本發(fā)明涉及細(xì)胞的凍存領(lǐng)域，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及豬胰島細(xì)胞的凍存液和凍存方法。
背景技術(shù)：
：糖尿病是由于胰島素分泌缺陷或者胰島素功能障礙導(dǎo)致的代謝性疾病。糖尿病容易引起長(zhǎng)期代謝紊亂，使全身組織器官尤其使是眼、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)造成功能障礙和衰竭。嚴(yán)重者引起失水，電解質(zhì)紊亂和酸堿平衡失調(diào)等急性并發(fā)癥酮癥酸中毒和高滲昏迷。注射胰島素是目前控制糖尿患者血糖的有效手段，但是外源性胰島素不能達(dá)到生理性調(diào)節(jié)血糖的作用，因此糖尿病并發(fā)癥難以得到改善，從而大大降低患者的生活質(zhì)量，最終導(dǎo)致死亡。研究發(fā)現(xiàn)明胰島細(xì)胞移植可以使糖尿病慢性并發(fā)癥延緩6年以上，這對(duì)于提高糖尿病患者的生活質(zhì)量非常重要。因此，胰島細(xì)胞移植治療糖尿病如同腎移植治療終末期腎功能衰竭一樣，將成為糖尿病的最有效治療手段。近年來隨著胰島細(xì)胞移植技術(shù)的日趨成熟和臨床應(yīng)用的發(fā)展，豬胰島細(xì)胞異種移植有望成為治療糖尿病的有效方法之一。豬胰島的移植的實(shí)施過程中的關(guān)鍵之一就是獲得足夠量的豬胰島細(xì)胞，而豬胰島細(xì)胞分離、消化、純化過程是一個(gè)十分復(fù)雜的、技術(shù)性強(qiáng)的過程，往往需要10多頭新生豬才能滿足一個(gè)病人的使用。滿足豬胰島細(xì)胞移植往往需要大量細(xì)胞，臨時(shí)提取純化豬胰島細(xì)胞顯然無法滿足豬胰島移植的應(yīng)用和推廣。因此，豬胰島細(xì)胞的凍存尤為重要，影響到豬胰島細(xì)胞移植的技術(shù)的應(yīng)用和推廣。常規(guī)的細(xì)胞凍存保存劑為dmso10％+fbs10-20％+細(xì)胞培養(yǎng)液(主要有dmem,prim1640等)，它主要是適用于單細(xì)胞懸液的凍存保護(hù)劑。但胰島細(xì)胞不同于普通的細(xì)胞，它是由β、α、γ、θ等細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，共同發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖水平的作用。用常規(guī)單細(xì)胞懸液的凍存液并不能有效的保護(hù)胰島細(xì)胞團(tuán)，凍存的胰島細(xì)胞團(tuán)活率極低，并且無法進(jìn)行長(zhǎng)期保存。因此用于臨床移植的豬胰島細(xì)胞團(tuán)凍存液配方需要改良成適合臨床使用的配方。針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種用于大規(guī)模有效地凍存胰島細(xì)胞團(tuán)的凍存液及其凍存方法，避免其受冷凍損傷，以提供臨床應(yīng)用的胰島細(xì)胞團(tuán)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種豬胰島細(xì)胞的凍存液及其凍存方法，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種豬胰島細(xì)胞凍存液，包括以下質(zhì)量百分比的組分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基20-40％，豬血清為40-50％，dmso為7～9％，其余為保護(hù)因子；所述的保護(hù)因子及其濃度分別為過氧化氫酶100～200μg/ml，生育酚10～50μg/ml，海藻糖0.01～0.1mml/l，細(xì)胞凋亡抑制劑z-vad-fmk10～30μμ。所述的豬胰島細(xì)胞凍存液優(yōu)選：基礎(chǔ)培養(yǎng)基40％，豬血清為50％，dmso為7～9％，其余為保護(hù)因子；所述的保護(hù)因子及其濃度分別為過氧化氫酶100～200μg/ml，生育酚10～50μg/ml，海藻糖0.01～0.1mml/l，細(xì)胞凋亡抑制劑z-vad-fmk10～30μμ。所述的豬胰島細(xì)胞凍存液，氧化氫酶優(yōu)選濃度為150μg/ml，生育酚優(yōu)選濃度為20μg/ml，海藻糖優(yōu)選濃度為0.05mml/l，細(xì)胞凋亡抑制劑z-vad-fmk優(yōu)選濃度為20μμ。使用所述的豬胰島細(xì)胞凍存液的凍存方法，細(xì)胞凍存懸液中凍存密度為1×104-1×105ieq/ml。所述的凍存方法：三個(gè)降溫經(jīng)歷的溫度區(qū)間及其降溫速度：降至溫度>-25℃，1℃/min的降溫速度；降至-25℃≥溫度≥-40℃，0.25℃/min的降溫速度；降至-40℃＞溫度≥-80℃，5℃/min的降溫速度。當(dāng)溫度降到-80℃時(shí)，將細(xì)胞放置到液氮中長(zhǎng)期保存。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)：胰島細(xì)胞是細(xì)胞團(tuán)樣結(jié)構(gòu)，用常規(guī)的單細(xì)胞凍存保護(hù)液凍存胰島細(xì)胞團(tuán)，大部分胰島細(xì)胞容易在凍存過程凋亡壞死。本發(fā)明凍存液添加了1、過氧化氫酶可以減輕低溫引起的細(xì)胞凋亡。2、生育酚減少氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。3、海藻糖是一種非滲透性保護(hù)劑，凍存過程中減少胞內(nèi)結(jié)晶，復(fù)蘇時(shí)減輕滲透壓改變引起的細(xì)胞腫脹，具有膜穩(wěn)定的作用，提高復(fù)溫后活率。4、細(xì)胞凋亡抑制劑z-vad-fmk，純度>95％，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。本發(fā)明方法在-25℃≥溫度≥-40℃時(shí)，降溫速度為0.25℃/min降低降溫速度，讓胰島細(xì)胞團(tuán)內(nèi)外降溫一致。本發(fā)明的凍存液能有效的保護(hù)胰島細(xì)胞團(tuán)，凍存的胰島細(xì)胞團(tuán)活率高，并且能進(jìn)行長(zhǎng)期保存。以提供臨床應(yīng)用的胰島細(xì)胞團(tuán)。附圖說明圖1為實(shí)施例中凍存前豬胰島細(xì)胞；圖2為實(shí)施例中凍存1月后復(fù)蘇豬胰島細(xì)胞形態(tài)圖；a為現(xiàn)有常規(guī)凍存液及方法；b為改良的凍存液及方法；c為本發(fā)明凍存液及方法；圖3為實(shí)施例中凍存1月后復(fù)蘇豬胰島細(xì)胞流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)的結(jié)果；a為現(xiàn)有常規(guī)凍存液及方法；b為改良的凍存液及方法；c為本發(fā)明凍存液及方法。具體實(shí)施方式：以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不會(huì)形成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1豬胰島細(xì)胞的凍存實(shí)驗(yàn)胰島細(xì)胞計(jì)數(shù)：每次于細(xì)胞懸液中取出50μl的樣品，鏡下計(jì)數(shù)dtz陽性細(xì)胞團(tuán)并重復(fù)取樣3次，按下列公式計(jì)數(shù)胰島：胰島產(chǎn)量＝(3次陽性胰島數(shù)值之和/3)×[樣本總量(ml)/50μl]。將分離提取的豬胰島細(xì)胞分成兩份凍存：第一份豬胰島細(xì)胞用普通凍存液(50％血清+10％dmso+40％基礎(chǔ)培養(yǎng)基)重懸，密度為10000ieq/ml；裝入凍存管中，每管約1ml；降溫至-80℃，置入液氮中長(zhǎng)期保存。第二份豬胰島細(xì)胞用改良的凍存液(50％血清+10％dmso+40％基礎(chǔ)培養(yǎng)基+海藻糖0.05mml/l+生育酚20μg/ml)重懸，密度為10000ieq/ml；裝入凍存管中，每管約1ml；降溫至-80℃，置入液氮中長(zhǎng)期保存。第三份豬胰島細(xì)胞用本發(fā)明的凍存液重懸，密度為10000ieq/ml；裝入凍存管中，每管約1ml，4℃平衡30min，然后放入程序降溫儀中，以溫度>-25℃時(shí)，1℃/min的速率降溫，-25℃≥溫度≥-40℃時(shí)，0.25℃/min的速率降溫，-40℃＞溫度≥-80℃時(shí)，5℃/min的速率降溫，溫度降到-80℃時(shí)，放入液氮中長(zhǎng)期保存。實(shí)施例2凍存1個(gè)月豬胰島細(xì)胞復(fù)蘇后活率檢測(cè)分別將實(shí)施例1所述的普通凍存液、改良凍存液和本發(fā)明凍存液凍存的細(xì)胞凍存1個(gè)月后復(fù)蘇。復(fù)蘇后培養(yǎng)一天，胰島細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞回收率，然后用annexinv–pi染色，通過facscaliburflowcytometer觀察細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明常規(guī)凍存液組凍存一個(gè)月以后大部分豬胰島細(xì)胞凋亡了，存活的細(xì)胞僅剩下22.07％，改良凍存液組凍存一個(gè)月以后存活的豬胰島細(xì)胞活率提升到了41.69％，使用本發(fā)明的細(xì)胞凍存液凍存和凍存方法凍存一個(gè)月后的豬胰島細(xì)胞的活率大大提升，達(dá)到62.62％。表明本發(fā)明凍存液和凍存方法更適合豬胰島細(xì)胞的凍存。表1凍存1月后復(fù)蘇胰島細(xì)胞活率分組凍存1月后活率常規(guī)凍存液組22.07％改良凍存液組41.69％本發(fā)明凍存液組62.62％實(shí)施例3凍存1個(gè)月豬胰島細(xì)胞復(fù)蘇后功能檢測(cè)分別將實(shí)施例1所述的普通凍存液凍存的豬胰島細(xì)胞和本發(fā)明凍存液凍存的細(xì)胞凍存1個(gè)月后復(fù)蘇。復(fù)蘇后立即檢測(cè)細(xì)胞胰島素釋放能力以及培養(yǎng)一天檢測(cè)細(xì)胞胰島素釋放能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明凍存方法組復(fù)蘇的豬胰島細(xì)胞葡萄糖刺激指數(shù)2.56＞1.8，表明本發(fā)明的凍存液和凍存方法復(fù)蘇的豬胰島細(xì)胞具有功能，而常規(guī)方法凍存的豬胰島細(xì)胞葡萄糖刺激指數(shù)1.24＜1.8不具有功能。說明使用本發(fā)明的凍存液和凍存方法能較好的保護(hù)豬胰島細(xì)胞的功能。表2凍存1月后復(fù)蘇豬胰島細(xì)胞胰島素釋放當(dāng)前第1頁12