本發明屬于作物抗性育種技術領域，尤其涉及一種煙草品種對煙粉虱抗性的鑒定方法。
背景技術：
煙粉虱屬于同翅目粉虱科，原發生熱帶、亞熱帶和溫帶邊緣地區，20世紀后半葉，隨著區域間種苗的調運和其它貿易活動而向世界各地迅速擴散，是一種重要的世界性經濟害蟲。煙草屬茄目，茄科一年生或有限多年生草本植物，基部稍木質化。花序頂生，圓錐狀，多花；蒴果卵狀或矩圓狀，長約等于宿存萼，夏秋季開花結果。
近年來，煙粉虱危害在我國煙田頻頻發生，對煙葉生產和品質產生較大的影響，造成煙草減產20％-30％，甚至絕產。煙粉虱是近幾年在世界范圍內迅速發展起來的一種發生范圍廣、危害程度重、傳毒能力強、防治難度大的主要農業害蟲，國內外一些學者對煙粉虱的發生規律、危害癥狀、傳播病毒、行為特性以及防治方法等進行了研究，由于煙粉虱具有遷飛能力強、體被蠟質、繁殖能力強、食性雜、易產生抗藥性等生物學特性，煙粉虱的防治十分困難，所以選育抗煙粉虱的煙草品種是防治煙粉虱最經濟有效的方法。
準確鑒定煙草品種對煙粉虱的抗性是煙草抗煙粉虱遺傳和育種研究的基礎。該蟲蟲體較小，成蟲具有極強的流動性，鑒定煙草對煙粉虱的抗性十分困難。通過對田間試驗的216份煙草品種資源感染煙粉虱若蟲進行調查，初步提出煙草抗煙粉虱的鑒定方法，雖然能夠比較煙草品種之間煙粉虱抗性的差異，但鑒定結果容易受環境影響，適用范圍也具有一定的局限性。由于煙粉虱發生時間較晚，鑒定比較困難，目前國內外尚未見其他有關煙草抗煙粉虱鑒定的研究報道。
技術實現要素：
針對上述問題，本發明提供了一種能有效減少工作量、提高準確性、可對單個或少量的煙草品種進行鑒定并且鑒定條件可控的煙草品種對煙粉虱抗性的鑒定方法。具體技術方案如下：
一種煙草品種對煙粉虱抗性的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：
(a)種植待鑒定的煙草品種、抗性對照煙草品種以及用于繁殖煙粉虱的寄主；并用防蟲網覆蓋寄主，抗性對照煙草品種包括已知抗性的高抗煙草品種和高感煙草品種，高抗煙草品種和高感煙草品種的品種數量對等，不少于5種，比如可以各為5種，待鑒定煙草品種可以為1種或者幾種。
(b)培育煙粉虱種群，并將煙粉虱種群接種到寄主上進行寄主繼代飼養。
(c)當待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種長到相同苗齡時，釋放煙粉虱到待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種上。
(d)分別統計記錄待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種煙草自上而下第5-8片葉片中隨機一片的成蟲數量和若蟲數量。
(e)計算蟲量比值。
(f)進行抗性評價。
進一步，計算蟲量比值的具體方法為：
ф＝(a+b)*n/(c+d)；
ф：待鑒定煙草品種蟲量與所有種植的煙草品種蟲量的平均值的比值；
a：待鑒定煙草品種上調查的成蟲頭數；
b：待鑒定煙草品種上調查的若蟲頭數；
c：所有待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種上調查的成蟲總頭數；
d：所有待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種上調查的若蟲總頭數；
n：所有待鑒定鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種的品種總數，n的最小取值為6。
進一步，所述進行抗性評價的具體方法為：當0≦ф＜0.20時，鑒定為高抗品種(hr)；當0.20≦ф＜0.40，鑒定為抗品種(r)；當0.40≦ф＜0.60，鑒定為中抗品種(m)；當0.60≦ф＜1.0，鑒定為感煙粉虱品種(s)；當1.0≦ф，鑒定為高感品種(hs)。
進一步，釋放煙粉虱的第8天，統計記錄待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種煙草自上而下第5-8片葉片中隨機一片的成蟲數量和若蟲數量。
進一步，鑒定煙草品種、抗性對照煙草品種以及寄主都是在溫室中種植培育的，溫室的環境條件為：溫度：22～26℃，相對濕度：60％～80％，光周期：14l︰10d；煙草育苗采用嚴格的工廠化育苗方式，把培育的煙苗移至較大的花盆，每個品種20盆，3次重復，煙草幼苗用配方營養土(泥炭：蛭石：有機肥按6︰1︰1體積比混合)種在直徑為40cm的花盆中，在溫室內培養至煙苗長出18-22片有效葉后備用，溫室環境條件為溫度：22～26℃，相對濕度：60％～80％，光周期：14l︰10d。
進一步，煙粉虱種群是在養蟲室中培養的，所述養蟲室的環境條件為：溫度：26±1℃，相對濕度：60％～80％，光周期：14l︰10d；同時，溫室內種植培育用于寄生煙粉虱的白花菜豆，每連續飼養3代進行檢查以保證純度，試驗開始時繼代種群已連續飼養12代，接種方式采用本領域人員通常采用的接種籠進行接種煙粉虱，當煙粉虱長成成蟲后在白花菜豆上進行接種。
進一步，相同苗齡為打頂期；當待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種長到打頂期時，將繁殖的煙粉虱均勻的釋放到待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種上，讓煙粉虱在煙草間選擇和取食，釋放煙粉虱前先用殺蟲劑對溫室中的害蟲防治一次，保證無其它蟲害干擾，然后將在寄主上飼養的煙粉虱釋放到種植的待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種的溫室中，輕輕拍打寄主藤蔓，任其自由擴散，按煙草盆數：寄主盆數＝10:1的比例釋放煙粉虱，寄主上覆蓋具有一定目數的防蟲網，該數目優選為50目，可以有效分離出大量整齊一致的煙粉虱。
進一步，寄主包括：白花菜豆、南瓜、西葫蘆、紅花菜豆、茄子，優選白花菜豆。
進一步，抗性對照煙草品種包括已知抗性的高抗煙草品種和高感煙草品種，高抗煙草品種包括：g140、云煙203、云煙98、k326、k346、遼煙15、云煙97、吉煙9號、云煙100、v2；高感品種包括：胎里富1060、大黃金5210、閩煙57、閩煙9、cf220、粵煙97、cf225、g80、粵煙96、cf226。
本發明的有益效果是：
1、本發明的鑒定過程在溫室中進行，環境條件可控，并且不受季節和時間的限制，鑒定周期短，在煙草品種對煙粉虱抗性程度評價方面更客觀，方法簡單，易于操作。
2、本發明通過計算待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種的蟲量比值可以對單個或者多個煙草品種進行抗性評價，提高鑒定效率，節省試驗時間。
3、本發明只調查打頂期煙草自上而下第5-8個葉片上的成蟲和若蟲數量，減輕了工作量和鑒定工作強度。
4、本發明在分別在養蟲室和溫室中對煙粉虱進行育種和繁殖，保障了煙粉虱的數量和質量，鑒定結果更準確。
5、本發明采用了統一的蟲量比，可減少不同地區間評價結果的差異。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1煙粉虱在煙草上的分布規律
(1)試驗材料：
供試昆蟲，煙粉虱2012年采自山東諸城煙田，經mtdnacoⅰ基因序列測序方法(羅晨等，2002)鑒定為q型煙粉虱，q型煙粉虱已被列入全球100種最危險入侵生物之一。溫室內以白花菜豆為寄主繼代飼養，每連續飼養3代進行檢查以保證純度。試驗開始時繼代種群已連續飼養12代。煙粉虱種群在(26±1)℃，rh60％～80％，14l︰10d條件下的養蟲溫室內飼養。當煙粉虱長至成蟲時，在寄主白花菜豆上進行接種，煙粉虱的接種采用本領域技術人員常規接種方法，即采用接種籠進行煙粉虱接種。
供試煙草，供試煙草品種：中煙102、紅大、金海1號、g140、革新3號、blueriver、龍江981、rg17云煙203、云煙98、k326、k346、遼煙15、云煙97、吉煙9號、藍玉1號、長脖黃、中煙201、畢納一號、魯煙2號、云煙203、龍江915、云白2號、中煙203、龍江851、云煙100、v2、永定1號、云煙85、吉煙11號、豫煙6號、中煙98、豫煙7號、吉煙7號、云煙1號、中煙107、中煙202、閩煙9號、中煙14、fy119、中煙9203、南江3號、小黃金0138、遵煙6號、yhbs1、z2084、吉煙5號、小黃金0644、中煙99、韭菜坪1號、韭菜坪2號、龍江921、寧東鳳凰煙、秦煙98、中煙100、遼煙17、大虎耳、湘煙3號、坊子小黃金、秦煙97、小黃金1025、遵煙2號、nc71、云煙205、川煙1號、、3618、中煙103、redhort、virginia115、virginiayellow、秦煙96、72-41-111、鄂煙6號、重型煙、tn97、云煙87、遼煙103、鄂煙209、胎里富1061、單育3號、鄂煙98、金星6007、tl106、中煙204、小黃金0091、golddollar、保險黃、胎里富1060、大黃金5210、閩煙57、閩煙9、cash、climax、virginiabright、82-3002、speightg-28、stering、coker319、ky151、sc58、speightg-140、鄂煙101、湄潭龍平多葉、520、cf220、粵煙97、cf225、g80、cautcher、、粵煙96和cf226ms革新1號、dixiebright、vesta33、nc82、泰國白花烤煙、hb04p、hb39p、r630、nc3、kbm20、大黃葉煙、msg28、包皮、五峰1號、feb-86、78-3013、云白3號、小黃金006、小黃金、nc95、hb06p、hicks、narrowleaforinoco。
(2)試驗處理：
溫室內試驗，2012年5月12日移栽。把培育的煙苗移至較大的花盆，每個品種20盆，3次重復。幼苗用配方營養土(泥炭：蛭石：有機肥按6︰1︰1體積比混合)種于直徑40cm塑料盆中，在溫溫室內培養至18-22片有效葉時，備用。溫室環境條件為22～26℃，rh60％～80％，14l︰10d。
打頂后，種植的煙草處于旺長至成熟采收期時釋放煙粉虱。釋放煙粉虱前先用殺蟲劑對溫室中的害蟲防治一次，保證無其它蟲害干擾，然后將在白花菜豆上飼養的煙粉虱釋放到種植的試驗煙草品種的溫室中，輕輕拍打白花菜豆藤蔓，任其自由擴散(按煙草盆數：白花菜豆盆數＝10:1的比例釋放煙粉虱)。
田間試驗：2012年5月10移栽。田間試驗在中國農業科學院煙草研究所試驗田完成。將培育的供試煙草品種按照每個品種移栽一個小區(面積為100m2)，各設3個重復。不施用殺蟲劑，其它管理按照煙葉常規生產進行。
(3)調查統計：
溫室內試驗在釋放煙粉虱后第8天調查，田間試驗在煙粉虱高峰期調查。
每個煙草品種隨機調查10株煙草每片煙葉上的煙粉虱成蟲數量和若蟲數量，3次重復。按3:4:3的比例，將每株煙草葉片分為上部、中部、下部三個部位(例如打頂后煙草有效葉片為20片，上部為1-6片，中部為7-14片，下部為15-20片)，采用microsoftexcel進行統計煙草上部、中部、下部三個部位每個葉片上的平均成蟲和若蟲數量。
(4)結果與分析：
從溫室內試驗調查結果統計可知，就煙粉虱在單株煙草葉片上的分布情況來說，煙粉虱成蟲和若蟲均主要分布在自上而下5-8片煙草煙葉背面。
把煙株上的煙葉按照上部、中部和下部三個部位劃分來統計分析，從表1中可知，溫室內試驗處理的134個煙草上部、中部、下部葉片上成蟲和若蟲的平均數量間差異顯著(成蟲：f2,6＝53.3，p<0.05；若蟲：f2,6＝36.7，p<0.05)。其中中部葉片上煙粉虱成蟲和若蟲數量均最多，分別為88.6頭和93.4頭；其次為上部葉片，分別為61.4頭和58.5頭；下部葉片分布最少，分別為33.9頭和27.6頭。煙粉虱成蟲和若蟲均主要分布在自上而下5-8片煙草煙葉背面。134個煙草品種間煙株煙粉虱成蟲和若蟲總數差異顯著(f133,268＝72.9，p<0.05)。
表1煙粉虱在溫室內134個煙草品種煙株上垂直分布特征
從大田試驗調查結果統計可知，就煙粉虱在單株煙草葉片上的分布情況來說，煙粉虱成蟲和若蟲均主要分布在自上而下5-8片煙草煙葉背面。
把煙株上的煙葉按照上部、中部和下部三個部位劃分來統計分析，從表2中可知，田間試驗處理的134個煙草上部、中部、下部葉片上成蟲和若蟲的平均數量間存在差異顯著性(成蟲：f2,6＝61.7，p<0.05；若蟲：f2,6＝33.5，p<0.05)。其中中部葉片上煙粉虱成蟲和若蟲數量均最多，分別為93.4頭和156.6頭；其次為上部葉片，分別為58.5頭和98.1頭；下部葉片分布最少，分別為27.6頭和49.7頭。煙粉虱成蟲和若蟲均主要分布在自上而下5-8片煙草煙葉背面。134個煙草品種間煙株煙粉虱成蟲和若蟲總數存在差異顯著性(f133,268＝69.1，p<0.05)。
表2煙粉虱在田間134個煙草品種煙株上垂直分布特征
由表1和表2可知，在溫室內和田間試驗中，煙粉虱在煙草上的分布均表現為垂直分布，且煙粉虱成蟲和若蟲均主要分布在自上而下5-8片煙草煙葉上，其中中部葉片上煙粉虱總數最多，其次為上部葉片，下部葉片分布最少。
實施例2溫室內不同煙草品種對煙粉虱抗性差異
按照農作物抗病蟲性鑒定分為高抗、抗、中間(抗)、感、高感5個等級的慣例，以煙草單葉感染煙粉虱若蟲和成蟲總數的平均數作為抗性評價指標，根據抗性差異，將煙草對煙粉虱的抗性分為5級，根據各煙草品種上的蟲量比，評價其對煙粉虱的抗性，蟲量比(ф)0≦ф＜0.20有30個，即為高抗品種(hr)；蟲量比(ф)0.20≦ф＜0.40有38個，即為抗品種(r)；蟲量比(ф)0.40≦ф＜0.60有15個，即為中抗品種(m)；蟲量比(ф)0.60≦ф＜1.0有12個，即為感煙粉虱品種(s)；蟲量比(ф)1.0≦ф有39個，即為高感品種(hs)。蟲量比越小，煙草品種對煙粉虱的抗性越強，對煙粉虱的趨性越弱；蟲量比越大，煙草品種對煙粉虱的抗性越弱，越易感煙粉虱。
(1)試驗材料：
供試昆蟲，煙粉虱2012年采自山東青島煙田，經mtdnacoⅰ基因序列測序方法(羅晨等，2002)鑒定為q型煙粉虱。溫室內以白花菜豆為寄主繼代飼養，每連續飼養3代進行檢查以保證純度。試驗開始時繼代種群已連續飼養12代。煙粉虱種群在(26±1)℃，rh60％～80％，14l︰10d條件下的養蟲溫室內飼養。供試煙草，供試煙草品種：同上述實施例1中的134種煙草品種。煙草育苗采用嚴格的工廠化育苗方式。把培育的煙苗移至較大的花盆，每個品種20盆，3次重復。幼苗用配方營養土(泥炭：蛭石：有機肥按6︰1︰1體積比混合)種于直徑40cm塑料盆中，在溫溫室內培養至18-22片有效葉時，備用。溫室環境條件為22～26℃，rh60％～80％，14l︰10d。
(2)試驗方法：
2013年7月。打頂后，種植的煙草處于旺長至成熟采收期時釋放煙粉虱。釋放煙粉虱前先用殺蟲劑對溫室中的害蟲防治一次，保證無其它蟲害干擾，然后將在白花菜豆上飼養的煙粉虱釋放到種植的試驗煙草品種的溫室中，輕輕拍打白花菜豆藤蔓，任其自由擴散(按煙草盆數：白花菜豆盆數＝10:1的比例釋放煙粉虱)。在釋放煙粉虱后第8天，每個品種隨機調查10株煙草自上而下5-8片葉片中隨機一片，分別記錄每個品種被調查葉片成蟲數量和若蟲數。
(3)數據統計與待測煙草品種對煙粉虱的評價：
采用microsoftexcel進行統計各個煙草品種蟲量比，根據田間調查的結果計算蟲量比值，依據蟲量比值大小及出現頻次將品種的抗蟲性分成5級：參照蟲量比(ф)0≦ф＜0.20，即為高抗品種(hr)；蟲量比(ф)0.20≦ф＜0.40，即為抗品種(r)；蟲量比(ф)0.40≦ф＜0.60，即為中抗品種(m)；蟲量比(ф)0.60≦ф＜1.0，即為感煙粉虱品種(s)；蟲量比(ф)1.0≦ф，即為高感品種(hs)。
蟲量比值按公式(1)計算：
ф＝(a+b)*n/(c+d)······················(1)
式中：
ф：待鑒定煙草品種蟲量與所有種植的煙草品種蟲量的平均值的比值；
a：待鑒定煙草品種上調查的成蟲頭數；
b：待鑒定煙草品種上調查的若蟲頭數；
c：所有待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種上調查的成蟲總頭數；
d：所有待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種上調查的若蟲總頭數；
n：所有待鑒定鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種的品種總數。
試驗結果與分析：
在溫室內，不同品種的煙草成熟期植株上，q型煙粉虱成蟲和若蟲數量均存在顯著差異(成蟲：f133,268＝91.6，p<0.05；若蟲：f133,268＝118.3，p<0.05)(表3)。
表3134個煙草品種對煙粉虱的溫室內抗性評價
由表3可知，接蟲第8天的成蟲數量最多的是“金星6007”，最少的是“云煙98”和“吉煙9號”；若蟲數量最多的是“粵煙96”和“cf226”，最少的是“云煙98”和“k346”。根據各煙草品種上的蟲量比，評價其對煙粉虱的抗性，蟲量比(ф)0≦ф＜0.20有30個，即為高抗品種(hr)。
蟲量比(ф)0.20≦ф＜0.40有38個，即為抗品種(r)。
蟲量比(ф)0.40≦ф＜0.60有15個，即為中抗品種(m)。
蟲量比(ф)0.60≦ф＜1.0有12個，即為感煙粉虱品種(s)。
蟲量比(ф)1.0≦ф有39個，即為高感品種(hs)。
初步鑒定認為云煙98、g140、吉煙9號、遼煙15、永定1號、云煙100、云煙97、k346、吉煙11號、中煙107等10個為高抗品種，胎里富1060、大黃金5210、g80、閩煙9、msg28、coker319、大黃葉煙、金星6007、粵煙96、cf226等10個品種為高感品種。
實施例3：大田中不同煙草品種對煙粉虱抗性差異
(1)試驗材料：供試煙草品種同上述實施例1和實施例2中134種煙草品種，煙草育苗采用嚴格的工廠化育苗方式。育苗溫室環境條件為22～26℃，rh60％～80％，14l︰10d。
(2)試驗方法：
2013年。田間試驗在中國農業科學院煙草研究所試驗田完成。將培育的供試煙草品種按照每個品種移栽一個小區(面積為100m2)，各設3個重復。不施用殺蟲劑，其它管理按照煙葉常規生產進行。當種植的煙草處于旺長至成熟采收期時為煙粉虱大發生時期。每個品種隨機調查10株煙草自上而下5-8片葉片中隨機一片，分別記錄每個品種被調查葉片成蟲和若蟲數。
(3)數據統計與待鑒定煙草品種對煙粉虱抗性的評價
采用microsoftexcel進行統計各個煙草品種蟲量比，參照溫室內不同煙草品種對煙粉虱的溫室內抗性評價標準評價大田煙草品種對煙粉虱的抗性。
蟲量比值按公式(1)計算：
ф＝(a+b)*n/(c+d)······················(1)
式中：
ф：待鑒定煙草品種蟲量與所有種植的煙草品種蟲量的平均值的比值；
a：待鑒定煙草品種上調查的成蟲頭數；
b：待鑒定煙草品種上調查的若蟲頭數；
c：所有待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種上調查的成蟲總頭數；
d：所有待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種上調查的若蟲總頭數；
n：所有待鑒定鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種的品種總數。
(4)結果與分析
在不同品種的煙草成熟期植株上，q型煙粉虱成蟲和若蟲數量均存在顯著差異(成蟲：f133,268＝79.1，p<0.05；若蟲：f133,268＝106.8，p<0.05)(表4)。
表4134個煙草品種對煙粉虱的田間抗性評價
由表3和表4可知，在溫室內試驗為高抗或高感的煙草品種，在田間驗證試驗中也表現為高抗或高感品種。在田間，“cf226”煙草品種接蟲第8d成蟲和若蟲數量均最多，蟲量比(ф)為5.82，表現為高感煙草品種，其在溫室內試驗中也表現出高感品種；煙粉虱數量最少的是“g140”和“云煙203”，蟲量比(ф)分別均為0.07，表現為高抗煙草品種，其在溫室內試驗中也表現出高抗品種。
根據各煙草品種上的蟲量比，評價其對煙粉虱的抗性，蟲量比(ф)0≦ф＜0.20有22個，即為高抗品種(hr)。
蟲量比(ф)0.20≦ф＜0.40有40個，即為抗品種(r)。
蟲量比(ф)0.40≦ф＜0.60有18個，即為中抗品種(m)。
蟲量比(ф)0.60≦ф＜1.0有12個，即為感煙粉虱品種(s)。
蟲量比(ф)1.0≦ф有42個，即為高感品種(hs)。
初步鑒定結果顯示，g140、云煙203、云煙98、k326、k346、遼煙15、云煙97、吉煙9號、云煙100、v2等10個品種為高抗品種；胎里富1060、大黃金5210、閩煙57、閩煙9、cf220、粵煙97、cf225、g80、粵煙96、cf226等10個品種為高感品種。
總結分析：
由實施例1可知，煙粉虱在煙草上的分布均表現為垂直分布，且煙粉虱成蟲和若蟲均主要分布在自上而下5-8片煙草煙葉上。
由實施例2和實施例3可知，134個煙草品種溫室內抗蟲性試驗和大田內抗蟲性試驗結果顯示，在溫室內試驗中煙草品種的煙粉虱抗性水平、煙粉虱對煙草品種的趨性和大田試驗中煙草品種對煙粉虱的抗性水平、煙粉虱對煙草品種的趨性是一致的，雖然平均感蟲量有差異，但其對煙粉虱的抗性水平是一致的,可通過計算蟲量比來評價煙草品種對煙粉虱的抗性等級。
本發明的鑒定過程在溫室中進行，環境條件可控，并且不受季節和時間的限制，鑒定周期短，在煙草品種對煙粉虱抗性程度評價方面更客觀，方法簡單，易于操作；本發明通過計算待鑒定煙草品種和抗性對照煙草品種的蟲量比值可以對單個或者多個煙草品種進行抗性評價，提高效率，節省試驗時間；本發明只調查打頂期煙草自上而下第5-8個葉片上的成蟲和若蟲數量，減輕了工作量和鑒定工作強度；本發明在分別在養蟲室和溫室中對煙粉虱進行育種和繁殖，保障了煙粉虱的數量和質量，鑒定結果更準確；本發明采用了統一的蟲量比，可減少不同地區間評價結果的差異。
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。