本發明屬于植物種植領域，尤其涉及一種同時提高作物氮素利用效率和抗鎘脅迫能力的方法。

背景技術：

在農業現代化和集約化生產的今天，工業污染和城市垃圾大量向農業環境轉移，農業生產中長期大量不合理使用新型農用化學物質，畜禽排泄物中獸用藥物殘留等的增加，使農業環境正面臨著一系列嚴重的環境污染和生態破壞的問題，土壤污染逐年加劇，其中重金屬cd對土壤的污染是目前世界上需要解決的一大問題。

在我國南方地區，特別是湘南地區，由于農業和工業面源污染，以及土壤成土母質cd²⁺(cd)背景值高等問題，導致了較為嚴重的土壤cd污染，明顯影響了農作物的產量和品質。且專家指出，土壤污染造成有害物質在農作物中積累，并通過食物鏈進入人體，引發各種疾病，最終危害人體健康。因此，降低農作物中鎘的積累量，提升農作物的抗逆性勢在必行。

在實際生產過程中，生長狀況好的作物抗逆性差，抗逆性強的作物生長狀況不佳，作物的營養生長和抗環境非生物脅迫永遠是一個矛盾。因此，在非生物脅迫環境中種植作物，就必需同時考慮作物的營養生長和抗環境脅迫能力，使其得以協調，從而獲得最大的經濟效益。然而，對于在非生物脅迫尤其是重金屬脅迫的條件下增強植物抗性的同時提高植物nue的研究很少，在此之前還沒有一種方法能夠將營養調控和環境非生物脅迫的調控相協調。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是，提供一種同時提高作物氮素利用效率和抗鎘脅迫能力的方法。

為解決上述技術問題，本發明通過抑制clca通道蛋白活性的方式來改變no3^-在細胞質和液泡中的分配比例，從而改變能量的分配，在提高植物nue的同時增強植物抗cd脅迫能力。其方案具體是提供一種同時提高作物氮素利用效率和抗鎘脅迫能力的方法，包括如下步驟：培育幼苗，進行移栽培養，將培養后得到的作物置于環境非生物鎘脅迫模擬池中，將含有氯離子通道抑制劑的抑制劑溶液噴灑到作物葉片上進行抑制處理，噴灑的量以該溶液完全濕潤所有葉片為準。

方法原理：(1)氯離子通道抑制劑噴灑到葉片可以抑制clca通道蛋白的活性；(2)clca通道蛋白的活性被抑制后，no3^-能更多地分配在植物細胞質中，液泡累積no3^-所需的能量減少，從而可以使更多地能量用于將cd區隔到植物液泡中；(3)更多no3^-分配到細胞質中能提高其利用效率，并且由于no3^-向液泡累積減少，所需質子泵提供的能量減少，能量的重新分配導致cd向液泡的累積增多，從而提高了植物對cd的抗性。

no3^-是陸生植物主要的氮源，no3^-在硝酸還原酶(nr)的作用下可以代謝為銨鹽，通過谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶(gs-gogat)循環轉變為谷氨酸，而谷氨酸可以進一步生成其他的氨基酸，從而參與構建蛋白質、核苷酸、葉綠素等各類分子。在植物的細胞內，no3^-一部分被還原利用，一部分轉運至植物的液泡內儲存起來。細胞質中no3^-的濃度為3-5mol·m^-3，而在占據了成熟細胞體積60％-95％的液泡中no3^-的濃度為30-50mol·m^-3，no3^-在液泡膜質子泵(v-atpase和v-ppase)提供能量的前提下，在clca轉運蛋白的作用下累積到植物液泡中，雖然液泡內有no3^-的大量累積，但液泡內不含有nr，不能被植物吸收利用，因此，液泡被稱為no3^-的儲存庫。而細胞質中存在nr，是硝態氮的還原場所，被稱為硝態氮的代謝庫。改變no3^-在植物細胞質和液泡中的分配，使更多比例的no3^-分配到細胞質中能提高植物對no3^-的代謝，從而提高植物的氮素利用效率(nue)。

液泡占據了植物成熟細胞體積的60％-95％，不僅是許多營養元素的儲存器官，也是存儲和解毒非必需有毒重金屬元素cd的主要細胞器。cd脅迫條件下，雖然植物細胞壁能阻擋一部分cd進入植物細胞，但仍有一部分cd會在轉運蛋白的作用下進入細胞質，此時植物螯合肽合成酶被激活形成植物螯合肽螯合鎘，降低其有效性和毒性，并將其轉運至液泡中。液泡占據了植物細胞體積的大部分，并且液泡內不存在具有生理活性的酶類物質，因此液泡區隔化作用成為了植物緩解cd毒害最普遍有效的機制，而這一解毒機制同樣依賴于液泡膜質子泵以及各類cd轉運蛋白。例如，作為hma家族成員中的一員，oshma3是定位在水稻根部液泡膜上負責將cd轉運至液泡的轉運蛋白，研究表明，oshma3的過表達能有效降低水稻籽粒中cd累積和提高植物對cd的抗性；atcax4是定位在液泡膜上的轉運蛋白，在煙草中表達這兩種基因能提高煙草對cd²⁺、zn²⁺和mn²⁺三種重金屬離子的抗性，同時能降低cd向地上部的轉運。

no3^-和cd向液泡的累積一方面依賴于各自的轉運蛋白，一方面均需要液泡膜質子泵提供跨膜運輸的能量。植物液泡膜上存在的兩類功能和物理特性完全不同的質子泵，共同致力于跨膜△h⁺的建立，并通過定位在植物液泡膜的cd²⁺/h⁺和2no3^-/h⁺逆向轉運蛋白進行液泡cd和no3^-的累積，其中液泡內、外的質子(h⁺)濃度梯度通過液泡膜質子泵提供能量得以維持。可見，液泡膜質子泵是液泡cd和no3^-累積的能量來源，同時調控著液泡cd和no3^-的累積。

液泡膜質子泵活性的調控還可以顯著影響植物的抗環境非生物脅迫，比如重金屬脅迫等。植物過表達v-ppase基因可以增強其抗環境非生物脅迫能力，比如鹽脅迫、淹水、干旱和低溫脅迫等。例如，大麥幼苗根部施用微量v-atpase活性抑制劑(5nmbafilomycin)就顯著加劇了大麥的cd脅迫(5μm)程度。抑制液泡膜質子泵的活性能有效增加細胞質中no3^-的比例，從而提高植物的nue，但當質子泵活性的受到抑制時，植物對非生物脅迫的抗性變弱。由此可見，植物氮素利用效率的提高和抗非生物脅迫的增強是一對矛盾，無法通過改變質子泵活性來調節，但通過改變clca通道蛋白的活性，即使用氯離子通道抑制劑能有效調節這一對矛盾。從理論上來講，所有的作物液泡膜上都存在轉運no^3-的clca通道蛋白，因此本發明的技術方案對所有作物都能產生相同的技術效果。

上述的方法，優選的，所述幼苗為油菜幼苗。

優選的，將油菜籽粒浸種于體積分數為20％的次氯酸鈉進行表面消毒30～50min，用蒸餾水沖洗3～6次后在玻璃網室的土培中發芽，所用營養液為賀格蘭德完全營養液，每5天澆一次營養液，每次澆100ml，玻璃網室中晝夜平均溫度29℃/19℃，自然濕度和光照，光照強度為205～230ue/(m²·s)。

優選的，所述賀格蘭德完全營養液的組分及含量包括kno34～6mmol·l^-1、kh2po40.5～1.5mmol·l^-1、mgso46～8mmol·l^-1、ca(no3)2·4h2o4～6mmol·l^-1、fe-edta2～4mmol·l^-1、b0.4～0.6mg·l^-1、mn0.4～0.6mg·l^-1、zn0.04～0.06mg·l^-1、cu0.01～0.03mg·l^-1和mo0.005～0.015mg·l^-1。

優選的，所述油菜幼苗的移栽密度為8000株/畝。

優選的，所述油菜幼苗進行抑制處理的時期為油菜移栽后的幼苗期到角果發育期。

優選的，所述環境非生物鎘脅迫模擬池中鎘脅迫濃度為50～200μmol·l^-1cdcl2；

優選的，所述抑制劑溶液中，氯離子通道抑制劑的濃度為50～100nmol·l^-1；所述抑制劑溶液的噴灑頻率為每6～10天噴灑一次。

油菜中的研究表明，液泡膜質子泵活性抑制劑處理以后液泡膜質子泵活性顯著降低(活性降低30％以上)，原生質體中液泡no3^-的儲存比例從93％左右下降到80％左右，促使更大比例的no3^-分配到細胞質中得以代謝，顯著降低了植物組織中no3^-含量，同時顯著提高了植物的氮素利用效率(nue)。

與現有技術相比，本發明提供的方法所使用的氯離子通道抑制劑能夠有效地抑制clca通道蛋白的活性，從而改變no3^-在細胞質和液泡中的分配，進一步調節能量的分配，從而為同時提高作物nue和抗cd脅迫能力提供可行的調節手段，具體表現為：

(1)目前還沒有一種方法能夠將營養調控和環境非生物脅迫的調控相協調，而本方法采用噴施氯離子通道(clcs)抑制劑可以將作物的抗逆性與硝態氮的分配調控相結合；

(2)現有的技術可以通過調節液泡膜質子泵活性促使更多的no3^-分配到細胞質中，從而提高植物的nue，但質子泵活性的降低勢必會削弱植物抗cd脅迫能力，抗環境非生物脅迫和nue是一個對立的矛盾，而本方法通過改變液泡膜no3^-轉運蛋白的活性調節液泡no3^-的分配，從而改變能量的分配，在nue提高的同時增強植物抗cd脅迫能力。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發明實施例中在100umol·l^-1的鎘處理下噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜幼苗。

圖2為本發明實施例中在100umol·l^-1的鎘處理下未噴施氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜幼苗。

圖3為本發明實施例中油菜葉綠素相對降解率對比圖。

圖4為本發明實施例中油菜丙二醛含量的對比圖。

圖5為本發明實施例中油菜脯氨酸含量的對比圖。

圖6為本發明實施例中油菜氮素利用效率的對比圖。

具體實施方式

為了便于理解本發明，下文將結合說明書附圖和較佳的實施例對本發明做更全面、細致地描述，但本發明的保護范圍并不限于以下具體實施例。

除非另有定義，下文中所使用的所有專業術語與本領域技術人員通常理解含義相同。本文中所使用的專業術語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發明的保護范圍。

除非另有特別說明，本發明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設備等均可通過市場購買得到或者可通過現有方法制備得到。

實施例：

一種同時提高作物氮素利用效率和抗鎘脅迫能力的方法，以油菜為例，包括以下步驟：

(1)將油菜籽粒浸種于體積分數為20％的次氯酸鈉進行表面消毒30～50min，用蒸餾水沖洗3～6遍以后在玻璃網室的土培中發芽，所用營養液為賀格蘭德完全營養液，每5天澆一次營養液，每次澆100ml，玻璃網室中晝夜平均溫度29℃/19℃，自然濕度和光照，光照強度為205～230ue/(m².s)；賀格蘭德完全營養液的組分及含量包括kno34～6mmol.l^-1、kh2po40.5～1.5mmol.l^-1、mgso46～8mmol.l^-1、ca(no3)2·4h2o4～6mmol.l^-1、fe-edta2～4mmol.l^-1、b0.4～0.6mg.l^-1、mn0.4～0.6mg.l^-1、zn0.04～0.06mg.l^-1、cu0.01～0.03mg.l^-1和mo0.005～0.015mg.l^-1。

(2)作物的非生物脅迫處理：油菜幼苗的移栽(采用育苗移栽方法)，9月30日前后按照第一步所述方法育苗，一個月以后移栽到環境非生物脅迫的模擬池中(模擬池中的鎘脅迫100μmol·l^-1cdcl2)，每小區10m²(長5m,寬2m)，按8000株/畝的密度進行移栽，共3個小區，隨機區組排列，按苗期、抽薹期、開花期、角果發育期和成熟期這5個生長時期進行劃分，于當年的5月中旬收獲，苗期移栽返青后補施尿素5kg/畝，適期灌水并追施薹花肥，春季結合春灌追施蕾薹肥尿素7.5kg/畝。

(3)抑制劑的施用：移栽后的油菜氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的處理，同時含有50nmol·l^-11-抑制劑溶液于每次的上午10點均勻的噴灑到油菜的葉片上，噴灑的量以生長調節劑溶液完全濕潤所有葉片為準，從移栽后的幼苗期開始每6天均勻的噴灑一次直到進入油菜的角果發育期結束。

測定結果：

移栽后的油菜氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的處理，同時含有50nmol·l^-11-抑制劑溶液于每次的上午10點均勻的噴灑到油菜的葉片上，噴灑的量以生長調節劑溶液完全濕潤所有葉片為準，從移栽后的幼苗期開始每6天均勻的噴灑一次直到進入油菜的角果發育期結束。取30～60天的油菜幼苗拍照并進行相關指標的測定。結果表明，由圖1和圖2可以看出，噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜幼苗在100umol·l^-1的鎘處理下葉片比不噴施氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜幼苗偏綠；同時測定了葉綠素、丙二醛以及脯氨酸的含量，結果表明，在cd脅迫條件下，與未噴施氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜相比，噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜葉綠素降解率和丙二醛含量較低(圖3和圖4)，而脯氨酸含量更高(圖5)，并且都達到了顯著差異，這些測定結果均表明噴施效氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜有更高的抗cd脅迫能力，此外還測定了未噴施氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)和噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜的氮素利用效率，結果表明，在cd脅迫條件下，噴施了氯離子通道抑制劑(r(+)-iaa-94)的油菜具有更高的氮素利用效率(nue)(圖6)。