本發明屬于植物脫毒與組織培養快繁技術領域，具體地涉及一種誘導巴蜀報春無菌苗快速繁殖的方法。
背景技術：
巴蜀報春（primularupestrispaxetk.hoffm）,是報春花科報春花屬多年生草本植物。是一種重要的觀賞花卉，其繁殖方式主要依靠種子繁殖，也可以用分株法進行繁殖。但其種子的壽命很短，發芽力喪失快，例如春天采收的種子在秋天播種，發芽率會下降一半，陳種子的發芽率更低，有的甚至不發芽。并且其種子很小，又是喜光發芽的種子，因此依靠其種子自然萌發來繁殖后代的方式效率很低。
近年來，雖然有文獻對報春花的組織培養技術進行了研究，但目前為止，對巴蜀報春的相關研究還尚未報道，包括巴蜀報春的組織培養快繁技術。巴蜀報春目前僅在湖北省宜昌市有發現，其他地區未見有報道，而且對其研究的文獻暫時也沒有。由于其種子繁殖率低，現已被列入瀕危保護物種。故我們希望可以通過組織培養的方式可以實現其快速繁殖的目的。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種誘導巴蜀報春無菌苗快速繁殖的方法，以解決巴蜀報春依靠其種子自然萌發來繁殖后代的方式效率很低的問題。
本發明的目的及解決其主要技術問題是采用以下技術方案來實現的：一種誘導巴蜀報春無菌苗快速繁殖的方法，其操作流程包括以下步驟：
1）外植體的采集及預處理：將從野外采集回來的巴蜀報春幼苗進行修整，把不需要的部分去掉，取生長狀況良好的葉片、葉柄、莖尖以及根做為外植體，自來水沖洗30min，用干凈的濾紙將水分吸干；
2）外植體的消毒：用10%naclo消毒10min，期間攪拌，無菌水沖洗3-4遍，將無菌水倒干凈，備用；
3）接種：用經過高溫高壓滅菌的鑷子夾取將滅菌完的外植體接種到ms+0.6mg/lkt+0.1mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉培養基上，培養于14h/d光照，溫度22℃培養室中。
上述的步驟1）采用野生巴蜀報春的莖尖為最佳外植體。
上述的步驟3）用經過高溫高壓滅菌的鑷子夾取已經過滅菌處理的外植體。
上述的步驟3）培養基ph為5.8。
上述的步驟3）20day后可以肉眼可見長出無菌苗。
本發明與現有技術相比具有明顯的優點和優異效果。由以上技術方案可知，本發明通過組織培養的方法對其進行繁殖，以解決巴蜀報春依靠其種子自然萌發來繁殖后代的方式效率很低的問題，為對巴蜀報春的研究奠定基礎，可以彌補這一物種在對報春花科的研究中的空缺，具有一定的經濟效益和社會效益。
具體實施方式
以下結合較佳實施例，對依據本發明提出的一種誘導巴蜀報春無菌苗快速繁殖的方法具體實施方式、特征及其功效，詳細說明如后。
一種誘導巴蜀報春無菌苗快速繁殖的方法，其操作流程包括以下步驟：
1）外植體的采集及預處理：將從野外采集回來的巴蜀報春幼苗進行修整，把不需要的部分去掉，取生長狀況良好的葉片、葉柄、莖尖以及根做為外植體，自來水沖洗30min，用干凈的濾紙將水分吸干；
2）外植體的消毒：用10%naclo消毒10min，期間攪拌，無菌水沖洗3-4遍，將無菌水倒干凈，備用；
3）接種：用經過高溫高壓滅菌的鑷子夾取將滅菌完的外植體接種到ms+0.6mg/lkt+0.1mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉培養基上，培養于14h/d光照，溫度22℃培養室中。
上述的步驟1）采用野生巴蜀報春的莖尖為最佳外植體。
上述的步驟3）用經過高溫高壓滅菌的鑷子夾取已經過滅菌處理的外植體。
上述的步驟3）培養基ph為5.8。
上述的步驟3）20day后可以肉眼可見長出無菌苗。
上述方法和參數是通過以下實驗優選最佳方案得出的：
1.1.實驗材料
貴州省施秉縣云臺山采取野生巴蜀報春幼苗。
1.2.材料預處理
莖尖、葉片，葉柄、根分開誘導，用流動自來水小水流沖洗30min，備用。
1.3.外植體的消毒
植物組織培養用的外植體大部分取自田間，表面上附著大量的微生物，這是組織培養的一大障礙。因此在材料接種培養前必須要消毒處理，消毒一方面要求把材料表面上的各種微生物殺滅，同時又不能損傷或只輕微損傷組織材料而不影響其生長。因此，外植體的消毒處理是植物組織培養工作中的重要一環。
1.3.1.常用的消毒劑
常用的消毒劑如下所示。理想的消毒劑應具有消毒效果好，易被無菌水沖洗掉或能自行分解，對材料損傷小，對人體及其他生物無害，來源廣泛，價格低廉。
常用消毒劑的使用方法及效果
①酒精
酒精是最常用的表面消毒劑，以70%-75%酒精殺菌效果最好，95%或無水酒精會使菌體表面蛋白質快速脫水凝固，形成一層干燥膜，阻止了酒精的繼續滲入，殺菌效果大大降低。
酒精具有較強的穿透力，使菌體蛋白質變性，殺菌效果好。同時它還具有較強的濕潤作用，可排除材料上的空氣，利于其他消毒劑的滲入。但酒精對植物材料的殺傷作用也很大，浸泡時間過長，植物材料的生長將會受到影響，甚至被酒精殺死，使用時應嚴格控制時間。但酒精不能徹底消毒，一般不單獨使用，多與其他消毒劑配合使用。
②升汞
又稱氯化汞，hg2+可以與帶負電荷的蛋白質結合，使蛋白質變性，從而殺死菌體。升汞的消毒效果極佳，但易在植物材料上殘留，消毒后需用無菌水反復多次沖洗。升汞對環境危害大，對人畜的毒性極強，使用后應做好回收工作。
③次氯酸鈉
次氯酸鈉是一種較好的消毒劑，它可以釋放出活性氯離子，從而殺死菌體。其消毒能力很強，不易殘留，對環境無害。但次氯酸鈉溶液堿性很強，對植物材料也有一定的破壞作用。
④漂白粉
漂白粉的有效成分是次氯酸鈣[ca(clo)2]，消毒效果很好，對環境無害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。
⑤過氧化氫
也稱雙氧水，消毒效果好，易清除，又不會損傷外植體，常用于葉片的消毒。
⑥新潔爾滅
這是一種廣普表面活性消毒劑，對絕大多數植物外植體傷害很小，殺菌效果好。
1.3.2.最佳消毒方法的篩選
在本次發明中選擇0.1%升汞、10%naclo以及70%酒精三種滅菌劑，分別設定不同的滅菌時間，以便篩選巴蜀報春外植體最適宜的滅菌方式，具體實驗方案見表1。
巴蜀報春外植體分別采用以上12種方式進行滅菌處理，其他因素皆相同。
1.4.巴蜀報春培養基的選擇
1.4.1.6-ba、naa激素配比的選擇
以ms培養基作為基本培養基，選擇6-ba、naa兩種植物生長調節劑，分別設定7個不同濃度水平進行試驗以篩選巴蜀報春外植體最適宜誘導無菌苗的培養基，詳細實驗方案見表2。
1.4.2.kt、2,4-d激素配比的選擇
以ms培養基作為基本培養基，選擇kt、2,4-d兩種植物生長調節劑，分別設定不同濃度水平進行試驗以篩選巴蜀報春外植體最適宜誘導無菌苗的培養基，詳細實驗方案見表3。
1.1.5巴蜀報春接種：
接種時，要穿好工作衣，戴好工作帽和口罩，不準說話或對著植物材料或培養容器口呼吸。打開包塞紙和瓶塞、瓶蓋時注意不要污染瓶口。在近酒精燈火焰處打開培養瓶瓶口，并使培養瓶傾斜，以免微生物落入瓶內。瓶口可以在拔塞、開蓋前灼燒滅菌，接種工作宜在近火焰處進行。手不能接觸接種器械的前半部分（即直接切割、觸碰植物材料的部分），接種操作時（包括擰開或擰上培養瓶蓋時），培養瓶、試管或三角瓶宜水平放置或傾斜一定角度（45度以下），避免直立放置而增大污染機會。手和手臂應避免在培養基、植物材料、接種器械上方經過。已消毒的植物材料接種時不慎掉在超凈工作臺上，不宜再用。接種期間如遇停電等事件使超凈工作臺停止運轉，重新啟動時應對接種器械及暴露的植物材料重新消毒。
將接種好的材料放入培養室中，其中14h/10h光照，22℃培養，每隔三天拍照記錄。約20天后長出無菌苗。
1.6.實驗結果與分析
接種5day后統計12種滅菌方式的染菌率，具體實驗結果見表4。
用10%naclo消毒10min，污染率最低，雖然0.1%升汞滅菌效果較好，但由于其毒性較大，對外植體的損傷較大，故采用10%naclo消毒10min的方式對巴蜀報春外植體進行滅菌。
接種20day后，統計不同外植體的出苗情況，具體實驗結果見表5。
接種20day后，統計各種培養基中巴蜀報春的出苗情況，具體實驗結果見表6-1、表6-2、表7-1和表7-2。
通過以上實驗結果證明誘導巴蜀報春無菌苗最適宜的培養基為ms+0.6mg/lkt+0.1mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph為5.8。
本發明建立了巴蜀報春脫毒培養的技術體系，為大規模生產無病毒種苗，為巴蜀報春的繁殖提供了一種可行的方式，為彌補巴蜀報春在報春花科研究中的空白奠定了基礎。
以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制，任何未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、變換材質、等同變化與修飾，均仍屬于本發明技術方案的范圍內。