本發明屬于臨床醫學、實驗醫學、再生醫學與病毒學領域，具體地說，是一種構建人源化鼠模型并用于病毒性肝炎等人類疾病研究的新方法。

背景技術：

嗜肝病毒(甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等)，流行范圍廣，每年上百萬人死于病毒性肝炎所致肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌。嗜肝病毒只能在高級靈長類動物中致病，動物實驗模型常需使用猿猴類動物，猿猴類實驗成本高，操作復雜，實驗周期長，因此，建立能感染嗜肝病毒并致病的小動物模型有很大的科學意義和應用價值。但由于小動物無法感染嗜肝病毒，因此嗜肝病毒小動物研究模型建立困難，嚴重阻礙了病毒性肝炎機制、進展、轉歸研究，并很大程度上限制了治療方案的優化。建立人源化鼠模型將為研究病毒性肝炎及其治療與疾病轉歸提供良好的研究載體。干細胞(包括人胚胎干細胞、間充質干細胞、誘導多功能干細胞等)具有潛在分化能力，可以分化成多種功能細胞，如骨髓間充質干細胞。我們之前的研究發現人骨髓間充質干細胞(hbmsc)能嵌合暴發性肝功能衰竭豬，這為我們將干細胞移植到肝損傷的鼠肝內，建立新型人源化鼠模型奠定了基礎。此人源化鼠對闡明嗜肝性病毒生物學特性、肝炎發病機制、疾病轉歸、研發和篩選抗嗜肝性病毒新藥等提供保障。

技術實現要素：

本發明正是針對現有嗜肝性病毒研究模型的缺陷，提供了一種利用人干細胞構建人源化鼠模型的技術，本發明是通過以下技術方案來實現的：

本發明公開了一種利用干細胞構建人源化鼠模型的方法，步驟如下：

1)、獲取人干細胞；

2)、將干細胞移植入肝損傷的鼠；

3)、hbv感染人源化鼠。

作為進一步地改進，本發明所述的干細胞是分離培養的人干細胞，或是商品化的分離或凍存的人干細胞或細胞系。

作為進一步地改進，本發明所述的分離培養的人干細胞的獲取步驟如下：

a、獲得純化人干細胞；

b、干細胞培養，傳代；

c、培養于20℃-40℃，2％-10％co2的培養箱中。

作為進一步地改進，本發明所述的步驟2)的具體步驟如下：

e、獲得不同品系的實驗鼠；

f、通過予以肝損藥物，或予以外科部分肝切除術，建立肝損傷鼠模型；

g、移植1×10^4-8人干細胞進入鼠模型。

作為進一步地改進，本發明所述的步驟g后還包括步驟h：分次予以肝損藥物。

作為進一步地改進，本發明所述的實驗鼠是正常小鼠或免疫缺陷小鼠或正常大鼠或免疫缺陷大鼠，肝損傷包括急性、慢性肝損傷，急性、亞急性、慢性肝衰竭中的任意一種。

作為進一步地改進，本發明所述的步驟f中是予以肝損藥物是通過腹腔、肌肉、外周靜脈注射、口服或灌胃的方式。

作為進一步地改進，本發明所述的步驟g是通過外周靜脈、門靜脈、脾臟或肝臟注射的方式移植1×10^4-8人干細胞。

作為進一步地改進，本發明所述的步驟3)是通過外周靜脈、皮下、肌肉或腹腔對每只鼠注射各型嗜肝性病毒。

作為進一步地改進，本發明所述的步驟3)后還包括4)在感染鼠后的3-30天內檢測病毒載量一次，確認模型建立成功；或在感染鼠后的3-30天內檢測病毒載量一次后，再分次檢測病毒載量，確認模型建立成功。

與現有構建人源化鼠模型技術相比，本發明的有益效果如下：

為闡明嗜肝病毒生物學特性、病毒性發病的具體機制，本發明從生化指標、免疫組織化學，基因表達水平，蛋白組學等多個方面進行研究。發現通過誘導嚴重肝損害并移植人干細胞，鼠肝內人來源肝細胞有50-95％的高嵌合率，鼠脾臟、血液、肝臟、骨髓等器官內可持續分離到人源性免疫細胞，形成人源化肝臟和免疫細胞的鼠模型。再將各類嗜肝病毒感染上述人源化鼠，形成嗜肝病毒感染的人源化鼠模型。該模型能研究嗜肝病毒的整個生命周期，及嗜肝病毒感染后與轉分化形成的人源化免疫系統之間的免疫應答反應。在人源化鼠感染嗜肝病毒后10周至50周，先后出現肝損傷、慢性乙型肝炎、肝纖維化和肝硬化，最后逐漸出現肝細胞癌。符合人感染嗜肝病毒的自然史，及病毒性肝炎的發展轉歸。除能用于研究嗜肝病毒的生物學特性、病毒性肝炎發病機制、研發和篩選抗嗜肝病毒新藥之外，還能獲得更符合人類疾病發展史的肝硬化、肝細胞癌等模型。

該構建人源化鼠模型技術除了用于構建研究嗜肝病毒感染的模型外，該技術方案的思路還可用于構建其他人源化器官的模型。該技術方案為臨床上肝疾病治療研究提供了方便、簡單、易得的人源化模型。

附圖說明

圖1為骨髓間充質干細胞人源化frgs小鼠(hbmsc-frgs小鼠)模型構建示意圖；

圖2為胚胎干細胞人源化upas小鼠(es-upas小鼠)模型構建示意圖；

圖3為誘導多能干細胞人源化半乳糖胺正常小鼠(ips-正常小鼠)模型構建示意圖；

圖4為骨髓間充質干細胞人源化正常大鼠模型構建圖；

圖5為脂肪間充質干細胞人源化正常大鼠模型構建圖。

具體實施方式

本發明公開了一種利用人干細胞構建人源化鼠模型的方法并公開了一類利用該方法構建研究病毒性肝炎的人源化鼠模型，下面對本發明的技術方案作進一步地說明：

一、獲取人干細胞

1、分離培養人干細胞

1)獲得純化人干細胞。

2)干細胞培養，傳代。

3)培養于20℃-40℃，2％-10％co2的培養箱中。

2、獲取商品化的分離或凍存的人干細胞或細胞系。

二、干細胞移植入肝損傷的鼠

1、獲得不同品系的實驗鼠，實驗鼠包括正常小鼠、免疫缺陷小鼠、正常大鼠和免疫缺陷大鼠。

2、通過腹腔、肌肉、外周靜脈注射、口服或灌胃的方式予以肝損藥物，或予以外科部分肝切除術，建立肝損傷鼠模型。

3、通過外周靜脈、門靜脈、脾臟或肝臟注射的方式移植1×10^4-8干細胞。

三、hbv感染人源化小鼠

通過外周靜脈、皮下、肌肉或腹腔每只鼠注射各型嗜肝性病毒。

下面根據附圖，通過具體實施例及對比例，對本發明的技術方案作進一步地說明：本發明通過多種不同人來源干細胞注入肝損傷鼠獲得不同人源化鼠模型，來研究嗜肝性病毒感染機制及嗜肝性病毒感染的發生、發展機制、轉歸及治療。

實施例1：圖1為骨髓間充質干細胞人源化frgs小鼠模型構建示意圖，人骨髓間充質干細胞(hbmscs)移植暴發性肝衰竭frgs小鼠建立骨髓間充質干細胞人源化frgs小鼠模型。

1、用含10％胎牛血清的dmem培養基培養人骨髓間充質干細胞hbmscs。

2、frgs小鼠逐漸將藥物2-(2-硝基-4-三氟甲基芐基)-環己烷-1，3-二酮(ntbc)減量，注射0.2mg/kg抗fas抗體(jo2)，建立肝衰竭小鼠模型。

3、通過門靜脈注射500ul1×10⁶hbmscs。

4、移植后2、5、8天持續jo2注射。

5、通過尾靜脈每只小鼠注射a、b、c、d型1*10⁶乙肝病毒。

6、在注射乙肝病毒后的1周、2周、4周，后續每4周分別檢測乙肝病毒載量和肝功能狀態，確認模型建立成功。

圖1運用frgs小鼠，首先運用化學藥物ntbc建立暴發性肝衰竭，再運用人骨髓間充質干細胞移植，分化形成肝細胞，最后注射乙肝病毒，構建人源化慢性乙型肝炎小鼠模型。

實施例2：圖2為胚胎干細胞人源化upa小鼠模型構建示意圖，人胚胎干細胞系移植純合upa小鼠建立胚胎干細胞人源化upa小鼠模型。

1、用含10％胎牛血清的dmem培養基培養人胚胎干細胞。

2、獲得純合upa/scid小鼠模型。

3、出生8周時通過脾注射500ul1×10⁶人胚胎干細胞。

4、通過尾靜脈每只小鼠注射1*10⁷丙型肝炎病毒。

5、在注射丙肝病毒后的1周、2周、4周，后續每4周分別檢測病毒載量和肝功能狀態，確認模型建立成功。

圖2運用upa小鼠，upa會自發形成肝損害，再運用人胚胎干細胞移植，分化形成肝細胞，最后注射丙肝病毒，構建人源化慢性丙型肝炎小鼠模型。

實施例3，圖3為誘導多能干細胞人源化半乳糖胺正常小鼠模型構建示意圖，人誘導多功能干細胞(hipscs)注射正常免疫的暴發性肝衰竭小鼠建立誘導多能干細胞人源化正常小鼠模型。

1、通過基因轉染技術將某些轉錄因子導入動物或人的體細胞，使體細胞直接重構成多功能干細胞，用含10％胎牛血清的dmem培養基培養。

2、每只小鼠腹腔注射半乳糖胺1.5g/kg，建立肝衰竭小鼠模型。

3、通過肝臟注射500ul1×10⁶人誘導多功能干細胞。

4、通過尾靜脈每只小鼠注射1*10⁵戊型肝炎病毒。

5、在注射戊肝病毒后的1周、2周、4周，后續每4周分別檢測病毒載量和肝功能狀態，確認模型建立成功。

圖3運用小鼠，首先運用化學藥物半乳糖胺建立暴發性肝衰竭，再運用誘導人多能干細胞移植，分化形成肝細胞，最后注射戊型肝炎病毒，構建人源化慢性戊型肝炎小鼠模型。

實施例4：圖4為骨髓間充質干細胞人源化正常大鼠模型構建示意圖，人骨髓間充質干細胞(hbmscs)注射急性肝損傷正常大鼠建立骨髓間充質干細胞人源化正常大鼠模型。

1、正常人骨髓用淋巴細胞分離液分離純化人骨髓單核細胞，用含10％胎牛血清的dmem培養基培養，獲得人骨髓間充質干細胞hbmscs。

2、正常大鼠行50％肝切除術，建立急性肝損傷大鼠模型。

3、通過門靜脈注射500ul1×10⁶hbmscs。

4、通過尾靜脈每只小鼠注射a、b、c、d型1*10⁶乙肝病毒。

6、在注射乙肝病毒后的1周、2周、4周，后續每4周分別檢測病毒載量和肝功能狀態，確認模型建立成功。

圖4運用正常小鼠，首先運用外科50％肝臟切除建立急性肝損傷，再運用人骨髓間充質干細胞移植，分化形成肝細胞，最后注射乙肝病毒，構建人源化慢性乙型肝炎大鼠模型。

實施例5：圖5為人脂肪間充質干細胞人源化正常大鼠模型構建示意圖，人脂肪間充質干細胞(hadscs)注射肝損傷正常大鼠建立脂肪間充質干細胞人源化正常大鼠模型。

1、正常人脂肪組織分離純化人脂肪間充質干細胞，用含10％胎牛血清的dmem培養基培養，獲得人脂肪間充質干細胞hbmscs。

2、正常大鼠通過腹腔注射四氯化碳0.5ml/100g，建立急性肝損傷大鼠模型。

3、通過脾臟注射1000ul5×10⁶hadscs。

4、每只小鼠腹腔注射1*10⁶丙型肝炎病毒。

5、在注射丙型肝炎病毒后的1周、2周、4周，后續每4周分別檢測病毒載量和肝功能狀態，確認模型建立成功。

圖5運用正常小鼠，首先運用化學藥物四氯化碳建立急性肝損傷，再運用人脂肪間充質干細胞移植，分化形成肝細胞，最后注射丙肝病毒，構建人源化慢性丙型肝炎大鼠模型。

以上例舉的僅是本發明的優選實施方式，本發明并不限于以上實施例，本領域技術人員在不脫離本發明的精神和構思的前提下直接導出或聯想到的其他改進和變化，均應認為包含在本發明的保護范圍內。