本發明屬于植物組織培養技術領域，涉及一種植株再生體系建立方法，具體涉及一種前胡植株再生體系建立方法。

背景技術：

前胡始載于《名醫別錄》，至今有1500多年的悠久用藥歷史。安徽寧國以盛產道地藥材前胡而著稱且該地所產前胡以個大皮黑、條長肉黃、質地柔軟、氣味濃郁等特點著稱，在中藥界享有“寧前胡”之美譽。由于連年采挖，野生資源逐漸枯竭，上世紀90年代末由寧國醫藥局牽頭開展了野生前胡改家種試驗并取得成功。目前人工栽培的前胡根部分叉現象嚴重，伴有變異發生導致前胡種性退化，品質下降。前胡生產上多采用種子繁殖和分根繁殖，分根繁殖系數低，用種量大，長期分根無性繁殖易導致種性退化，而種子繁殖萌發率低，出苗不整齊，生長周期長。另外，前胡栽培品一般次年就出現抽薹現象，這些問題嚴重制約了前胡的可持續發展，既難滿足市場需求，又不易獲得經濟效益。

因此，如何提高前胡繁殖效率成為前胡資源保護和市場供需需要解決的關鍵技術。利用組織培養技術可以遺傳母本優良性狀，避免種性退化和遺傳變異，高繁殖率為前胡工廠化育苗提供可能；目前前胡組織培養的相關報道并不多見。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種前胡植株再生體系建立方法，該方法外植體滅菌效果好、成活率高，愈傷組織誘導率高、體積大、生長狀態好，叢生芽增殖系數高，組培苗生根率高，移栽成活率高。

本發明采取以下技術方案：

一種前胡植株再生體系建立方法，包括以下步驟：

1)外植體滅菌：以長勢良好的前胡植株的根、莖、葉為外植體材料，首先對外植體材料分別用70％～75％乙醇消毒后，用無菌水沖洗；然后分別用0.1％hgcl2消毒，無菌水沖洗；再用無菌濾紙吸干外植體材料表面的水分后，無菌手術刀將根切成約0.5cm³方塊狀，莖切成約1.0cm小段狀，葉切成約0.25cm²方塊狀；

2)愈傷組織誘導：將1)得到的根、莖、葉外植體接種到愈傷組織誘導培養基中，在黑暗或者弱光條件下培養4～5周，誘導出愈傷組織；

3)分化培養：將2)形成的愈傷組織接種到分化培養基上，在植物組織培養室內培養4～6周，培養出前胡叢生芽；

4)生根培養：選取生長健壯、株高為3～4cm的前胡叢生芽，將其切成單芽轉接到生根培養基中，在植物組織培養室內培養8～10周，得到生根的前胡無菌組培苗；

5)組培苗馴化移栽：當前胡無菌組培苗的苗高4cm以上、根系長度3cm以上時選取生長健壯、根系良好、株高一致的前胡組培苗，移到自然光下煉苗3～5天，然后打開封口膜開口煉苗1～2天；最后適時移栽至合適的移栽基質中，幼苗管理直至成苗，即完成前胡植株再生體系的建立。

進一步，所述1)中用乙醇滅菌的時間控制在1min內，用0.1％hgcl2對根、莖、葉的消毒時間分別為：12～15min、12～15min和10～12min。

進一步，所述愈傷組織培養基具體為：根愈傷組織誘導培養基：naa0.5mg/l+6-ba2.0mg/l或者2，4-d2.0mg/l+kt0.5mg/l；莖愈傷組織誘導培養基為：naa0.5mg/l+6-ba2.0mg/l；葉愈傷組織誘導培養基為：naa0.5mg/l+tdz0.05mg/l。

進一步，所述分化培養基為：6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l。

進一步，所述生根培養基為：1/2ms+naa0.5mg/l+6-ba0.2mg/l。

進一步，所述移栽基質為：體積比為1:1的腐質土和蛭石。

進一步，所述3)和4)中植物組織培養室的溫度控制在25±3℃，空氣相對濕度保持在40％～60％，光照時長為12h/d，光照強度為1500～2000lx。

進一步，所述培養基為ms固體培養基，培養基中瓊脂為8.0g/l，蔗糖濃度為30g/l，ph為5.8～6.0。

本發明有以下技術效果：

1)將新型植物生長調節劑tdz(噻苯隆)首次應用到傘形科前胡屬中藥材前胡組織培養中，并發現對前胡葉片愈傷的形成具有良好效果。

2)前胡葉片誘導產生的愈傷組織體積大，生長狀態好，可用于次生代謝產物生產和細胞工程。

3)利用植物組織培養技術對前胡優良性狀進行保留并世代傳遞，避免種性退化和遺傳變異；利用植物組織培養技術對前胡進行再生體系構建，培養條件不受外界天氣變化和病蟲害的影響；該方法成本低廉、愈傷組織誘導率高、重復性好、生產和生長周期短。

附圖說明

圖1為本發明愈傷組織誘導培養中的根愈傷組織圖；

圖2為本發明愈傷組織誘導培養中的莖愈傷組織圖；

圖3為本發明愈傷組織誘導培養中的葉愈傷組織圖；

圖4為本發明分化培養基中長成的叢生芽圖；

圖5為本發明生根培養基長成的寧前胡無菌組培苗圖；

圖6為本發明生根培養基長成的寧前胡組培苗的生根圖；

圖7為本發明生根組培苗長成的寧前胡再生植株圖。

具體實施方式

下面將結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不限于此。

本發明的詳細實施過程及內容如下：

(1)外植體滅菌：以長勢良好的寧前胡植株的根、莖、葉為外植體材料，分別用75％乙醇消毒30s，無菌水沖洗3～5次；然后用0.1％hgcl2分別對根、莖、葉消毒15、12和10min，無菌水沖洗3～5次后，用無菌濾紙吸干根、莖、葉表面的水分，無菌手術刀將根切成0.5cm³的方塊，莖切成長度為1.0cm的小段，葉切成0.25cm²的方塊。

本實施例中用75％乙醇+0.1％hgcl2對寧前胡根、莖、葉進行消毒，是通過消毒劑篩選實驗，得到根、莖、葉消毒的結果而確定的；結果見表1。

表1消毒劑對消毒效果的影響

由表1可知，本實施例的75％乙醇+0.1％hgcl2對寧前胡根、莖、葉3種外植體消毒效果好、成活率高。

確定消毒劑組合后，對消毒時間范圍進行篩選實驗，其中根的消毒時間為8、10、12、15、20min，莖和葉的消毒時間為5、8、10、12、15min，結果見表2。

表2消毒時間對滅菌效果的影響

由表2可知，本實施例的根采用75％乙醇30s+0.1％hgcl215min的消毒效果最佳，莖采用75％乙醇30s+0.1％hgcl212min的消毒效果最佳，葉采用75％乙醇30s+0.1％hgcl210min的消毒結果最佳。

(2)愈傷組織誘導：將(1)得到的根、莖、葉外植體接種到愈傷組織誘導培養基中，黑暗或者弱光條件下培養(實驗條件的篩選見表5、6)，根、莖、葉的具體培養時間為：4～5周；其中，通過不同激素組合對外植體愈傷組織誘導影響的實驗，見表3及表7，確定根愈傷組織誘導培養基為：ms+naa0.5mg/l+6-ba2.0mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l或者ms+2，4-d2.0mg/l+kt0.5mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，最高誘導率達78.89％；莖愈傷組織誘導培養基為：ms+naa0.5mg/l+6-ba2.0mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，最高誘導率達80.00％；葉愈傷組織誘導培養基為：ms+naa0.5mg/l+tdz0.05mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，最高誘導率達95.56％；ph為5.8～6.0；根、莖、葉誘導愈傷組織的形態特征，見表4；

表3不同激素組合對外植體愈傷組織誘導的影響

表4不同外植體誘導愈傷組織的比較

由表4可知，本發明實施例的寧前胡植株再生體系中，葉片是最好的愈傷誘導材料選擇，其次依次是莖段和塊根。

表5光照條件對葉片愈傷組織誘導的影響

由表5可知，本發明實施例的寧前胡植株再生體系中，避光條件下進行寧前胡葉片愈傷組織的誘導，有利于愈傷組織形成和提高誘導率。

表6黑暗處理對葉片愈傷組織誘導的影響

由表6可知，本發明實施例的寧前胡植株再生體系中，黑暗培養周期過短或者過長都影響愈傷形成和生長；黑暗培養一周后逐漸增加光照強度有利于愈傷組織形成，保持愈傷組織健康生長。

表7激素對愈傷組織繼代的影響

由表7可知，本發明實施例的寧前胡植株再生體系中，ms+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l對寧前胡愈傷組織增殖和分化效果最好，其中分化率高達66.67％，增殖系數為4.63，愈傷生長狀態較好，體積較大。

(3)分化培養：將(2)形成的愈傷組織接種到分化培養基上，在溫度為25℃，空氣相對濕度保持在40％～60％，光照時長為12h/d，光照強度為1500～2000lx植物組織培養室內培養，根、莖、葉的具體培養時間為：4～5周，培養出株高為3～4cm的寧前胡叢生芽，其中，通過激素對不定芽分化影響的實驗，見表8，確定分化培養基為：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，ph為5.8～6.0。

表8激素對不定芽分化的影響

由表8可知，本發明實施例的寧前胡植株再生體系中，ms+6-ba1.0mg/l+naa0.5mg/l的不定芽誘導培養基對不定芽的增殖和分化效果最明顯，誘導出的不定芽芽體數量多且壯實、長勢好、葉色濃綠，在后續培養過程中生長情況優良。

(4)生根培養：選取生長健壯的寧前胡叢生芽，將其切成單芽轉接到生根培養基中，保持植物組織培養室內培養條件不變，培養8～10周，得到生根的寧前胡無菌組培苗，其中，通過不同激素組合對寧前胡生根影響的實驗，見表9，確定生根培養基為：1/2ms+naa0.5mg/l+6-ba0.2mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，ph為5.8～6.0。

表9不同激素組合對寧前胡生根影響

由表9可知，本發明實施例的寧前胡植株再生體系中，寧前胡組培苗最佳生根培養基為1/2ms+naa0.5mg/l+6-ba0.2mg/l。

(5)組培苗馴化移栽：當寧前胡組培苗苗高達4cm以上、根系長度達3cm以上時選取生長健壯、根系良好、株高一致的寧前胡組培苗，移到自然光下煉苗3～5天，然后打開封口膜開口煉苗1～2天；最后適時移栽到移栽基質(體積比為1:1的腐質土和蛭石，移栽基質的確定見移栽基質對組培苗移栽影響的實驗，表10)中，幼苗管理直至成苗，即完成寧前胡植株再生體系建立。

表10移栽基質對組培苗移栽的影響

由表10可知，本發明實施例的寧前胡植株再生體系中，腐質土和蛭石的體積比為1:1的混合基質最適宜寧前胡再生植株的生長。

所述實施例為本發明的優選的實施方式，但本發明并不限于上述實施方式，在不背離本發明的實質內容的情況下，本領域技術人員能夠做出的任何顯而易見的改進-替換或變型均屬于本發明的保護范圍。