一種米老排成年優良單株的離體植株再生方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物的組織培養技術領域，特別涉及一種米老排成年優良單株的離體植株再生方法。
【背景技術】
[0002]米老排(Mytilarialaosensis Lecomte)隸屬金縷梅科(Hamamelidaceae)殼菜果屬(Mytilaria)，成年樹高可達30m，胸徑80cm。米老排天然分布于我國的廣東、廣西和云南及越南、老撾等地，在我國福建、江西等地也有人工栽培。
[0003]米老排木材為紅褐色，木質結構細，紋理直，耐干濕變化，木材加工容易，色澤好、花紋美，油漆后光亮性好，易膠粘，適于制作家具、膠合板等。其干形通直，不易受蟲蛀，耐腐蝕，可用作建筑材料；米老排木材纖維長2112.8um，與針葉材相近，是闊葉林中最長的一種；米老排具有生長快、人工林纖維材成熟期為7年、幼齡期短和制品強度高等特性，綜合品質系數優良，是纖維板和優質制漿造紙原材料。
[0004]米老排為常綠闊葉樹種，葉大肥厚，富含蛋白質、脂肪，容易腐爛，林分年總凋落量達7095.76kg/ha，形成較厚的林地內腐殖質層，具有涵養水源、改良土壤和提高土壤肥力的生態功能。同時表現出較強的防火性能，作為防火林帶種植，不僅改變一直以來防火樹種單一的現狀，還有利于提尚森林生態系統的穩定性。
[0005]米老排樹冠濃密，葉子肥大嫩綠，鮮葉的粗蛋白含量5.9%，比傳統青飼料類的秋紅薯藤蛋白質含量高3.5倍，比苦脈菜葉高2.95倍，與較高蛋白含量的玉米粉(含量為6.3%)也差不多，牛、羊、豬、兔等牲畜喜食。其萌芽力強、生物量大，每畝郁閉林可年產2500?3000kg鮮葉，是一種很有潛力的木本飼料樹種。
[0006]鑒于米老排生長速度、木材性質、生態效果、防火作用等方面的特性，目前我國多個省如云南、廣東、廣西、福建、江西等將米老排推選為當地區經濟價值較高、有發展前途的優良樹種進行推廣。
[0007]米老排人工栽培所用苗木都是采用種子苗造林，來自不同種源、家系種子的遺傳變異，導致米老排苗木及其造林后的林分個體分化大，參差不齊，進而影響到人工林的造林質量、產量及經濟效益。選擇優良母本進行組培規模化育苗，實現良種無性化推廣是米老排這一優良樹種產業化開發的重要途徑。
[0008]米老排的組織培養技術報道很少，且存在以下不足:①組培用的母本材料為3?5年生幼林中的單株，不是經過長期選擇的成年優樹。②外植體誘導培養時污染率高，無菌系建立效率低；③增殖率低(增殖倍率僅為1.6)，增殖芽伸長生長慢，芽質量差，每叢增殖芽高度達到1.0cm的芽最多為2.6株。④生根率不高(低于90% )，生根苗質量差，苗高最大的僅1.2cm，移栽及管理困難。⑤應用該技術進行組培快繁，速度慢，成本高，難以實現規模化。⑥由于幼樹與成年大樹的生理狀態不同，以幼樹為母本材料的組培方案不一定能適用于成年大樹，這在很多樹種上都存在。經驗證，利用該組織培養方案對米老排成年大樹基部萌枝進行組織培養，增殖培養的芽伸長慢、質量差、增殖倍率低，生根率低，技術不穩定。
[0009]因此，以生長速度快、干型及材性優良、抗逆性強的米老排成年優良單株為母本，以基部萌枝為外植體，通過基本培養基設計、激素種類、濃度及其配比的優化，建立其高效的離體植株再生技術，達到增殖芽健壯伸長生長快、增值率高、生根率高、生根苗健壯、移栽成活率高的目的。通過規模化育苗進行無性化推廣，將為我國米老排人工林栽培所需優質種苗的繁殖提供技術支撐，對提升米老排人工林經濟效益有著極其重大的意義。

【發明內容】

[0010]本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺點與不足，提供一種米老排成年優良單株的離體植株再生方法。該方法具有不定芽誘導快、增殖倍率高、芽粗壯伸長快、生根率高、生根苗根系發達健壯、移栽成活率、規模化生產成本低等特點。
[0011]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種米老排成年優良單株的離體植株再生方法，包括如下步驟:
[0012](I)外植體采集:選取干型通直圓滿、生長速度快、無病蟲害的優良單株為母本，剪取樹干基部萌枝，去葉后用純凈水清洗干凈，備用；
[0013](2)外植體消毒和腋芽誘導:將枝條用無菌水清洗一遍，再依次用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒，用無菌水沖洗后接種到誘導培養基，放到培養室培養，得到腋芽；
[0014](3)增殖培養:將步驟(2)的腋芽切下并轉接到增殖培養基上進行培養，得到增殖苗；
[0015](4)生根培養:從步驟(3)得到的增殖苗中切取芽轉接至生根培養基上進行培養，得到組培生根苗；
[0016](5)煉苗與移栽:將步驟(4)組培生根苗移到溫室進行煉苗移栽，得到容器苗。
[0017]步驟(I)中，所述的剪取樹干基部萌枝采用基部環割促進基部萌枝；采集外植體前，每隔1d用多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝4?5次；采集后的枝條除葉，用純凈水清洗干凈，低溫保濕備用。
[0018]步驟⑵中:
[0019]所述的誘導分化培養基為MX培養基+0.2?2.0mg/L 6-BA+0.02?0.2mg/LNAA+25 ?40g/L 鹿糖 +8g/L 卡拉膠；pH 為 5.8-6.0 ；
[0020]所述的MX 培養基含有如下成分:720mg/L NH4N03+400mg/L KN03+660mg/L Ca(NO3)2.2H20+370mg/L MgSO4.7H20+170mg/L KH2P04+65mg/L KC1 + 22.3mg/L MnSO4.4H20+8.6mg/L ZnSO4.7H20+6.2mg/L H3B03+0.83mg/L KI+0.25mg/LNa2MoO4.2H20+0.25mg/L CuSO4.5H20+0.05mg/L NiSO4.6H20+0.025mg/L CoC12+27.8mg/LFeSO4.7H20+37.3mg/L Na2.EDTA.H20+150mg/L 肌醇 +2.0mg/L 甘氨酸 +0.5mg/L 鹽酸硫胺素+0.2mg/L煙酸+0.2mg/L鹽酸吡哆醇pH 5.8、121°C滅菌15-20分鐘。
[0021]所述的用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒采用如下方法進行:用濃度70?75%酒精溶液浸泡時間為20?30s，倒掉酒精溶液后無菌水沖洗I?2次，然后加入0.05%?0.1 %升汞溶液，浸泡3?lOmin，其間不斷搖動，倒掉升汞溶液后用無菌水沖洗5?6次。
[0022]所述的培養采用如下方法進行:于25±2°C、60 μπιο?.πΓ2.s4光照la/d ;誘導培養25d，將長度> 2cm的腋芽切下轉接到增殖培養基培養；培養30d，腋芽分化形成新芽叢，將芽高3 3cm幼嫩枝條切割成1.0?1.5cm的莖段轉接入增殖培養基培養；
[0023]所述的腋芽為芽高為I?2cm的腋芽。
[0024]步驟⑶中，
[0025]所述的增殖培養基為MX培養基+0.5?1.5mg/L 6-BA+0.05?0.15mg/LNAA+25 ?40g/L 鹿糖 +8g/L 卡拉膠；pH 為 5.8-6.0 ；
[0026]所述的培養采用如下方法進行:于25±2°C、60ymol.m_2.s—1光照12h/d ;培養30d，莖段增殖形成芽叢，將芽高3 2cm的嫩莖切下，接入生根培養基。
[0027]步驟⑷中，
[0028]所述的生根培養基為MX培養基+0.1?0.5mg/L NAA+15?20g/L蔗糖+7g/L卡拉膠;pH 為 5.8-6.0 ；
[0029]所述的培養采用如下方法進行:于25±2°C、60 μπιο?.πΓ2.s—1光照12h/d ;
[0030]所述的芽為2cm芽。
[0031]步驟(5)中，
[0032]所述的組培生根苗為生根培養20d的生根瓶苗。
[0033]所述的培養采用如下方法進行:生根培養20d后，將生根瓶苗移到溫室中適應外界環境5?7d,然后將組培瓶蓋從半開到全開煉苗ld，將組培苗取出，洗凈粘于根上的培養基，移栽到泥炭土:珍珠巖=3:1混合基質上，移栽后前20d采用蓋膜保濕，然后揭開薄膜按常規幼苗管理。
[0034]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:本發明針對米老排現有組織培養技術中存在的組培無菌性建立困難、增殖培養的芽伸長慢、質量差、增殖倍率低，生根率低，技術不穩定等技術問題，根據米老排成年大樹生理狀態、離體培養的營養需求而采用MX基本培養基進行培養。其外植體的腋芽速度快；誘導率高、達100% ;增殖系數大、達4.32以上，增殖芽伸長生長快，培養30d芽高達5?6cm ;生根率可達100%，平均根數為13.4根/株；組培生根苗健壯、移栽成活率高。本發明具有不定芽誘導快、增殖倍率高、芽粗壯生長快、生根率高、生根苗根系發達健壯、移栽成活率等特點，可以用于大規模生產培養。
【附圖說明】
[0035]圖1為實施例1的優樹無菌材料的腋芽誘導結果圖；
[0036]圖2為實施例1的誘導腋芽形成的芽叢結果圖；
[0037]圖3為實施例1的增殖培養基中的增殖芽結果圖；
[0038]圖4為實施例1的增殖芽的芽高測量結果圖；
[0039]圖5為實施例1的生根培養基中的生根苗根系結果圖；
[0040]圖6為實施例1的生根苗移栽結果圖；
[0041]圖7是實施例1的移栽苗的生長圖。
【具體實施方式】
[0042]下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0043]實施例1
[0044](I)外植體采集:選取干型通直圓滿、生長速度快、無病蟲害的優良單株為母本，優樹樹齡15年以上，于3?5月份或9?10月份晴