本發明涉及植物初代組織培養，具體涉及一種芫花莖段外植體初代組織培養基。

背景技術：

芫花(daphnegenkwasieb.etzucc.)為瑞香科瑞香屬落葉灌木，其花朵錦簇、花色艷麗，具有較高的觀賞價值，為我國優良野生花卉資源。同時也是我國重要的中藥材和生物農藥。

從20世紀60年代開始，尤其是90年代以后，芫花的生境遭到嚴重破壞，種群分布范圍縮小，居群數量及個體數量急劇下降，其野生可利用資源逐漸減少。研究芫花的繁殖技術成為保護和利用該植物資源的迫切要求。

芫花一般采用播種方法進行繁殖，但種子繁殖其后代性狀發生分離，無法保持母本植株的優良性狀。芫花的扦插繁殖，生根成活率低，加之穗源少，繁殖效率低，不能實現快速大量繁殖。采用組織培養方法繁殖芫花，可保持母本優良性狀，為優良單株的快速擴繁提供途徑。

目前，關于芫花的研究主要集中在其化學組分及藥理作用，以及生物農藥的研究上，在繁殖、栽培技術的相關研究較少，其莖段外植體組織培養快繁技術在國內外尚未見報道。

技術實現要素：

發明目的：針對現有技術存在的問題，本發明提供一種芫花莖段外植體初代組織培養培養基，使用該初代組織培養基對芫花莖段外植體進行初代組織培養，誘導其叢生芽，可以簡單、快捷的獲得芫花組培苗，培養周期明顯縮短，培養成功率明顯提高，并且萌芽率高，玻璃化率低。

技術方案：為了實現上述發明目的，如本發明所述一種芫花莖段初代組織培養基，包括如下組分：ms+0.1mg·l^-1naa+1.0-1.5mg·l^-1zt，加入蔗糖25-30g/l、瓊脂6.5-7g/l，調整酸堿度至ph＝5.7-5.8。

進一步地，所述的初代組織培養基，包括如下組分：ms+0.1mg·l^-1naa+1.5mg·l^-1zt，加入蔗糖30g/l、瓊脂7g/l，調整酸堿度至ph＝5.8。

所述初代組織培養基用于芫花莖段外植體的初代組織培養方法，包括如下步驟：

(1)芫花外植體的選取：采集生長健壯，腋芽飽滿，無病蟲害的芫花當年生枝條，去除全部葉片，剪截成8～10cm帶腋芽莖段作為外植體；

(2)芫花外植體的處理：將外植體用洗衣粉溶液浸泡洗滌15～20min，接著用流水沖洗8～12小時。在無菌環境下將外植體剪成4-5cm莖段進行消毒處理；消毒后用無菌水沖洗，將莖段剪成1.5～2.5cm的長度，接入芫花莖段外植體初代組織培養的培養基中；

(3)芫花外植體的培養：將步驟(2)接入初代培養基中的外植體置于培養室的培養架進行光照培養，直至誘導叢生芽萌發。

其中，步驟(2)所述洗衣粉溶液(洗衣粉為市售的普通洗衣粉)質量體積比為0.2-0.5％，浸泡時間為15～20min，接著用流水沖洗8～12h。通常洗衣粉溶液浸泡時間為20min，流水沖洗時間為12h。芫花莖干表面密被短絨毛，直接進行消毒處理殺菌效果不理想。洗衣粉溶液可有效去除粘黏在茸毛上的污物，改善消毒效果；流水沖洗可進一步洗凈粘黏在植物體表或絨毛上的污物，改善消毒效果。

步驟(2)所述消毒為先采用體積百分比濃度為70～75％乙醇溶液進行消毒，再將莖段放入1g·l^-1升汞加3-5滴吐溫80的混合溶液浸泡消毒。

進一步地，所述乙醇進行消毒的時間為30-45s，升汞加吐溫80混合溶液的浸泡消毒時間為10～14min。吐溫80為表面活性劑，可以濕潤外植體表面組織，促進殺菌劑充分接觸外植體表面組織，達到較好的消毒效果。

其中，步驟(3)所述光照培養的溫度22～25℃，光照強度2000～3000lx，相對濕度70-75％，光周期14h晝/10h夜。

步驟(3)所述光照培養的時間25-30d。

本發明所用的培養基和試劑都由市售可得。

本發明所用外植體為芫花當年生枝條，去除葉片，剪截成帶腋芽莖段其優勢在于：1.莖段外植體個體較大，消毒、清洗、剪切等試驗操作方便易行；2.莖段外植體對消毒試劑具有較強耐受能力，消毒致死率低，較其他方法更易獲得無菌試管苗。3.使用莖段外植體誘導叢生芽與愈傷組織誘導叢生芽的方法相比，其誘導叢生芽的萌發僅需打破腋芽休眠，而無須經歷脫分化與再分化過程，因而成功率較高，其培養周期也明顯縮短。

如果采用芫花其他部位為外植體(例如腋芽)，脫分化誘導愈傷組織，然后再分化形成叢生芽的方法進行初代培養。其缺點在于芫花腋芽極小(直徑在1mm以下)，其采集、剪切、夾取等操作不便；萌動的腋芽外植體組織幼嫩，對消毒劑耐受程度低，消毒致死率高。外植體采用脫分化形成愈傷組織，然后再分化形成叢生芽的過程成功率低，過程耗時長。脫分化形成愈傷組織過程通常需1-2個月或更長時間；愈傷組織再分化形成叢生芽過程通常還需1-2個月或更長時間。且植物體細胞具有全能性為理論特性，實際培養過程中體細胞能否表達其全能性為隨機事件。

有益效果：由現有技術相比，本發明具有如下優點：

本發明使用的芫花莖段外植體初代組織培養基對芫花莖段外植體進行培養，使得芫花莖段外植體萌芽率達到83.3％以上，玻璃化率低于22.3％，萌芽均高達到1.67cm以上。

本發明使用芫花莖段初代組織培養基對芫花莖段外植體進行初代組織培養誘導叢生芽，可以簡單、快捷的獲得芫花組培苗。本發明采用莖段外植體誘導叢生芽與愈傷組織誘導叢生芽方法相比，其誘導無須經歷脫分化與再分化過程，其培養周期明顯縮短。

本發明對芫花莖段外植體采用預處理洗衣粉溶液浸泡，流水沖洗。外植體消毒采用乙醇和升汞加吐溫混合溶液進行消毒的方法，可以獲得大量無菌試管苗，無菌外植體試管苗是進行初代培養的必須材料，并且污染率小、死亡率低，存活率高。

附圖說明

圖1為本發明實施例2芫花莖段外植體初代培養從接種到莖段腋芽萌發生長情況。

具體實施方式

以下結合附圖和實施例對本發明做進一步說明。

植物材料：

芫花母本植株選自江蘇省句容市，江蘇農林職業技術學院林木種質資源圃。芫花莖段外植體采自芫花實生2年生苗。

試驗地點：

江蘇農林職業技術學院園藝工程中心植物組培室。

試驗設備：

超凈工作臺(上海詠星sw-cj-2a)、培養架與控制系統(上海詠星pyj-5-2)、全光譜節能燈(上海詠星zpt-28)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海農卉yxq-ls-100sii)、空調(格力)、電子天平(梅特勒托利多al104、pl602-l)、玻璃培養瓶。

實驗藥品：

naa(1-萘乙酸1-naphthylaceticacid，c12h10o2≧98.0％，國藥)、6-ba(6-芐基氨基嘌呤6-benzylaminopurine，c12h11n5≧98.0％，國藥)、zt(玉米素trans-zeatin，c10h13n5o≧98.0％，國藥)、蒸餾水、無水乙醇(ethylalcoholabsolute，c2h6o)、氯化汞(mercury(ii)chloridehgcl2)、吐溫80、洗衣粉、瓊脂(agar，(c12h18o9)n，上海賀瑟根化工科技)、蔗糖(d(+)-sucrose，c12h22o11)、ms培養基(北京金博藍河科技)

實施例1

初代組織培養基：ms+0.1mg·l^-1naa+1.0mg·l^-1zt，加入蔗糖30g/l、瓊脂7g/l，調整酸堿度至ph＝5.8。

培養方法：

(1)芫花外植體的選取：采集生長健壯，腋芽飽滿，無病蟲害的芫花當年生枝條，去除全部葉片，剪截成10cm帶腋芽莖段作為外植體；

(2)芫花外植體的處理：將外植體用質量體積比為0.5％洗衣粉水溶液浸泡20min，接著用流水沖洗12h，在接種室的超凈工作臺無菌環境下再將外植體剪成4cm莖段，采用體積比75％乙醇水溶液消毒30s，再用1g·l^-1升汞加5滴吐溫80混合溶液浸泡12min消毒處理；消毒后用無菌水沖洗，將莖段剪成2cm的長度，莖段上剪口距芽0.5cm，下剪口距節1cm，接入初代組織培養基中；

(3)芫花外植體的培養：將步驟(2)接入初代組織培養基中的外植體置于培養室的培養架進行光照培養，溫度24℃，光照強度2500lx，相對濕度75％，光周期14h晝/10h夜，培養25d直至叢生芽萌發。

實施例2

初代組織培養基：ms+0.1mg·l^-1naa+1.5mg·l^-1zt，加入蔗糖30g/l、瓊脂7g/l，調整酸堿度至ph＝5.8。

培養方法：

(1)芫花外植體的選取：采集生長健壯，腋芽飽滿，無病蟲害的芫花當年生枝條，去除全部葉片，剪截成10cm帶腋芽莖段作為外植體；

(2)芫花外植體的處理：將外植體質量體積比為0.5％洗衣粉水溶液浸泡20min，接著用流水沖洗12h，在接種室的超凈工作臺無菌環境下再將外植體剪成4cm莖段，采用體積比75％乙醇水溶液消毒30s，再用1g·l^-1升汞加5滴吐溫80混合溶液浸泡12min消毒處理；消毒后用無菌水沖洗，將莖段剪成2cm的長度，莖段上剪口距芽0.5cm，下剪口距節1cm，接入初代組織培養基中；

(3)芫花外植體的培養：將步驟(2)接入初代組織培養基中的外植體置于培養室的培養架進行光照培養，溫度24℃，光照強度2500lx，相對濕度75％，光周期14h晝/10h夜，培養25d直至叢生芽萌發。本實施例芫花莖段外植體初代培養從接種到莖段腋芽萌發的生長情況，如圖1所示。

實施例3

初代組織培養基：ms+0.1mg·l^-1naa+1.5mg·l^-1zt，加入蔗糖25g/l、瓊脂6.5g/l，調整酸堿度至ph＝5.7。

培養方法：

(1)芫花外植體的選取：采集生長健壯，腋芽飽滿，無病蟲害的芫花當年生枝條，去除全部葉片，剪截成8cm帶腋芽莖段作為外植體；

(2)芫花外植體的處理：將外植體用質量體積比為0.2％洗衣粉水溶液浸泡20min，接著用流水沖洗12h，在接種室的超凈工作臺無菌環境下再將外植體剪成5cm莖段，采用體積比70％乙醇水溶液消毒45s，再用1g·l^-1升汞加3滴吐溫80混合溶液浸泡10min消毒處理；消毒后用無菌水沖洗，將莖段剪成2.5cm的長度，莖段上剪口距芽0.5cm，下剪口距節2cm，接入初代組織培養基中；

(3)芫花外植體的培養：將步驟(2)接入初代組織培養基中的外植體培養室的培養架進行光照培養，溫度25℃，光照強度3000lx，相對濕度75％，光周期14h晝/10h夜，培養30d直至叢生芽萌發。

實施例4

實施例4與實施例2的培養基配方和培養方法相同，不同之處在于，步驟(2)洗衣粉浸泡時間15min和流水沖洗時間10h，乙醇消毒的時間為45s，升汞加吐溫80消毒的時間為14min；步驟(3)培養溫度22℃，光照強度2000lx，相對濕度70％，光周期14h晝/10h夜，培養30d直至叢生芽萌發。

實施例5

實施例5與實施例2的培養基配方和培養方法相同，不同之處在于，洗衣粉浸泡時間18min和流水沖洗時間10h，乙醇消毒的時間為30s，升汞加吐溫80消毒的時間為12min；步驟(3)培養溫度25℃，光照強度3000lx，相對濕度75％，光周期14h晝/10h夜，培養28d直至叢生芽萌發。

實施例6

實施例5與實施例2的培養基配方和培養方法相同，不同之處在于，洗衣粉浸泡時間18min和流水沖洗時間11h，乙醇消毒的時間為40s，升汞加吐溫80消毒的時間為12min，消毒后用無菌水沖洗，將莖段剪成1.5cm的長度；步驟(3)培養溫度25℃，光照強度3000lx，相對濕度75％，光周期14h晝/10h夜，培養25d直至叢生芽萌發。

試驗例1

消毒方法對芫花莖段外植體滅菌效果的影響。

試驗相關指標計算公式如下:

污染率(％)＝外植體污染數/接種外植體總數×100；

死亡率(％)＝外植體死亡數/接種外植體總數×100；

存活率(％)＝100－污染率(％)－死亡率(％)；

萌發率(％)＝腋芽萌發的外植體數/接種外植體總數×100；

玻璃化率(％)＝玻璃化外植體數/接種外植體總數×100；

萌芽均高(cm)＝腋芽萌發的新梢基部到端部最上一節的長度之和/接種外植體總數。

試驗數據采用spss軟件進行方差分析和多重比較。

1、預處理無流水沖洗環節的消毒方法對芫花莖段外植體滅菌效果的影響：

制作ms固體培養基：稱量并溶解ms培養基所需藥品，加入蔗糖30g/l、瓊脂7g/l，采用1mol/l的naoh或hcl調整酸堿度至ph＝5.8；分裝培養基；

采用高壓蒸汽滅菌法，維持蒸汽壓103.4kpa、溫度121.3℃，滅菌20min。培養基水平放置，冷卻后備用。

選用實施例2中莖段作為外植體，預處理采用質量體積比為0.5％洗衣粉水溶液浸泡芫花莖段外植體20min；消毒采用75％乙醇30s+1g·l^-1升汞溶液8～14min進行滅菌處理。消毒后用無菌水沖洗，將莖段剪成2cm的長度，莖段上剪口距芽0.5cm，下剪口距節1cm，接入制備好的ms固體培養基；每處理30個莖段，重復3次。將接種苗置于培養室的培養架進行光照培養，保持室內溫度24℃，光照強度2500lx，相對濕度75％，光周期14h晝/10h夜，培養25d。觀察計算芫花莖段外植體滅菌效果，結果見表1。

表1預處理無流水沖洗環節的消毒方法對芫花莖段外植體滅菌效果的影響

注：同一列數據中字母(小寫)不同者表示差異顯著(p<0.05)；

由表1可知：

預處理無流水沖洗環節的消毒方法對外植體滅菌效果試驗結果表明：芫花莖段外植體消毒處理污染率為87.8～100.0％，各處理無顯著差異。由此可知，預處理過程中無流水沖洗環節的消毒方法，污染率極高，無法獲得充足的無菌試驗材料。

2、預處理加流水沖洗環節的消毒方法對芫花莖段外植體滅菌效果的影響：方法與上述1相同，不同在于預處理采用洗衣粉溶液浸泡芫花莖段外植體20min，接著用流水沖洗12h；然后采用75％乙醇30s+1g·l^-1升汞加3-5滴吐溫80混合溶液8～14min進行滅菌處理，結果見表2：

表2預處理加流水沖洗12h的消毒方法對芫花莖段外植體滅菌效果的影響

注：同一列數據中字母(小寫)不同者表示差異顯著(p<0.05)；

由表2可知：

預處理加流水沖洗環節的消毒方法其污染率隨升汞吐溫混合液消毒時間的延長逐漸下降。消毒8min處理的污染率為91.1％，顯著高于其他各處理；消毒14min污染率最低，為44.4％；其中消毒12min與14min處理污染率差異不顯著。

預處理加流水沖洗環節的消毒方法莖段外植體死亡率隨升汞吐溫混合液消毒時間的延長逐漸上升；消毒14min死亡率為35.6％，顯著高于其他各處理；消毒8、10、12min的處理其死亡率均在13.3％以下，其差異不顯著。

預處理加流水沖洗環節的消毒方法其存活率受殺菌效果和死亡情況的雙重影響。從芫花莖段外植體消毒試驗的存活率數據分析：消毒8min處理的存活率為5.6％，效果最差，顯著低于其他處理；消毒10min和14min存活率為21.1％和20.0％；消毒12min效果最好，存活率達28.9％，顯著高于其他處理。

結論：預處理采用洗衣粉溶液浸泡芫花莖段外植體20min，接著用流水沖洗12h；消毒采用75％乙醇30s+0.1％升汞吐溫混合溶液10～14min的方法可獲得生存率達20.0～28.9％的無菌外植體。綜合分析污染率、死亡率與生存率的試驗結果可知：芫花莖段外植體的最佳消毒方法為預處理采用洗衣粉溶液浸泡芫花莖段外植體20min，接著用流水沖洗12h；消毒采用75％乙醇30s+0.1％升汞吐溫80混合溶液12min，其污染率為57.8％，死亡率為13.3％，存活率為28.9％。

改用洗衣粉浸泡時間15-20min、流水沖洗時間8-12h或者70-75％乙醇消毒30-45s的方法都與上述結果類似。

試驗例2

不同激素與質量濃度對初代培養的影響

選用實施例1和2中腋芽莖段作為外植體并采用實施例1和2的消毒方法，預處理采用洗衣粉溶液浸泡芫花莖段外植體20min，接著用流水沖洗12h；將外植體剪成4cm莖段；消毒采用75％乙醇30s+0.1％升汞加5滴吐溫80混合溶液12min，消毒后用無菌水沖洗，將莖段剪成2cm的長度，莖段上剪口距芽0.5cm，下剪口距節1cm，接入初代組織培養基中，用消毒獲得的無菌帶芽莖段進行初代培養試驗。試驗設置對照試驗激素為ms+0.1mg·l^-1naa+(0.5、2.0、5.0)mg·l^-16-b，以及ms+0.1mg·l^-1naa+2.0mg·l^-1zt與本發明實施例1-2采用的ms+0.1mg·l^-1naa+(1.0、1.5)mg·l^-1zt進行對比，共6個處理，并且6個處理都加入蔗糖30g/l、瓊脂7g/l，調整酸堿度至ph＝5.8。接種苗置于培養室的培養架進行光照培養，保持室內溫度24℃，光照強度2500lx，相對濕度75％，光周期14h晝/10h夜，培養25d。不同激素配方處理對芫花莖段外植體萌發與生長情況的影響試驗結果(見表3)：

表3不同激素配方處理對芫花莖段外植體萌發與生長情況的影響

不同激素配方處理對芫花莖段外植體萌芽的影響結果表明：細胞分裂素采用6-ba處理萌芽率在16.7～34.4％，zt處理萌芽率在74.4～92.2％，6-ba處理萌芽率顯著低于zt處理。由此可知，對芫花的初代培養激素配方中細胞分裂素采用zt對芫花莖段外植體芽萌發的促進效果顯著優于6-ba。其中ms+0.1mg·l^-1naa+1.5mg·l^-1zt處理對芫花莖段外植體芽萌發效果顯著優于其他處理，萌發率達到92.2％。

不同激素配方處理對芫花莖段外植體玻璃化的影響結果表明：隨著細胞分裂素6-ba與zt濃度升高，芫花莖段外植體初代培養玻璃化現象逐漸加劇。6-ba處理玻璃化率在52.2～90.0％，zt處理玻璃化率在17.8～42.2％，zt處理玻璃化率顯著低于6-ba處理。在不同激素配方處理中，ms+0.1mg·l^-1naa+1.0mg·l^-1zt處理與ms+0.1mg·l^-1naa+1.5mg·l^-1zt處理對芫花莖段外植體初代培養中減少玻璃化現象顯著優于其他處理，玻璃化率小于22.3％。

不同激素配方處理對芫花莖段外植體萌芽平均高度的影響結果表明：6-ba處理萌芽均高在0.20～0.66cm，zt處理萌芽均高在1.06～2.13cm，zt處理萌芽均高顯著高于6-ba處理。在不同激素配方處理中，ms+0.1mg·l^-1naa+1.0mg·l^-1zt處理與ms+0.1mg·l^-1naa+1.5mg·l^-1zt處理對芫花莖段外植體初代培養中萌芽平均高度顯著優于其他處理，萌芽均高為1.67cm和2.13cm。

結論：綜合不同激素配方處理對芫花莖段外植體萌發與生長情況的影響結果表明：ms+0.1mg·l^-1naa+1.5mg·l^-1zt處理為芫花莖段外植體初代培養最佳配方，其萌發率為92.2％，玻璃化率為22.3％，萌芽均高為2.13cm。改用其他實施例3-6的消毒方法以及培養條件，與實施例2的培養結果相近。

通過本發明的芫花莖段初代組織培養方法采用莖段外植體誘導叢生芽，可以簡單、快捷的獲得芫花組培苗，初代芫花組培苗是進行繼代培養的必須材料。運用初代培養試管苗可建立莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等無性繁殖系，可用于繼代擴繁、細胞培養、種質資源保存等不同研究目的。芫花組培苗無性系建立的意義在于：1.可用于深入研究芫花生長和分化規律，并可以利用各種培養條件影響其發育進程。2.可用于優良單株的快速繁殖、無病毒種苗培育、新品種的選育、人工種子和種質資源保存。3.可用于開展基因轉移與重組、藥用組分定向培養等生物工程技術。