專利名稱：一種人源抗鼻咽癌lmp1胞外區(qū)抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域和免疫靶向診療領(lǐng)域，涉及一種人源抗鼻咽癌LMPl胞外區(qū)抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鼻咽癌是來(lái)源于鼻咽上皮的高度惡性腫瘤，腫瘤進(jìn)展極易侵犯顱底等重要結(jié)構(gòu)， 并較早發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鼻咽癌表現(xiàn)為種族和地區(qū)分布的特點(diǎn)，是我國(guó)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率為20/100，000，已引發(fā)嚴(yán)重健康問(wèn)題。鼻咽癌是由 Epstein-Ban·病毒(EBV)的潛伏感染、環(huán)境因素和宿主的基因遺傳因素共同參與的多步驟交互作用而逐步形成的復(fù)雜性疾病。所有的鼻咽癌細(xì)胞都含有EBV基因組，并表達(dá)EBNA1， EBERl, EBER2，和LMP1，LMP2A，LMP2B，這使得這些病毒蛋白成為理想的腫瘤標(biāo)志物，其中 LMPl (latent membrane proteinl,LMP1)在鼻咽上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和癌變過(guò)程中的作用倍受關(guān)注，是目前公認(rèn)的病毒癌基因。它以其獨(dú)特的蛋白分子結(jié)構(gòu)參與鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的全過(guò)程。目前還沒(méi)有一種能夠具有靶向作用的人源抗鼻咽癌LMPl胞外區(qū)抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種人源抗鼻咽癌LMPl胞外區(qū)抗體。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述抗體在制備靶向作用于人類鼻咽癌LMPl胞外區(qū)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供能夠靶向作用于人類鼻咽癌LMPl胞外區(qū)的藥物。發(fā)明人通過(guò)建立潛伏膜蛋白I(LMPl)胞外區(qū)-GST融合蛋白作為抗原，以噬菌體抗體展示技術(shù)，利用細(xì)胞與抗原固相篩選相結(jié)合的方法進(jìn)行篩選人源噬菌體抗體庫(kù)(Fab抗體庫(kù))。多輪篩選后經(jīng)噬菌體酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(phage enzyme linked immunosorbent assay, phage ELISA)進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定。篩選出人源抗LMPl胞外區(qū)抗體Fab (命名為 HLEAFab)。原核表達(dá)HLEAFab抗體，表達(dá)蛋白產(chǎn)物使用ftOtein L親和層析柱純化；純化產(chǎn)物經(jīng)ELISA、流式細(xì)胞技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)進(jìn)行鑒定。進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)顯示該抗體與鼻咽癌細(xì)胞HNE2-LMP1胞外區(qū)特異性結(jié)合特性和靶向功能。在此基礎(chǔ)上，靶向鼻咽癌細(xì)胞LMPl胞外區(qū)人源抗體Fab結(jié)合絲裂霉素C制備免疫毒素HLEAFab-絲裂霉素 C(HLEAFab-MMC)。MTT法檢測(cè)HLEAFab-MMC對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞系HNE2-LMP1生長(zhǎng)的抑制作用； 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLEAFab-MMC對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HNE2-LMP1細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。觀察靶向鼻咽癌細(xì)胞LMPl胞外區(qū)人源抗體Fab-MMC免疫毒素體內(nèi)抑瘤效應(yīng)。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列措施實(shí)現(xiàn)的一種人源抗鼻咽癌LMPl胞外區(qū)抗體，該抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的抗體，其中編碼其輕鏈可變區(qū)氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示，編
3碼其重鏈可變區(qū)氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。所述抗體的表達(dá)載體，該表達(dá)載體為質(zhì)粒、噬菌粒或噬菌體。所述的抗體在制備靶向作用于人類鼻咽癌LMPl胞外區(qū)的藥物中的應(yīng)用一種藥物組合物，含有上述抗體和抗鼻咽癌藥物。所述的藥物組合物，其中上述抗體與抗鼻咽癌藥物化學(xué)偶聯(lián)。所述的藥物組合物，其中抗鼻咽癌藥物為絲裂霉素。本發(fā)明有益效果本發(fā)明利用基因重組技術(shù)，以噬菌體抗體展示技術(shù)篩選人源抗LMPl胞外區(qū)抗體 Fab,并制備靶向作用于鼻咽癌的免疫毒素HLEAFab-絲裂霉素C(HLEAFab-MMC)，為鼻咽癌治療提供了更多的藥物選擇。


圖1. LMPl胞外區(qū)融合基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)。其中M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1 :pGEX-4T-2載體誘導(dǎo)純化后的GST蛋白；2 :pGEX_LEDl誘導(dǎo)后的重組菌；3 誘導(dǎo)前的重組菌；4 非重組菌BL21 (DE3)。圖2.噬菌體抗體庫(kù)篩選的ELISA檢測(cè)結(jié)果。圖3.抗LMPl胞外區(qū)抗體Fab表達(dá)的western blot結(jié)果。其中1. ToplO空菌； 2. HLEAFab克隆超聲上清；3. HLEAFab克隆超聲沉淀；4. HLEAFab。圖4.純化的抗LMPl胞外區(qū)抗體Fab (HLEAFab) SDS-PAGE結(jié)果(純化的36號(hào)陽(yáng)性克隆表達(dá)產(chǎn)物)。圖5.純化的HLEAFab與細(xì)胞株HNE2-LMP1的結(jié)合的細(xì)胞ELISA測(cè)定結(jié)果。圖 6. HLEAFab 與 HNE2-LMP1 細(xì)胞結(jié)合的 FACS 結(jié)果。圖7. HLEAFab與腫瘤細(xì)胞株HNE2-LMP1的結(jié)合而不與HNE2細(xì)胞結(jié)合的免疫熒光結(jié)果。其中a 腫瘤細(xì)胞株HNE2-LMP1經(jīng)Fab染色；b 普通光學(xué)顯微鏡檢視；c 腫瘤細(xì)胞株 HNE2經(jīng)Fab染色；d 圖a與b普通光學(xué)顯微鏡檢視。圖8. HLEAFab-MMC與細(xì)胞株HNE2-LMP1的結(jié)合測(cè)定。圖9. HLEAFab-MMC對(duì)鼻咽癌HNE2-LMP1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制匪T實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖10. HLEAFab-MMC偶聯(lián)抗體作用于HNE2/LMP1的細(xì)胞周期和凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。圖11. HLEAFab-MMC偶聯(lián)抗體治療后鼻咽癌荷瘤各組裸鼠腫瘤體積的動(dòng)態(tài)變化結(jié)^ ο
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1人源抗LMPl胞外區(qū)抗體!^ab的制備與鑒定一、潛伏膜蛋白1 (LMPl)胞外區(qū)抗原的制備與純化1. LMP-I胞外區(qū)的基因序列來(lái)源于GenBank公布數(shù)據(jù)，LMP-I三段胞外區(qū) LMP-I[46-50]DffTGG, [98-103]WNLHGQ, [161-166]QQNWff 拼接成 WNLHGQ WNLHGQ QQNWff QQNWff DffTGG WNLHGQ WNLHGQ QQNWff QQNWff DffTGG (SEQ ID NO. 5)基因序列為 5，-GCGGATCCTGG MC CTG CAC GGT CAG TGG MC CTG CAT GGT CM CAG CM AAC TGG TGG CM CM AAC TGG TGG GAC TGG ACC GGT GGC TGG MC CTG CAC GGT CAG TGG AAC CTG CAC GGC CAG CAG CAA AAC TGG TGG CAG CAG AAC TGG TGG GAT TGG ACT GGC GGT TGAGAATTCG-3‘ (SEQ ID NO. 6)；并分別在5’端和3’端設(shè)計(jì)BamH I和EcoR I的酶切位點(diǎn)(下劃線處)，由南京賽百盛生物公司進(jìn)行全基因合成，并將LMPl胞外區(qū)重組基因(LEDl)克隆到pMDIS-T載體中而構(gòu)建成質(zhì)粒PMD18-LMP1 (南京賽百盛生物公司構(gòu)建，構(gòu)建的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù))。2. GST-LMPl胞外肽段質(zhì)粒的構(gòu)建(1).用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒pMD18_LMPl，將LMP-1胞外基因片段使用TAKARA公司膠回收試劑盒切膠回收；(2).使用 T4DNA 連接酶聯(lián)接到 pGEX-4T-2 表達(dá)質(zhì)粒(GE Healthcare)；(3).氯化鈣法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中涂布于LB瓊脂平板(100 μ g/ml氨芐青霉素抗性)上37°C孵育12小時(shí)。(4).培養(yǎng)后提取質(zhì)粒用BamH I和EcoR I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。最后通過(guò)核酸序列的測(cè)定和分析，重組質(zhì)粒命名為pGEX-LEDl。3. GST-LMPl胞外肽段融合蛋白的表達(dá)(1).將含有重組質(zhì)粒pGEX-LEDl和空載體pGEX_4T_2的BL21菌株接種到含氨芐青霉素(ΙΟΟμ g/L)的LB中，37°C震蕩過(guò)夜；(2).次日轉(zhuǎn)接，37°C培養(yǎng)至菌液吸光度(A)值600約0.6時(shí)，加異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，至 IPTG 終濃度為 lmmol/L， 25 °C 190r/min 震蕩； (3).誘導(dǎo)12小時(shí)，以未加IPTG菌液作對(duì)照。用12% SDS-PAGE電泳分析GST-LMP1
融合蛋白表達(dá)。4. GST-LMPl融合蛋白的純化(1).離心收集表達(dá)GST-LMPl膜外肽段融合蛋白菌液。用PBS 45ml重懸細(xì)菌，超聲碎菌。4°C收集上清過(guò)濾；(2).將含有GST-LMPl膜外肽段融合蛋白的上清經(jīng)Glutathione Sepharose 4B 親和層析柱(GE Healthcare)，用洗脫液(10mmol/L glutathione, 50mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0)洗脫，收集蛋白；(3).經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)含量與純度，樣品于_70°C貯存。二、交替固相法與差減法的篩選抗體Fab1.本發(fā)明采用基于固相抗原的篩選與基于細(xì)胞的篩選，差減篩選法選擇人鼻咽癌細(xì)胞HNE2為陰性細(xì)胞，大量表達(dá)LMPl的鼻咽癌細(xì)胞株HNE2-LMP1 (表面表達(dá)LMPl分子) 為陽(yáng)性細(xì)胞；固相篩選時(shí)GST-LMPl胞外肽段融合蛋白為抗原；人鼻咽癌HNE2和HNE2-LMP1 細(xì)胞系購(gòu)自湖南萬(wàn)百生物公司。2.基于細(xì)胞表面的差減篩選(1)抗體庫(kù)滴度測(cè)定采用pComb3X載體構(gòu)建Fab人源噬菌體抗體原庫(kù)(Jiao Y， Zhao P, Zhu J, Grabinski T, Feng Z, Guan X, Skinner RS, Gross MD, Hay RV, Tachibana H,Cao B. Construction of human naive Fab library and characterization of anti—metFab fragment generated from the library. Mol Biotechnol. 2005Sep ；31 (1) :41-54.), 多樣性約為2X109，保存于8%甘油中。將_80°C保存的噬菌體抗體原庫(kù)于冰上解凍后，取噬菌體上清1 μ 1加入Iml SB培養(yǎng)基(此為a液)，充分混勻。取a液1 μ 1加入Iml SB 培養(yǎng)基(此為b液)，充分混勻。取b液ΙΟΟμΙ加入900μ1 SB培養(yǎng)基(此為c液)，充分混勻。取c液100 μ 1加入900 μ 1 SB培養(yǎng)基(此為d液)，充分混勻。從b、c、d液中各取 1 μ 1稀釋的抗體原庫(kù)與50 μ 1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的XLl-blue (OD600約1. 0)于室溫下混合30min 后鋪板，于第二天通過(guò)菌落數(shù)測(cè)滴度，大腸桿菌XLl-blueGtratagene，LaJolla, CA Cat #200158)，使用前通過(guò)抗性(抗氨芐青霉素、抗卡那霉素)檢測(cè)與噬菌斑檢測(cè)排除污染。公式如下每微升噬菌體數(shù)=稀釋倍數(shù)X菌落數(shù)首輪準(zhǔn)備約IO13噬菌體；篩庫(kù)加入的體積數(shù)按需要的噬菌體數(shù)+每微升噬菌體數(shù)計(jì)算；如噬菌體滴度低，則將幾個(gè)不同離心管內(nèi)的噬菌體混合后加入1/5體積20%的PEG， 15% NaCl沉淀后用Iml 1 %的BSA-PBS溶解；(2)篩庫(kù)前一天接種單克隆XLl-blue于含IOml 30 μ g/ml四環(huán)素SB培養(yǎng)液的 50ml燒瓶中，37°C，250r/min，過(guò)夜，第二天按1 100用含10 μ g/ml四環(huán)素的SB培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接，注意OD6tltl不要超過(guò)1.0 ；(3)至少準(zhǔn)備HNE2細(xì)胞(為消除部分非特異性結(jié)合抗體的陰性細(xì)胞)與 HNE2-LMP1細(xì)胞(為細(xì)胞表面高表達(dá)抗原的陽(yáng)性細(xì)胞，用于結(jié)合特異性抗體)各100萬(wàn)個(gè)， 即150cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶70%長(zhǎng)滿后1-2瓶；(4)首先移去HNE2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，用10ml pH 7. 4的PBS洗三次，移去 PBS，再向每個(gè)培養(yǎng)瓶中移入IOml細(xì)胞解離液(購(gòu)自Invitrogen, Cat :13151-014)，37°C孵育 IOmin ；(5)此時(shí)大部分細(xì)胞應(yīng)已經(jīng)從瓶壁分離，少量仍貼壁者可用細(xì)胞鏟將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁中緩慢刮下，收集至一個(gè)1. 5ml的聚丙烯離心管內(nèi)，1800r/minX5min ；(6)仔細(xì)吸去上清，再加入Iml pH 7. 4PBS吹打重懸，按前述轉(zhuǎn)速及時(shí)間離心，用 pH 7. 4PBS洗滌三次；(7)最后一次洗滌后移去PBS，用溶于Iml 5% milk (non-fat)-PBS的噬菌體抗體庫(kù)重懸HNE2細(xì)胞，37°C混合30min ；在此同時(shí)按照相同方法準(zhǔn)備HNE2-LMP1細(xì)胞；(8)離心，1800r/minX5min，然后將上清轉(zhuǎn)移至HNE2-LMP1細(xì)胞(注意不要將 HNE2細(xì)胞帶出)，與HNE2-LMP1細(xì)胞37°C混合30min ；(9)離心，1800r/min，5min，棄去上清，再用 Iml 0. 1% BSA-PBS 洗滌，共 8 次；(10) 50 μ 1 0. 25 % 胰酶-EDTA (trypsin-EDTA，Invitrogen)重懸細(xì)胞沉淀， 370C 20min ；把上液加入 2ml XLl-blue (OD600 約 1. 0)，37°C 30min ；(11)向裝有感染了洗脫噬菌體細(xì)菌的離心管中補(bǔ)加事先預(yù)熱至37°C的6ml SB 培養(yǎng)液，向其中補(bǔ)充1. 6 μ 1羧芐霉素保存液(羧芐霉素溶于滅菌水配制成100mg/ml保存液，-20°C保存)，吸取2μ 1加入200 μ 1 SB，混勻。取10 μ 1、100 μ 1鋪板，計(jì)算洗脫噬菌體產(chǎn)量為第一輪產(chǎn)出(output)；洗脫噬菌體產(chǎn)量=菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)X 103，剩余菌液轉(zhuǎn)到 50ml 三角瓶中，250r/min，37°C Ih ；(12)補(bǔ)充2. 4μ 1羧芐霉素，相同條件再培養(yǎng)Ih ；
(13)加入 IO13VCSM 13 輔助噬菌體(購(gòu)自 Stratagene Cat :#0450468)，將整個(gè)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至含91ml預(yù)熱SB培養(yǎng)液的500ml燒瓶中，補(bǔ)充46 μ 1羧芐霉素保存液與184 μ 1 四環(huán)素保存液(四環(huán)素溶于75%酒精中配成5mg/ml保存液，-20°C保存)，繼續(xù)前述條件培
養(yǎng)(14)加入140 μ 1卡那霉素保存液(卡那霉素溶于滅菌水配成50mg/ml保存液，保存于-20°C)，過(guò)夜培養(yǎng)；(15)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至500ml離心瓶中，室溫，3，000g, 15min ；(16)上清中加入4g PEG，3g NaCl，搖晃混勻后于冰上靜置Ih ；(17)4°C離心，15，000gX15min ；(18)棄上清，將離心瓶口朝下置于紙上，將剩余的液體清除；(19)用Iml 1% BSA-PBS溶解噬菌體，用前述方法測(cè)定滴度，取IO13次級(jí)噬菌體抗體庫(kù)(基于細(xì)胞表面的差減篩選得到最后一輪噬菌體抗體庫(kù))用于下一輪篩選，共篩選5 輪；剩余保存于_80°C。3.固相篩選法方法(1)包被抗原在兩個(gè)1. 5ml的離心管中，分別將純化的GST (購(gòu)自genscript公司 Cat. No. z02039), GST-LMPl融合蛋白(見(jiàn)實(shí)施例1中潛伏膜蛋白1 (LMPl)胞外區(qū)抗原的制備與純化)溶于400 μ 1 ELISA包被緩沖液(0. 05mol/l碳酸鹽緩沖液ρΗ9· 6 =Na2CO3L 59g NaHC032. 93g蒸餾水1000ml)使終體積達(dá)到400 μ 1，GST-LMPl融合蛋白濃度為3 μ g/ml， 每孔中分別加入50 μ 1，每次篩庫(kù)每個(gè)濃度用8孔，4°C過(guò)夜；篩庫(kù)前一天及當(dāng)天按前述方法 (見(jiàn)基于細(xì)胞表面的差減篩選( 條)準(zhǔn)備細(xì)菌；(2)次日，次級(jí)抗體庫(kù) 250μ 1 與 5% milk (non-fat) 250 μ 1，37°C 30min ；(3)將上液以每孔50 μ 1加入GST包被的ELISA 8孔板中；(4)將包被了 GST-LMPl融合蛋白的八個(gè)孔棄去封閉液(5%脫脂牛奶-PBS)，拍干液體后；(5)將GST包被的ELISA八孔板中的Fab抗體庫(kù)(次級(jí)抗體庫(kù))50 μ 1轉(zhuǎn)入 GST-LMPl融合蛋白的8個(gè)孔中，蓋上塑料膜，37 °C 2h ；(6)甩去噬菌體，0. 5% TWEEN-TBS 洗滌向孔中加滿 0. 5% TWEEN-TBS，用 Iml Tip 頭反復(fù)吹打10次，靜置約5min，待氣泡完全消失，甩去孔中洗滌緩沖液，孔頂朝下拍打3次， 反復(fù)10次后再用裝于無(wú)菌塑料瓶中的洗滌緩沖液沖洗，甩去緩沖液后再拍打3次，反復(fù)5 次；(7)向每孔中加入約50 μ 1胰酶-EDTA，37°C 30min,用Tip頭猛烈吹打10次；剩余轉(zhuǎn)移到2ml當(dāng)日接種培養(yǎng)的XLl-blue (OD6tltlL 0左右)的12ml聚丙烯培養(yǎng)管中，室溫孵育 20min ；(8)向裝有感染了洗脫噬菌體細(xì)菌的離心管中補(bǔ)加事先預(yù)熱至37°C的6ml SB培養(yǎng)液，向其中補(bǔ)充1. 6 μ 1羧芐霉素保存液，12 μ 1四環(huán)素保存液，于37°C，250r/min, Ih ；同時(shí)取2μ1加入200μ1 SB，混勻。取10μ 1、100μ 1于LB-Agar/羧芐霉素培養(yǎng)液(羧芐霉素終濃度為100 μ g/ml)，37°C過(guò)夜生長(zhǎng)后數(shù)單菌落數(shù)目，計(jì)算產(chǎn)出噬菌體(output)；(9)補(bǔ)充2· 4μ 1羧芐霉素(100mg/ml)，相同條件再培養(yǎng)Ih ；(10)加入IO13VCSM 13輔助噬菌體，將整個(gè)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至含91ml預(yù)熱SB培養(yǎng)液的500ml燒瓶中，補(bǔ)充46 μ 1羧芐霉素保存液與184 μ 1四環(huán)素保存液，繼續(xù)前述條件培養(yǎng) 2h ；(11)加入140 μ 1卡那霉素保存液，過(guò)夜培養(yǎng)；(12)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至250ml離心瓶中，4°C離心，3，000g, 15min ；(13)上清中加入4gPEG，3gNaCl，37°C，250r/min，15min搖晃混勻完全溶解后于冰上靜置Ih ；(14)4°C離心，15，000g，30min ；(15)棄上清，將離心瓶口朝下置于紙上，將剩余的液體清除；(16)用500 μ 1 BSA-TBS溶解噬菌體，用前述方法(見(jiàn)基于細(xì)胞表面的差減篩選(1)條)測(cè)定滴度，取IX IO12噬菌體次級(jí)抗體庫(kù)用于下一輪篩選；剩余保存于-80°C。4.噬菌體ELISA挑選陽(yáng)性克隆(1)本過(guò)程需新鮮準(zhǔn)備的包被抗原。用ELISA包被緩沖液(同上)分別稀釋純化的GST和GST-LMPl融合蛋白至濃度為3 μ g/ml，每孔中加入50 μ 1，4°C過(guò)夜；(2)第二天甩去每板中的包被緩沖液，每孔中加滿ELISA洗滌緩沖液(0. 05% PBST 緩沖液含終濃度為0. 05% Tween-20的PBS溶液)，甩去，于紙上拍打三次洗滌，反復(fù)三次；(3)每孔中加新鮮配制的 1 % BSA-PBS, 37°C，1. 5h ；(4)最后一輪產(chǎn)出噬菌體2ml鋪四塊板，37°C孵箱中過(guò)夜培養(yǎng)；(5)次日晨用槍頭挑選60個(gè)單菌落分別接種于Iml SB培養(yǎng)基(100 μ g/ml氨芐青霉素及葡萄糖)，于12ml聚丙烯培養(yǎng)管中37°C震蕩培養(yǎng)；(6)約8-10h后，0D_達(dá)到0. 3，此時(shí)向每個(gè)培養(yǎng)管中加入IO9VCSM 13輔助噬菌體， 繼續(xù)37°C震蕩培養(yǎng)池；(7)每管中加入1.4μ 1 50mg/ml的卡那霉素至終濃度為701^/1111，搖床中371過(guò)
夜培養(yǎng)。(8)次日，將每根培養(yǎng)管標(biāo)號(hào)，3，OOOg離心，15min，每管中剩余的噬菌體暫存于 4 0C ；(9)以GST孔做對(duì)照組，GST-LMPl融合蛋白孔做實(shí)驗(yàn)組，甩去ELISA板中的封閉牛奶，吸取出50 μ 1過(guò)夜培養(yǎng)液上清與50 μ 11 % BSA-PBS混勻，按順序加入分別在對(duì)照孔 (GST)和實(shí)驗(yàn)孔(GST-LMP1融合蛋白)中加入同一克隆的噬菌體，留至少兩對(duì)孔加入含相同濃度抗生素及葡萄糖的SB培養(yǎng)液(100 μ g/ml氨芐青霉素及葡萄糖)作為空白對(duì)照， 37°C，2h ；(10)棄去噬菌體培養(yǎng)液，拍打三次后再用IOml移液管吸取0. 1 % TffEEN-PBS沖洗后再拍打三次，用此方法共洗滌五次；(11)每孔中再加入50μ 1 1 3，000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗Μ13 二抗，室溫Ih;(12)用(3)中的方法再次洗滌；(13)顯色，每孔中加入100 μ 1顯色底液(TMB與H2A按1 1混合)，20min后加 Λ IM H2SO4停止顯色；(14)于波長(zhǎng)450nm讀數(shù)記錄。5.陽(yáng)性克隆的測(cè)序(試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司，操作方法詳見(jiàn)大連寶生物工程公司 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 說(shuō)明書(shū))
(1) 2ml隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌，12000r/min離心2min，棄上清；(2)加入 250 μ 1 的 Solution I (含 RNase Al)，充分重懸細(xì)菌；(3)加入250 μ 1的Solution II，輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5_6次，使菌體充分裂解， 形成透明溶液；(4)加入400 μ 1 4°C預(yù)冷的Solutionlll，輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5_6次，直至形成緊實(shí)凝集塊，室溫靜置aiiin;(5) 12000r/min 離心 lOmin，取上清；(6) Spin Column 安置于 Collection Tube，上清置于 Spin Column 中；(7) 12000r/min 離心 lmin，棄濾液；(8)將 500 μ 1 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12000r/min 離心 30s，棄濾液；(9)將 700 μ 1 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12000r/min 離心 30s，棄濾液；(10)重復(fù)上一步，然后再12000r/min離心lmin，棄濾液；(11)將Spin Column安置于新的1. 5ml離心管，在Spin Column膜的中央處加入 60 μ 1經(jīng)60°C預(yù)熱的洗脫液，室溫靜置Imin ；(12) 12000r/min 離心 lmin，洗脫 DNA。測(cè)序。三、HLEAFab的表達(dá)1. Top 10F，購(gòu)自 Invitrogen (Cat :#C3030_03)，接種于含 30 μ g/ml 四環(huán)素的 LB-Agar培養(yǎng)液中，取單菌落于37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2.將過(guò)夜培養(yǎng)的Top 10F，以1 100接種于含30 μ g/ml四環(huán)素的SB培養(yǎng)液中， 37°C震蕩培養(yǎng)至OD 600約為0. 8 ；3.吸取Iyl陽(yáng)性克隆的噬菌體與50 μ 1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Top 10F’混合，于常溫下孵育15mins，然后鋪板生長(zhǎng)于含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB-Agar，37°C過(guò)夜生長(zhǎng)；4.次日，挑選單菌落接種于含100 μ g/ml氨芐青霉素，2%葡萄糖的SB培養(yǎng)液中， 37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；5.用含100 μ g/Ι氨芐青霉素，葡萄糖的SB培養(yǎng)液按1 100轉(zhuǎn)接過(guò)夜生長(zhǎng)的細(xì)菌，37°C震蕩培養(yǎng)直至OD 600達(dá)到1. 0 ；6. 5000r/min，5min，37°C離心，棄上清，用Iml含100 μ g/Ι氨芐青霉素的SB重懸
細(xì)菌；7.加入IPTG至終濃度為0. ImM，加入終濃度為4%的蔗糖溶液，于25°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。四、陽(yáng)性克隆表達(dá)的鑒定1.取100 μ 1過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液，離心，10，000g ；2.將上清與細(xì)菌沉淀分離，取10μ 1上清與相同體積的SDS 2Χ上樣緩沖液混勻， 100 °C 煮沸 5min ；3.向pH 7. 4PBS加入200mM苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為ImM，用200 μ 1重懸細(xì)菌沉淀，然后于冰水混合物中超聲處理5min ；4.再離心，10，000gX5mins ；5.取10 μ 1上清與相同體積的SDS樣緩沖液混勻，100°C煮沸5min ；6.上樣，蛋白電泳，90V，大約Ih左右；
7.轉(zhuǎn)膜，150mA，2h ；8.封閉，5% milk-PBS，將膜完全浸泡于封閉液中，37°C Ih ；9.洗滌三次(洗滌方法為加入PBST(0. 1 % TffEEN-PBS緩沖液)，室溫下于搖床上反復(fù)搖晃5min，然后棄去再加入PBST)；然后加入1 3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人 IgG(Fab)，，室溫下于搖床上搖晃Ih ；10.按前述方法再洗滌三次，加入HRP底物沖洗硝纖膜，約4 后曝光。五、陽(yáng)性克隆表達(dá)產(chǎn)物的純化1.取IL過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)HLEAFab的細(xì)菌培養(yǎng)液，離心細(xì)菌培養(yǎng)液， 10，OOOgX 15min ；2.細(xì)菌沉淀重懸于1/10細(xì)菌培養(yǎng)液體積的含ImM PMSF的pH 7. 4的20mM磷酸緩沖液；3.將重懸的液體分裝于50ml的聚丙烯離心管中，于冰水混合物中超聲處理，約 12min ；4.將超聲后的菌液再次聚集在一起，離心，15，000gX30min ；5.棄沉淀，上清通過(guò)0. 22 μ 1濾器過(guò)濾；6.準(zhǔn)備好AKTA-FPLC(美國(guó)GE公司AKTA-purifer蛋白純化系統(tǒng))與Protein L 親和層析柱(購(gòu)自genscript公司Cat. No. L00239)，從柱中先后流過(guò)2倍柱體積的去離子水及10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液(Νει2ΗΡ0420πιΜ NaCl 0. 15M，調(diào)節(jié)pH到7. 0)，平衡protein L-瓊脂糖親和層析柱；7.取待純化樣品上柱，流速為0. 5 lmL/min ；8.然后以同樣的流速依次用20倍柱床體積的結(jié)合緩沖液；9.上 5mL 洗脫緩沖液(Citric acid 0. 1M,調(diào)節(jié) pH 到 3. 0)，在 AKTA-FPLC 上根據(jù)峰值收集洗脫蛋白，并用0. lmol/L Tris堿中和收集的洗脫液至pH7. 0 7. 5 ；10.用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)含量，置4°C保存?zhèn)溆谩?1.純化的HLEAFab用SDS-PAGE鑒定其純度。用0. 12g/mL分離膠、0. 04g/mL濃縮膠，設(shè)低分子量標(biāo)準(zhǔn)，恒壓下電泳。考馬斯亮藍(lán)R250染色。純化的HLEAFab的活性用上述ELISA法鑒定；12.經(jīng)旋轉(zhuǎn)透析管(Centricon, Millipore Corp.，Bellerica, MA)離心換緩沖液溶解于pH 7. 4，PBS中濃縮保存。六、純化的HLEAFab與LMPl胞外區(qū)結(jié)合能力ELISA1.包被抗原及封閉方法詳見(jiàn)前，分為兩組包被抗原，第一組每孔中GST 600ng、 第二組GST-LMPl融合蛋白每孔600ng包被抗原；2.將純化的 HLEAFab 分別稀釋為 10、5、2. 5、1. 25、0. 625、0. 313、0. 156 μ g/ml，向每孔中加入50 μ 1稀釋的HLEAFab于常溫下孵育Ih ；3.洗滌后加入1 2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人二抗，室溫下Ih ；4.洗滌后加入底物顯色30min于加入IM硫酸中止顯色，于波長(zhǎng)450處讀數(shù)。七、HLEAFab細(xì)胞 ELISA 檢測(cè)1.用胰蛋白酶消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞；收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)；離心，1500r/min， IOmin ；
2.用1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞調(diào)整濃度4X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，分成三組，第一組鼻咽癌細(xì)胞株HNE2-LMP1細(xì)胞，第二組對(duì)照組肝癌細(xì)株7721細(xì)胞，第三組鼻咽癌細(xì)胞株HNE2 ；3.滴加到96孔培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔；37°C環(huán)境孵育過(guò)夜；4.用PBS洗板兩次；5.每孔加125 μ 1 10%福爾馬林緩沖液；于室溫環(huán)境下固定15min ；6.用雙蒸水洗滌三次；晾干；貯存于2_8°C ；7.用雙蒸水洗滌ELISA板兩次；8.每孔加 250 μ 1 含 2% BSA 的 PBS ；37°C孵育 Ih ；9.雙蒸水洗板三次；10.每孔加50 μ 1 Fab (依次用含BSA的PBS稀釋至濃度為20、5、1. 25、0. 313、 0. 078,0. 02,0. 005μ g/ml)，37°C孵育 2h ；11. 11、0. PBST 洗板五次；12.每孔加50 μ 1用含BSA的PBS稀釋的HRP酶標(biāo)抗人IgG(Fab) ；37°C孵育 lh；13. TMB顯色，顯色前按TMB H2O2 = I 1混合，100 μ 1/孔，在室溫下孵育20min ； 加IM硫酸溶液50 μ 1/孔；14.在酶標(biāo)儀上測(cè)0D490波長(zhǎng)的值。八、熒光激動(dòng)的細(xì)胞分類(fluorescence-activated cell sorting, FACS)1.分別培養(yǎng)HNE2與HNE2/LMP1細(xì)胞至約IO6個(gè)；2.用pH 7. 4PBS洗滌三次向每個(gè)培養(yǎng)瓶中移入IOml pH 7. 4，PBS后倒出；反復(fù)三次；3.向每個(gè)培養(yǎng)瓶中分別加入2_3ml細(xì)胞解離液(購(gòu)自Invitrogen，Ca 13151-014)，37°C，IOmin ；4.用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮落，再加入約Iml pH 7. 4PBS，轉(zhuǎn)入15ml的聚丙烯離心管， 1800r/min 離心，5min ；5.棄去上清，用Iml pH 7. 4PBS重懸細(xì)胞，再離心，1800r/min，5min，反復(fù)三次；6.用 IOml 1% BSA-PBS 于 4°C封閉 30min ；7.離心，將每種細(xì)胞分為兩份，一份用含50 μ g/ml HLEAFab的PBS Iml重懸，另一份用不含HLEAFab的PBS重懸，細(xì)胞均置于microtube中，于mixer上4V轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)45min ；8. 1800r/min 離心，5min ；棄去上清；9.用 Iml pH 7. 4PBS 重懸細(xì)胞，再離心，1800r/min，5min，反復(fù)三次;10.用 Iml 1 200 稀釋的 FITC-labeled anti human Fab IgG 重懸每份細(xì)胞，于 4°C轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)30min，本步驟中就用鋁箔包裹試管避光；11. 1800r/min離心，5min ；棄去上清；再用pH 7. 4PBS洗滌三次；12.將每份細(xì)胞用200μ1 pH 7. 4PBS重懸，于流式細(xì)胞儀分析光強(qiáng)度，其中未加 HLEAFab反應(yīng)者作為陰性對(duì)照。九、免疫熒光1.將上述兩種細(xì)胞分別接種于6孔培養(yǎng)皿中，每種細(xì)胞兩孔，每孔約1500細(xì)胞，直到約80%長(zhǎng)滿，其中每種細(xì)胞培養(yǎng)1孔作為實(shí)驗(yàn)觀察組，另1孔僅加入二抗作為陰性對(duì)照組；2.吸去培養(yǎng)液，用pH 7. 4PBS洗滌三次，方法為加入PBS后再吸去；3.加入按等體積混合的丙酮與甲醇混合液，室溫下固定20min ；4.吸去固定液(上述按等體積混合的丙酮與甲醇混合液)，再用去離子水洗三次， 洗滌方法為加入去離子水后吸去；5.用新鮮配制的5%脫脂牛奶-PBS在37°C封閉Ih ；6.陰性對(duì)照組繼續(xù)用封閉液(上述5%脫脂牛奶-PBS)處理，實(shí)驗(yàn)組中加入 20 μ g/ml HLEAFab 抗體，37 °C，Ih ；7.用pH 7.4PBS洗滌，方法同前；8.在無(wú)光條件下加入 1 200 稀釋的 FITC-Iabeled goat anti human Fab，室溫 0. 5h ；9.有用前述方法洗滌后于顯微鏡下觀察；FITC激發(fā)波長(zhǎng)494nm。結(jié)果一、LMP-I胞外肽段融合蛋白的表達(dá)與純化LMP-I胞外肽段的相對(duì)分子質(zhì)量為6. 2ku,加上^ku相對(duì)分子質(zhì)量的GST，融合蛋白預(yù)期的相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)為32. 2ku。轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pGEX-4T-2的BL21 (DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在相應(yīng)區(qū)域有濃染蛋白帶一條，與預(yù)期大小相吻合，而在^ku處的蛋白帶消失，說(shuō)明插入的外源基因已成功地在大腸桿菌中表達(dá)，并與GST形成了融合蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析， 含有表達(dá)載體的BL21(DE!3)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，可表達(dá)與預(yù)期分子量相符蛋白帶(圖1)。二、phage ELISA的陽(yáng)性克隆挑選我們于第7輪篩庫(kù)結(jié)束后挑選單克隆噬菌體擴(kuò)增進(jìn)行phage ELISA selection，把陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)定義為P/N > 2、OD450高于0. 5，結(jié)果僅有兩株克隆達(dá)到我們預(yù)定的陽(yáng)性克隆的標(biāo)準(zhǔn)，即30號(hào)與36號(hào)克隆。挑選2個(gè)ELISA信號(hào)最強(qiáng)的質(zhì)粒送檢，結(jié)果提示2株的基因型符合Fab基因型，且該Fab輕鏈為κ鏈，提示特異性30號(hào)和36號(hào)克隆從抗體庫(kù)中被挑選出來(lái)。挑選36號(hào)克隆命名為HLEAFab (圖2)。陽(yáng)性克隆序列的測(cè)定表1 :36號(hào)克隆的輕鏈可變區(qū)(上)及重鏈可變區(qū)(下)序列
權(quán)利要求
1.一種人源抗鼻咽癌LMPl胞外區(qū)抗體，其特征在于該抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于編碼其輕鏈可變區(qū)氨基酸的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3所示，編碼其重鏈可變區(qū)氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.權(quán)利要求1或2所述抗體的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體。
5.權(quán)利要求1或2所述的抗體在制備靶向作用于人類鼻咽癌LMPl胞外區(qū)的藥物中的應(yīng)用。
6.一種藥物組合物，其特征在于該組合物含有權(quán)利要求1或2所述抗體和抗鼻咽癌藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于權(quán)利要求1或2所述抗體與抗鼻咽癌藥物化學(xué)偶聯(lián)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于抗鼻咽癌藥物為絲裂霉素。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域和免疫靶向診療領(lǐng)域，公開(kāi)了一種人源抗鼻咽癌LMP1胞外區(qū)抗體及其應(yīng)用。該抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，該抗體能與人類鼻咽癌LMP1胞外區(qū)結(jié)合，可用于制備靶向作用于人類鼻咽癌LMP1胞外區(qū)的藥物。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102516388SQ20111036406
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者馮振卿, 張大為, 朱進(jìn), 陳仁杰 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院