛病當年治愈率為100％，次年有20棵蘋果樹腐爛病復發，復發率為0.79％，最高復發率為0.84％，最低復發率為0.64％。具體實施方式下面將對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。實施例1防治蘋果樹腐爛病的生物農藥，按重量百分比計由以下組分組成：乳酸菌發酵液200-300倍稀釋液5％、酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液200-300倍稀釋液10％，細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液10％，煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物3％，余量為水。其中乳酸菌發酵液由以下方法制備：取固體瓊脂平板培養基，將乳酸菌接種于固體瓊脂平板培養基，在25℃下培養30小時得菌落；取單菌落，接種于滅菌液體培養基內在25℃下在搖床中培養20小時，制成種子液；將種子液接種到滅菌液體培養基內，25℃下在搖床中60小時得乳酸菌發酵液；種子液與液體培養基的重量份數比為l:8。酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液由以下方法制備：取固體瓊脂平板培養基，將酪酸梭狀芽孢桿菌接種于固體瓊脂平板培養基，在25℃下培養30小時得菌落；取單菌落，接種于滅菌液體培養基內在25℃下在搖床中培養20小時，制成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，25℃下在搖床中60小時得酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l:8；細黃連霉菌發酵液由以下方法制備：取固體瓊脂平板培養基，將細黃連霉菌接種于固體瓊脂平板培養基，在25℃下培養30小時得菌落；取單菌落，接種于滅菌液體培養基內在25℃下在搖床中培養20小時，制成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，25℃下在搖床中60小時得細黃連霉菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l:8。所述煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物由以下方法制備：按重量份分別取花椒、馬鞭草和煙絲干品各1份，加水10份浸泡2小時后100℃保持10分鐘，冷卻，過濾棄殘渣，收集濾液即可。防治蘋果樹腐爛病的生物農藥制備方法：a、按配方取乳酸菌發酵液的200-300倍稀釋液，然后加入配方量的枯草芽抱桿菌發酵液200-300倍稀釋液和細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液，獲得培養液A；b、按重量份分別取花椒、馬鞭草和煙絲干品各1份，加水10份浸泡2小時后100℃保持10分鐘，冷卻，過濾棄殘渣，收集濾液獲得煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物；c、將培養液A與煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物混合攪拌均勻后，于30℃放置48h以上即得防治蘋果樹腐爛病的生物農藥。本實施例中，固體瓊脂平板培養基是由下述制備方法制得：按重量份取1份胰蛋白胨，0.5份酵母提取物，0.5份氯化鈉，1份瓊脂和水800份，混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7，過濾，裝瓶封口后進行濕熱滅菌，無菌操作倒入平板，冷卻至室溫得固體培養基。本實施例中，液體培養基是由下述制備方法制得：按重量份取淀粉10份，牛肉膏10份，蛋白胨10份，NaCl4份和水1000份；混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7，過濾，裝瓶封口后進行濕熱滅菌，冷卻至室溫得液體培養基。其中，濕熱滅菌是裝瓶封口的培養基放入高壓蒸汽滅菌鍋內，0.8kg/cm2，115℃，15min濕熱滅菌。實施例2防治蘋果樹腐爛病的生物農藥，按重量百分比計由以下組分組成：乳酸菌發酵液200-300倍稀釋液10％、枯草芽抱桿菌發酵液200-300倍稀釋液25％，細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液25％，煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物5％，余量為水。其中乳酸菌發酵液由以下方法制備：取固體瓊脂平板培養基，將乳酸菌接種于固體瓊脂平板培養基，在30℃下培養36小時得菌落；取單菌落，接種于滅菌液體培養基內在30℃下在搖床中培養24小時，制成種子液；將種子液接種到滅菌液體培養基內，25℃下在搖床中72小時得乳酸菌發酵液；種子液與液體培養基的重量份數比為l:9。酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液由以下方法制備：取固體瓊脂平板培養基，將酪酸梭狀芽孢桿菌接種于固體瓊脂平板培養基，在30℃下培養36小時得菌落；取單菌落，接種于滅菌液體培養基內在30℃下在搖床中培養24小時，制成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，30℃下在搖床中72小時得酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l:9；所述細黃連霉菌發酵液由以下方法制備：取固體瓊脂平板培養基，將細黃連霉菌接種于固體瓊脂平板培養基，在30℃下培養36小時得菌落；取單菌落，接種于滅菌液體培養基內在30℃下在搖床中培養24小時，制成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，30℃下在搖床中72小時得細黃連霉菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l:9。所述煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物由以下方法制備：按重量份分別取花椒、馬鞭草和煙絲干品各1份，加水10份浸泡2小時后100℃保持20分鐘，冷卻，過濾棄殘渣，收集濾液即可。防治蘋果樹腐爛病的生物農藥制備方法：a、按配方取乳酸菌發酵液的200-300倍稀釋液，然后加入配方量的枯草芽抱桿菌發酵液200-300倍稀釋液和細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液，獲得培養液A；b、按重量份分別取花椒、馬鞭草和煙絲干品各1份，加水10份浸泡2小時后100℃保持20分鐘，冷卻，過濾棄殘渣，收集濾液獲得煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物；c、將培養液A與煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物混合攪拌均勻后，于35℃放置48h以上即得防治蘋果樹腐爛病的生物農藥。本實施例中，固體瓊脂平板培養基是由下述制備方法制得：按重量份取1份胰蛋白胨，0.5份酵母提取物，0.5份氯化鈉，1份瓊脂和水800份，混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7，過濾，裝瓶封口后進行濕熱滅菌，無菌操作倒入平板，冷卻至室溫得固體培養基。本實施例中，液體培養基是由下述制備方法制得：按重量份：取淀粉20份，牛肉膏20份，蛋白胨20份，NaCl5份，水2000份；加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7.5，過濾，裝瓶封口后進行濕熱滅菌，冷卻至室溫得液體培養基。其中，濕熱滅菌是裝瓶封口的培養基放入高壓蒸汽滅菌鍋內，0.9kg/cm2，120℃，25min濕熱滅菌。固體瓊脂平板培養基是由下述制備方法制得：1.5份胰蛋白胨，0.6份酵母提取物，0.6份氯化鈉，1.5份瓊脂，水1000份加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7.5，過濾，裝瓶封口后進行濕熱滅菌，無菌操作倒入平板，冷卻至室溫得固體培養基。實施例3防治蘋果樹腐爛病的生物農藥，按重量百分比計由以下組分組成：乳酸菌發酵液200-300倍稀釋液10％、枯草芽抱桿菌發酵液200-300倍稀釋液15％，細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液15％，煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物4％，余量為水。其中乳酸菌發酵液由以下方法制備：取固體瓊脂平板培養基，將乳酸菌接種于固體瓊脂平板培養基，在35℃下培養80小時得菌落；取單菌落，接種于滅菌液體培養基內在35℃下在搖床中培養30小時，制成種子液；將種子液接種到滅菌液體培養基內，35℃下在搖床中80小時得乳酸菌發酵液；種子液與液體培養基的重量份數比為l:20。枯草芽抱桿菌發酵液由以下方法制備：取固體瓊脂平板培養基，將酪酸梭狀芽孢桿菌接種于固體瓊脂平板培養基，在35℃下培養80小時得菌落；取單菌落，接種于滅菌液體培養基內在35℃下在搖床中培養30小時，制成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，30℃下在搖床中80小時得酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l:20；所述細黃連霉菌發酵液由以下方法制備：取固體瓊脂平板培養基，將細黃連霉菌接種于固體瓊脂平板培養基，在35℃下培養80小時得菌落；取單菌落，接種于滅菌液體培養基內在35℃下在搖床中培養30小時，制成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，30℃下在搖床中80小時得細黃連霉菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l:20。所述煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物由以下方法制備：按重量份分別取花椒、馬鞭草和煙絲干品各1份，加水10份浸泡2小時后100℃保持30分鐘，冷卻，過濾棄殘渣，收集濾液即可。防治蘋果樹腐爛病的生物農藥制備方法：a、按配方取乳酸菌發酵液的200-300倍稀釋液，然后加入配方量的枯草芽抱桿菌發酵液200-300倍稀釋液和細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液，獲得培養液A；b、按重量份分別取花椒、馬鞭草和煙絲干品各1份，加水10份浸泡2小時后100℃保持30分鐘，冷卻，過濾棄殘渣，收集濾液獲得煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物；c、將培養液A與煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物混合攪拌均勻后，于50℃放置48h以上即得防治蘋果樹腐爛病的生物農藥。本實施例中，液體培養基是由下述制備方法制得：按重量份：取淀粉30份，牛肉膏30份，蛋白胨30份，NaCl8份，水3000份；加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7.5，過濾，裝瓶封口后進行濕熱滅菌，冷卻至室溫得液體培養基。其中，濕熱滅菌是裝瓶封口的培養基放入高壓蒸汽滅菌鍋內，1.05kg/cm2，130℃，30min濕熱滅菌。固體瓊脂平板培養基是由下述制備方法制得：2份胰蛋白胨，1份酵母提取物，1份氯化鈉，1.5份瓊脂，水1000份加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7.5，過濾，裝瓶封口后進行濕熱滅菌，無菌操作倒入平板，冷卻至室溫得固體培養基。實施例4防治蘋果樹腐爛病的生物農藥，按重量百分比計由以下組分組成：乳酸菌發酵液200-300倍稀釋液7％、枯草芽抱桿菌發酵液200-300倍稀釋液18％，細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液15％，煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物4％，余量為水。實施例5防治蘋果樹腐爛病的生物農藥，按重量百分比計由以下組分組成：乳酸菌發酵液200-300倍稀釋液6％、枯草芽抱桿菌發酵液200-300倍稀釋液15％，細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液12％，煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物3.5％，余量為水。實施例6防治蘋果樹腐爛病的生物農藥，按重量百分比計由以下組分組成：乳酸菌發酵液200-300倍稀釋液8％、枯草芽抱桿菌發酵液200-300倍稀釋液23％，細黃連霉菌發酵液200-300倍稀釋液20％，煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物4.5％，余量為水。應用實施例：為了證明本發明的生物農藥對蘋果樹腐爛病的效果進行了多次試驗，防治效果效好，用本發明制得的生物農藥進行實驗，同時設置四組平行對照試驗，對照A的生物農藥配方不含乳酸菌發酵液，對照B的生物農藥配方不含酪酸梭狀芽孢桿菌發酵液，對照C的生物農藥配方不含細黃連霉菌發酵液，對照D的生物農藥配方不含煙絲、鐵馬蓮和馬鞭草混合物提取物，其余同實施例1。每組田間實驗4年總計實驗示范339畝2508棵有腐爛病的蘋果樹，每棵樹只噴施一次，試驗結果如表1-5。表1.本發明的生物農藥田間試驗結果年份病樹當年治愈治愈率次年復發復發率2013502502100％40.80％2014532532100％50.94％2015676622100％40.59％2016798792100％60.75％平均627627100％50.80％總計25082508100％200.80％表2.對照A的生物農藥田間試驗結果年份病樹當年治愈治愈率次年復發復發率201350247194％70.88％201453250495％50.94％201567663594％91.3％201679876596％111.4％平均627593.7594.7％51.2％總計2508237594.7％201.2％表3.對照B的生物農藥田間試驗結果年份病樹當年治愈治愈率次年復發復發率201350248997.6％71.4％201453250695.3％81.5％201567665797.3％91.3％201679876395.9％111.4％平均62760496.5％8.751.4％總計2508241696.5％351.4％表4.對照C的生物農藥田間試驗結果年份病樹當年治愈治愈率次年復發復發率201350248596.8％81.6％201453250294.5％81.5％201567665396.7％101.5％201679875694.8％121.5％平均62759995.7％9.51.5％總計2508239695.7％381.5％表5.對照D的生物農藥田間試驗結果年份病樹當年治愈治愈率次年復發復發率201350247294.0％81.6％201453248190.4％91.7％201567660289.1％121.8％201679870988.8％151.9％平均62756690.6％111.7％總計2508226490.6％441.7％上述結果表明，本發明農藥治愈率高，復發率低；本發明對蘋果樹腐爛病當年治愈率為100％，次年有20棵蘋果樹腐爛病復發，復發率為0.80％，最高復發率為0.94％不超過1％，最低復發率為0.59％，效果優于對照組。并且本發明無需多次噴施，每個疤只需一次就可康復；無需嚴格刮凈病疤，適合于大多數果農掌握和使用；此外本發明農藥無污染，適合于綠色食品生產，有利于提高果品品質。最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3