本發明涉及海南三七，具體涉及一種海南三七根莖芽基部誘導再生植株的方法，屬于植物組織培養快速繁殖技術領域。

背景技術：

姜科(zingiberaceae)植物的繁殖方法可通過種子有性繁殖和切分根莖營養繁殖(高江云等，2006)。然而，有些種類是自交不親和的，有些是多倍體，均不能結種子，只能通過根莖繁殖(高江云等，2006)。切分根莖分株時，不要分得太小，一般不要少于3‐4個，太少會導致生長緩慢或死亡，同時需要帶有新生的塊莖，新分開的塊莖去掉所有莖、葉，以減少水分的喪失(高江云等，2006)。有的屬的植物可以通過莖桿扦插來繁殖，如閉鞘姜屬、舞花姜屬、姜花屬、姜屬的部分種類，將成熟的莖桿切成帶3‐4個節的莖段，直立插入沙土中2節，或莖段平放，用沙土稍微覆蓋，保持濕潤和遮蔭，一段時間后，其節上的芽就會萌蘗形成小植株，稍大后分離栽培(高江云等，2006)。

海南三七(kaempferiarotunda)屬于姜科山奈屬(kaempferia)植物，分布于廣東、廣西、云南、臺灣及亞洲南部至東南部(吳德鄰等，1981)。其葉叢生，葉片長橢圓形，葉面淡綠色，具暗綠色斑紋，不耐霜凍，冬季地上部分枯死；花先于葉直接從根莖抽出，頭狀花序具4‐6朵花，花白色，唇瓣較大，紫紅色；花期3‐4月；根莖藥用有消腫止痛的功效；觀葉類，株形好，葉漂亮，花晶瑩美麗，在夏秋季節可作為觀賞價值高的室內觀葉植物(吳德鄰等，1981；高江云等，2006；路國輝和王英強，2011；吳德鄰等，2016)。由于海南三七不結果，所以不能進行有性繁殖。其也沒有莖桿，因此，只能采用上述的切分根莖營養繁殖。因為母本量不足，切分根莖分株繁殖速度有限，而且對母株的損傷也很大，短期內得不到大量植株。

現有技術中，采用外植體誘導愈傷組織再分化成苗進行繁殖是可行的方法，但出苗率低，而且周期長。劉盼盼(華南師范大學碩士畢業論文，2013)將海南三七外植體分為假莖段(葉至塊根之間的假莖)、葉片、根狀莖、芽和莖尖(盆栽和組培苗)，結果盆栽的塊莖、假莖段和葉片通過誘導愈傷組織再分化獲得無菌苗的途徑均失敗；組培苗的假莖段和葉片誘導愈傷分化來獲得無菌苗，由于愈傷組織增殖及誘導時間較久，并且愈傷至苗的誘導率不足10％，很難快速達到所需的無菌苗株數，故不采用此方法；組培苗的幼芽或莖尖，接種到ms+6‐ba3.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l的培養基中，20d左右有愈傷組織產生，30d左右有絨毛狀根生成，但也發現，接種到兩種培養基ms+6‐ba2.0/3.0mg/l+naa0.10mg/l上誘導，均只有10％誘導成苗，此種方法愈傷組織分化成苗率低。吳丹(華南師范大學碩士畢業論文，2014)將海南三七無菌苗的三個不同部位(葉片、假莖段和假莖段基部)接種在含有不同濃度的6‐ba和2，4‐d組合的愈傷誘導培養基上，置于黑暗條件下培養，40d后統計愈傷組織誘導情況，發現只有假莖段基部成功誘導出愈傷組織，最佳生長調節劑組合為6‐ba2.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l，再接種到愈傷組織分化第一階段轉綠需時30d，再將轉綠的愈傷組織塊轉接入芽分化培養基中，40d左右可逐漸有苗長成，分化率大多集中在42％‐67％之間，此種方法愈傷分化出苗率仍然低，而且從外植體誘導愈傷到分化成苗就需時110d，周期長。

技術實現要素：

本發明針對現有技術的不足，本發明采用根莖芽基部作為外植體，提供了一種海南三七根莖芽基部誘導再生植物的方法，建立了高效的海南三七植株再生體系，顯著提高海南三七的組培繁殖效率。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

一種海南三七根莖芽基部誘導再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟：

(a)外植體前處理：采集海南三七的根莖用自來水清洗干凈，剪掉根莖上的貯藏根和須根后，消毒后晾干；再放入洗凈消毒的河沙中，恒溫發芽，洗凈根莖芽，取其芽基部為外植體材料；

(b)叢生芽誘導：將消毒好的外植體接種到誘導培養基上培養，直至外植體基部形成叢生芽；所述的誘導培養基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/l、萘乙酸0.01～0.10mg/l、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/l、卡拉膠粉9.5～10.0g/l；

(c)增殖繼代：當初代芽基部叢生芽長至4～6cm時，切下芽，截取芽基部1.0‐1.5cm接種到增殖培養基中誘導叢生芽；所述增殖繼代培養基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤3.0～8.0mg/l、萘乙酸0.05～0.10mg/l、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/l、卡拉膠粉9.5～10.0g/l；

(d)生根培養：當繼代苗高4～7cm時，切下接種到生根培養基中，所述生根培養基成分為ms、萘乙酸0.10～0.50mg/l、香蕉泥10.0～15.0％、活性炭1.0～1.5g/l、蔗糖20～30g/l、卡拉膠粉9.5～10.0g/l；

(e)煉苗移栽：當生根培養基上的苗高5～8cm時，在溫室自然光照下煉苗7～10d，取出瓶苗，洗凈根部培養基，百菌清溶液消毒后，移栽到進口泥炭的基質中，保持通風透氣，濕度在70～85％，溫度在20～32℃，自然光照條件培養后得移栽苗。

為了進一步實現本發明目的，優選地，步驟(a)所述的根莖芽的芽高為6‐18cm，有1片葉。

優選地，步驟(a)所述的消毒后晾干的消毒是將海南三七的根莖放入質量濃度0.1‐0.3％的多菌靈粉劑溶液中浸泡消毒30‐40min。

優選地，步驟(a)所述的恒溫發芽是在培養箱中33℃恒溫發芽下進行。

優選地，步驟(a)所述的外植體為切掉海南三七根莖芽上的葉片和莖尖后留下的1～2cm的芽基部。

優選地，以質量百分比濃度計，步驟b)所述外植體的消毒是先用0.1％‐0.3％高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽30～40min，再用0.1％～0.3％的百菌清溶液，浸泡根莖芽30～40min，接著在自來水下反復沖洗根莖芽30～40min；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留2～3cm高的根莖芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1～0.2％升汞溶液消毒15‐18min，滅菌水沖洗4～5次，切掉距離芽基部兩頭各約0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導培養基中。

優選地，步驟(e)中如果溫度高于32℃，用風機和水簾降溫。

優選地，所述誘導培養基、增殖繼代培養基和生根培養基的ph都為5.6～5.8；培養基滅菌條件為125℃，30～40min。

優選地，步驟(b)、步驟(c)和步驟(d)所述培養的溫度為25～30℃，光照強度為2000～2300lx，光照時間控制為14h/d。

優選地，步驟(e)所述百菌清溶液消毒是用0.1％～0.3％的百菌清溶液浸泡30～40min。

應用本發明的外植體消毒方法，消毒成活率可達到85～90％，15～20d能在外植體上觀察到肉眼可見的綠點。

相對于現有技術，本發明的優點和有益效果為：

(1)本發明采用海南三七根莖芽基部為外植體，建立了高效的以芽繁芽途徑的植株再生體系，外植體初代培養60～65d，啟動率87.50％～98.50％，出芽指數2.15～4.60，外植體大部分可以分化出2‐5個叢生芽，長勢較好；繼代增殖經約20～25d培養，單個叢生芽基部可分化出4～9個叢生芽，可在100～108d內完成從外植體誘導叢生芽、繼代增殖到生根苗形成的一個周期，單個叢生芽基部經過繼代增殖，每個繼代增殖周期可增殖4.69～7.56倍個叢生芽，即單個外植體在100～108d內可出芽10.08～34.77個。現有技術中，從外植體誘導愈傷到分化成苗就需時110d，而且每塊愈傷分化成苗2.38～3.75個。對比現有技術，本發明單個外植體在100～108d內可出芽10.08～34.77個，大大提高了海南三七的繁殖系數和減短了海南三七的繁殖周期。

(2)本發明只需簡單的植物組織培養設備，就可在100～108d內完成從外植體誘導叢生芽、繼代增殖到生根苗形成的一個周期，因此，可在短時間內獲得大量的組培苗。本發明繁殖的海南三七種苗，能保持母株的優良特性，移栽成活率可達90％以上，具有投入低、產出高的優勢。

附圖說明

圖1實施例1洗凈的海南三七根莖圖片。

圖2實施例1在河沙中萌發洗凈的根莖芽圖片。

圖3實施例1海南三七根莖芽基部外植體接種誘導培養基15d出現芽萌動圖片。

圖4實施例1外植體誘導出的叢生芽圖片。

圖5實施例1繼代增殖的叢生芽圖片。

圖6實施例1生根培養形成的根系圖片。

圖7實施例1洗凈根部培養基消毒后的組培苗圖片。

圖8實施例1移栽成活的組培苗圖片。

具體實施方式

為更好地理解本發明，下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的說明，但實施例并不構成對本發明保護范圍的限定。除非特別說明，本發明所采用的試劑和設備為本技術領域常規試劑和設備。

誘導培養基、增殖繼代培養基和生根培養基的ms，為國際通用的培養基，其成分和配制方法如下：

ms大量元素母液100倍：稱100l量溶解在1l蒸餾水中，配1l培養基取母液10ml。母液的具體配法為：分別稱硝酸銨165g，硝酸鉀190g，二水氯化鈣44g，七水硫酸鎂37g，磷酸二氫鉀17g，分別加蒸餾水溶解后再混合，最后定容于1l。

ms微量元素母液1000倍：稱1000l量溶解在1l蒸餾水中，配1l培養基取母液1ml。母液的具體配法為：分別稱四水硫酸錳22.3g，七水硫酸鋅8.6g，硼酸6.2g，碘化鉀0.83g，二水鉬酸鈉2.5g，五水硫酸銅0.25g，六水氯化鈷0.25g，分別加蒸餾水溶解后再混合，最后定容于1l。

ms鐵鹽母液100倍：稱100l量溶解在在1l蒸餾水中，配1l培養基取母液10ml。母液的具體配法為：分別稱乙二胺四乙酸二鈉3.73g，七水硫酸亞鐵2.78g，分別加蒸餾水溶解后再混合，最后定容于1l。

ms有機母液100倍：稱100l量溶解在在1l蒸餾水中，配1l培養基取母液10ml。母液的具體配法為：分別稱煙酸0.05g，鹽酸吡哆素0.05g，鹽酸硫胺素0.01g，肌醇10g，甘氨酸0.2g，分別加蒸餾水溶解后再混合，最后定容于1l。

實施例1

一種海南三七根莖芽基部誘導再生植株的方法，包括如下步驟：

(a)外植體前處理：采集海南三七的根莖用自來水清洗干凈，剪掉根莖上的貯藏根和須根后，放入質量濃度0.3％的多菌靈粉劑溶液中浸泡消毒30min，然后取出晾干表面水分，如圖1所示。再放入洗凈消毒的河沙中，培養箱中33℃恒溫發芽，洗凈芽，如圖2所示，芽高6～18cm。消毒后，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留取芽基部為外植體材料。

(b)叢生芽誘導：將消毒好的外植體接種到誘導培養基上培養；如圖3所示，外植體為根莖芽基部，高約1～2cm，在誘導培養基上培養15d就可觀察到肉眼可見的綠點。外植體在誘導培養基上繼續培養，直至外植體基部形成叢生芽；如圖4所示，外植體在誘導培養基上培養60d就可形成3～5個叢生芽，外植體的啟動率為98.50％，出芽指數為4.60[注：啟動率＝(啟動的外植體數/接種外植體總數)×100％；出芽指數：外植體上的出芽數的平均數]。所述的誘導培養基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤3.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁15.0％、蔗糖30g/l、卡拉膠粉10.0g/l。

步驟(b)所述外植體的消毒是先用0.3％高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽30min，再用0.3％的百菌清溶液浸泡根莖芽30min，接著在自來水下反復沖洗根莖芽40min；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留2～3cm高的根莖芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1％升汞溶液消毒18min，滅菌水沖洗4次，切掉距離芽基部兩頭各約0.3～0.5cm的部分，留約1～2cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導培養基中。

(c)增殖繼代：當初代芽基部叢生芽長至4～6cm左右時，切下芽，截取芽基部1.0～1.5cm接種到增殖培養基中誘導叢生芽；如圖5所示，為在繼代增殖培養基上培養20d就可形成6‐9個叢生芽，增殖系數為7.56(增殖系數＝統計時的總芽數/接種時總芽數)。所述增殖繼代培養基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤8.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁15.0％、蔗糖30g/l、卡拉膠粉10.0g/l。

(d)生根培養：當繼代苗高4～7cm時，切下接種到生根培養基中；如圖6所示，為在生根培養基上培養20d就可形成白色的根。所述生根培養基成分為ms、萘乙酸0.10mg/l、香蕉泥15.0％、蔗糖30g/l、活性炭1.0g/l、卡拉膠粉10.0g/l。

(e)煉苗移栽：當生根培養基上的苗高5～8cm時，在溫室自然光照下煉苗10d，取出組培苗，洗凈根部培養基，用0.3％的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分，如圖7所示，組培苗粗壯。移栽到進口泥炭的基質中，保持通風透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，自然光照條件培養后得到移栽苗；如圖8所示，為在進口泥炭中種植25d后得到長勢良好的移栽苗。

上述誘導培養基、增殖繼代培養基和生根培養基的ph都為5.8；培養基滅菌條件為125℃，40min。

步驟(b)、步驟(c)和步驟(d)所述培養溫度為25～30℃，光照強度為2300lx，光照時間控制為14h/d。

步驟(e)中如果溫度高于32℃，用風機和水簾降溫。

實施例1從外植體誘導、繼代增殖到生根苗約需時100d的時間。

實施例2

一種海南三七根莖芽基部誘導再生植株的方法，包括以下步驟：

(a)外植體前處理：采集海南三七的根莖用自來水清洗干凈，剪掉根莖上的貯藏根和須根后，放入質量濃度0.1％的多菌靈粉劑溶液中浸泡消毒40min，然后取出晾干表面水分。再放入洗凈消毒的河沙中，培養箱中33℃恒溫發芽，洗凈根莖芽。消毒后，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留取芽基部為外植體材料。

(b)叢生芽誘導：將消毒好的外植體接種到誘導培養基上培養，直至外植體基部形成叢生芽，需時約65d就可長出2～3個叢生芽，外植體的啟動率為83.60％，出芽指數為2.15；所述的誘導培養基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤1.0mg/l、萘乙酸0.01mg/l、椰汁10.0％、蔗糖20g/l、卡拉膠粉9.5g/l；

步驟(b)所述外植體的消毒是以質量百分比濃度計，先用0.1％高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽40min，再用0.1％的百菌清溶液浸泡根莖芽40min，接著在自來水下反復沖洗根莖芽30min；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留2～3cm高的根莖芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.2％升汞溶液消毒15min，滅菌水沖洗5次，切掉距離芽基部兩頭各約0.3～0.5cm的部分，留約1～2cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導培養基中。

(c)增殖繼代：當初代芽基部叢生芽長至4～6cm左右時，切下芽，截取芽基部1.0～1.5cm接種到增殖培養基中培養25d就可形成4～6個叢生芽，增殖系數為4.69；所述增殖繼代培養基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤3.0mg/l、萘乙酸0.05mg/l、椰汁10.0％、蔗糖20g/l、卡拉膠粉9.5g/l；

(d)生根培養：當繼代苗高4～7cm時，切下接種到生根培養基中，需時約18d；所述生根培養基成分為ms、萘乙酸0.30mg/l、香蕉泥10.0％、活性炭1.5g/l、蔗糖20g/l、卡拉膠粉9.5g/l；

(e)煉苗移栽：當生根培養基上的苗高5～8cm時，在溫室自然光照下煉苗7d，取出試管苗，洗凈根部培養基，用0.1％的百菌清溶液浸泡30min，移栽到進口泥炭的基質中，保持通風透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，自然光照條件培養后得到移栽苗。

上述誘導培養基、增殖繼代培養基和生根培養基的ph都為5.6；培養基滅菌條件為125℃，30min。

步驟(b)、步驟(c)和步驟(d)所述培養溫度為25～30℃，光照強度為2000lx，光照時間控制為14h/d。

步驟(e)中如果溫度高于32℃，用風機和水簾降溫。

實施例2從外植體誘導、繼代增殖到生根苗約需時108d的時間。

實施例3

一種海南三七根莖芽基部誘導再生植株的方法，包括如下步驟：

(a)外植體前處理：采集海南三七的根莖用自來水清洗干凈，剪掉根莖上的貯藏根和須根后，放入質量濃度0.2％的多菌靈粉劑溶液中浸泡消毒35min，然后取出晾干表面水分。再放入洗凈消毒的河沙中，培養箱中33℃恒溫發芽，洗凈芽。消毒后，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留取芽基部為外植體材料。

(b)叢生芽誘導：將消毒好的外植體接種到誘導培養基上培養，直至外植體基部形成叢生芽，需時約63d，可形成3～4個叢生芽，外植體的啟動率為95.70％，出芽指數為3.50；所述的誘導培養基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤2.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁10.0％、蔗糖30g/l、卡拉膠粉10.0g/l；

步驟(b)所述外植體的消毒是先用0.2％高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽30min，再用0.2％的百菌清溶液浸泡根莖芽30min，接著在自來水下反復沖洗根莖芽40min；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留2～3cm高的根莖芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1％升汞溶液消毒18min，滅菌水沖洗4次，切掉距離芽基部兩頭各約0.3～0.5cm的部分，留約1～2cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導培養基中。

(c)增殖繼代：當初代芽基部叢生芽長至4～6cm左右時，切下芽，截取芽基部1.0～1.5cm接種到增殖培養基中培養22d就能誘導5～7個叢生芽，增殖系數為5.87；所述增殖繼代培養基成分為ms、6‐芐氨基腺嘌呤5.0mg/l、萘乙酸0.10mg/l、椰汁10.0％、蔗糖30g/l、卡拉膠粉10.0g/l；

(d)生根培養：當繼代苗高4～7cm時，切下接種到生根培養基中，需時約17d，所述生根培養基成分為ms、萘乙酸0.50mg/l、香蕉泥10.0％、蔗糖30g/l、活性炭1.0g/l、卡拉膠粉10.0g/l；

(e)煉苗移栽：當生根培養基上的苗高5～8cm時，在溫室自然光照下煉苗10d，取出組培苗，洗凈根部培養基，用0.2％的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分，移栽到進口泥炭的基質中，保持通風透氣，濕度在70‐85％，溫度在20‐32℃，自然光照條件培養后得到移栽苗。

上述誘導培養基、增殖繼代培養基和生根培養基的ph都為5.8；培養基滅菌條件為125℃，40min。

步驟(b)、步驟(c)和步驟(d)所述培養溫度為25～30℃，光照強度為2300lx，光照時間控制為14h/d。

步驟(e)中如果溫度高于32℃，用風機和水簾降溫。

實施例3從外植體誘導、繼代增殖到生根苗約需時102d的時間。

本發明采用海南三七的根莖芽基部為外植體，建立了高效的以芽繁芽途徑的植株再生體系，外植體初代培養60～65d，啟動率87.50％～98.50％，出芽指數2.15～4.60，外植體大部分可以分化出2‐5個叢生芽，長勢較好；繼代增殖經約20～25d培養，單個叢生芽基部可分化出4～9個叢生芽，可在100～108d內完成從外植體誘導叢生芽、繼代增殖到生根苗形成的一個周期，單個叢生芽基部經過繼代增殖，每個繼代增殖周期可增殖4.69～7.56倍個叢生芽，即單個外植體在100～108d內可出芽10.08～34.77個。

現有技術中，劉盼盼(華南師范大學碩士畢業論文，2013)將海南三七外植體分為假莖段(葉至塊根之間的假莖)、葉片、根狀莖、芽和莖尖(盆栽和組培苗)，結果盆栽的塊莖、假莖段和葉片通過誘導愈傷組織再分化獲得無菌苗的途徑均失敗；組培苗的假莖段和葉片誘導愈傷分化來獲得無菌苗，由于愈傷組織增殖及誘導時間較久，并且愈傷至苗的誘導率不足10％，很難快速達到所需的無菌苗株數；組培苗的幼芽或莖尖，接種到ms+6‐ba3.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l的培養基中，20d左右有愈傷組織產生，30d左右有絨毛狀根生成，但也發現，接種到兩種培養基ms+6‐ba2.0/3.0mg/l+naa0.10mg/l上誘導，均只有10％誘導成苗，此種方法愈傷組織分化成苗率低。

吳丹(華南師范大學碩士畢業論文，2014)將海南三七無菌苗的假莖段基部接種在ms+6‐ba2.0mg/l+2,4‐d1.0mg/l培養基上，置于黑暗下培養，40d后誘導出愈傷組織，再接種到愈傷組織分化第一階段轉綠需時30d，此時每塊愈傷平均可得到5.69個芽點，再將轉綠的愈傷組織塊轉接入芽分化培養基中，40d左右可逐漸有苗長成，分化率在42％～67％，即僅僅從外植體誘導愈傷到分化成苗就需時110d，每塊愈傷分化成苗2.38～3.75個。

現有技術從外植體誘導愈傷到分化成苗就需時110d，而且每塊愈傷分化成苗2.38～3.75個；本發明單個外植體在100～108d內可出芽10.08～34.77個，大大提高了海南三七的繁殖系數和減短了海南三七的繁殖周期，可在短時間內獲得大量的組培苗。本發明繁殖的海南三七種苗，能保持母株的優良特性，移栽成活率可達90％以上，具有投入低、產出高的優勢。