專利名稱：經擴增gnd基因發酵制備L－氨基酸的方法
技術領域：
本發明涉及用棒狀細菌經發酵制備L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸和L-色氨酸的方法，在所述棒狀細菌中至少gnd基因是擴增的。
已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發酵而生產。由于L-氨基酸的極其重要性，已持續進行改良生產方法的嘗試。生產方法的改良可涉及發酵措施，如攪拌和供氧，或營養培養基的組分如發酵期間的糖濃度，或產物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產性質。
為改良這些微生物的生產性質，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性或重要的調節氨基酸缺陷的并產生L-氨基酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術的方法也用于改良生產L-氨基酸的谷氨酸棒桿菌菌株。
發明目的本發明目的是提供新的用棒狀細菌經發酵制備L-氨基酸的改良方法。
本發明提供了用棒狀細菌經發酵生產L-氨基酸，尤其L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸和L-色氨酸的方法，在該棒狀細菌中編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶(EC1.1.1.44)(gnd基因)的核苷酸序列是擴增的，尤其是過表達的。
使用的菌株優選在gnd基因擴增之前已生產L-氨基酸。
優選的實施方案見于權利要求書。
文中術語“擴增”是指微生物中由相應的DNA編碼的一或多種酶的胞內活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數，或使用強啟動子或編碼高活性相應酶的基因，及任選地組合使用這些方法。
本發明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉，纖維素或從甘油和乙醇中生產L-氨基酸。所述微生物可以是棒狀細菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬，在棒桿菌屬中尤其應提及的是谷氨酸棒桿菌，本領域技術人員已知其生產L-氨基酸的能力。
以下已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032醋谷棒桿菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870嗜熱產氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC 14067乳發酵短桿菌ATCC 13869擴展短桿菌ATCC 14020和從中獲得的生產L-氨基酸的突變體，如生產L-蘇氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21649黃色短桿菌BB69黃色短桿菌DSM5399乳發酵短桿菌FERM-BP 269
乳發酵短桿菌TBB-10以及，如生產L-異亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC14309谷氨酸棒桿菌ATCC14310谷氨酸棒桿菌ATCC14311谷氨酸棒桿菌ATCC15168產氨棒桿菌ATCC6871以及，如生產L-色氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21850谷氨酸棒桿菌KY9218(pKW9901)以及，如生產L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳發酵短桿菌FERM-P 1712谷氨酸棒桿菌FERM-P 6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464谷氨酸棒桿菌DSM5715谷氨酸棒桿菌DSM58-1谷氨酸棒桿菌DSM12866是棒桿菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌合適菌株的實例。
已發現在編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶(EC1.1.1.44)的gnd基因過表達之后，棒桿菌以改良方式生產L-氨基酸，尤其L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸和L-色氨酸。
編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因，其催化6-磷酸葡糖酸氧化脫羧為5-磷酸核酮糖。gnd基因的核苷酸序列揭示于JP-A-9-224662。本發明首次應用了在提及的參考文獻中闡述的gnd基因。得自遺傳密碼簡并或由于中性功能的有義突變導致的gnd基因的等位基因也可使用。
為獲得擴增(如過表達)，例如可提高相應基因的拷貝數，或可使位于結構基因上游的啟動子和調節區或核糖體結合位點突變。摻入結構基因上游的表達盒以同樣方式工作。通過可誘導啟動子，在L-氨基酸發酵生產期間增加表達也是可能的。延長mRNA壽命的措施也可改善表達。另外，通過防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因構建體可以不同拷貝數存在于質粒中，或可在染色體中整合與擴增。或者，通過改變培養基的組分和培養條件，也可獲得相關基因的過表達。
本領域熟練技術人員從以下文獻中可發現對此的詳述，參見Martin等(生物/技術5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術6,428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS0472869，美國專利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技術9，84-87(1991))，Reischeid等(應用及環境微生物學60，126-132(1994))，LaBarre等(細菌學雜志175，1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術及生物工程58,191-195(1998))，及已知關于遺傳及分子生物學的教材。
例如，6-磷酸葡糖酸脫氫酶借助于質粒被過表達。為此使用


圖1所示的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。在將gnd基因摻入pEC-T18mob2的EcoRI切割位點之后，形成圖2所示的質粒pECgnd。
能在谷氨酸棒桿菌中復制的其它質粒載體如pEKExl(Eikmarms等，基因10293-98(1991))，或pZ8-1(EP-B-0375889)也可以同樣方式使用。
另外，除編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因之外，特定生物合成途徑，糖酵解，添補反應，戊糖磷酸途徑或氨基酸輸出的一或多種酶的過表達，對L-氨基酸的生產可以是有益的。
因此，例如選自以下一組的一或多個基因可被同時擴增尤其是過表達以生產L-蘇氨酸·編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因(Peoples等，分子微生物學2，63-72(1988))，或編碼“反饋抗性”高絲氨酸脫氫酶的homdr等位基因(Archer等，基因107，53-59(1991))，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物學144915-927(1998))，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，歐洲生物化學雜志254，395-403)·編碼轉酮酶的tkt基因(歐洲分子生物學實驗室(EMBL，Heidelberg，德國)的數據庫，登記號AB023377)·編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因(JP-A-09224661)·編碼蘇氨酸輸出的thrE基因(DE 199 41 478.5；DSM12840)·zwa1基因(DE 199 59 328.0；DSM13115)·編碼烯醇酶的eno基因(DE19941478.5)。
因此，例如選自以下一組的一或多個基因可被同時擴增尤其是過表達以生產L-賴氨酸·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，·編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遺傳學224317-324)，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikamanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikamanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，歐洲生物化學雜志254，395-403)，·編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因(JP-A-09224661)，·編碼轉酮酶的tkt基因(歐洲分子生物學實驗室(EMBL，Heidelberg，德國)的數據庫，登記號AB023377)，·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，·zwa1基因(DE 199 59 328.0，DSM13115)，·編碼烯醇酶的eno基因(DE19941478.5)。
除擴增gnd基因之外，同時弱化選自以下一組的一或多個基因對L-氨基酸的生產也可以是有益的·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，·編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)，·zwa 2基因(DE19959327.2，DSM13113)。
除過表達6-磷酸葡糖酸脫氫酶之外，消除非所需的副反應對L-氨基酸的生產也是有益的(Nakayama“生產氨基酸的微生物的育種”，微生物產物的過量產生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學術出版社，倫敦英國，1982)。
根據本發明產生的微生物可連續培養或非連續地通過分批法，補料分批法或重復補料發批法培養，以生產L-氨基酸。已知培養法見于由Chmiel(生物方法技術學1，生物工程入門，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反應器及外周設備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培養基必須以適當方式符合特定菌株的需求。關于各種微生物培養基的闡述見于美國細菌學會的“細菌學通用方法手冊”(華盛頓D.C..USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸。這些物質可單獨或混合使用?？墒褂玫牡窗ê挠袡C化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應鈉鹽。培養基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質之外，可使用生長必需物質如氨基酸和維生素。此外，可將適當前體加入培養基中，上述物質可以單批形式或在培養期間適當補加。
可以適當方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調節培養物的PH值。抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫產生。適當的選擇性作用物質例如抗生素，可加入培養基中以保持質粒的穩定性，氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養物中以保持有氧條件。培養溫度通常在20℃～45℃，優選25℃-40℃。持續培養直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍內達到。
L-氨基酸的分析可通過陰離子交換層析，隨后經過如Spackman等(分析化學30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用進行，或通過如Lindroth等(分析化學(1979)511167-1174)所述反向HPLC進行。
以下微生物根據布達佩斯條約，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)大腸桿菌K-12 DH5α/pEC-T18mob2，保藏號DSM13244。
本發明包括以下附圖
圖1質粒pEC-T18mob2圖。
圖2質粒pECgnd圖。
圖3質粒pBGNA圖。
圖4質粒pCR2.1poxBint圖。
堿基對數目是根據再現性獲得的大約值。
圖中所采用的縮寫有如下含義
圖1Tet四環素抗性基因oriV大腸桿菌的質粒編碼的復制源點RP4mob轉移質粒的mob區域rep來自谷氨酸棒桿菌質粒pGA1的質粒編碼的復制源點perpGA1的控制拷貝數的基因lacZ-alphaβ-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)圖2Tet四環素抗性基因rep來自谷氨酸棒桿菌質粒pGA1的質粒編碼的復制源點perpGA1的控制拷貝數的基因lacZ來自pEC-T18mob2的lacZα基因片段的克隆殘存片段gnd6-磷酸葡糖酸脫氫酶基因圖3lacP大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子CMV巨細胞病毒的啟動子ColE1質粒ColE1的復制源點TkpolyA聚腺苷酸化位點Kan r卡那霉素抗性基因SV40ori猴病毒40的復制源點gnd6-磷酸葡糖酸脫氫酶基因圖4ColE1 ori質粒ColE1的復制源點lacZlacZα基因片段的克隆殘存片段fl ori噬菌體fl的復制源點KmR卡那霉素抗性
ApR氨芐青霉素抗性poxBintpoxB基因的內部片段另外，使用以下縮寫AccI限制酶AccI的酶切位點BamHI限制酶BamHI的酶切位點EcoRI限制酶EcoRI的酶切位點HindIII限制酶HindIII的酶切位點KpnI限制酶KpnI的酶切位點PstI限制酶PstI的酶切位點PvuI限制酶PvuI的酶切位點SalI限制酶SalI的酶切位點SacI限制酶SacI的酶切位點SmaI限制酶SmaI的酶切位點SphI限制酶SphI的酶切位點XbaI限制酶XabI的酶切位點XhoI限制酶XhoI的酶切位點估計所得PCR產物的大小大約為252bp。
最佳PCR條件確定如下35次循環94℃ 1分鐘55℃ 1分鐘72℃ 30秒2.5-3.5mM MgCl2100-150ng AS019基因組DNA對所得PCR產物進行測序分析證實此產物是gnd基因的內部部分。用通用的正向和反向引物，和Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，UK)的T7測序試劑盒測序。PCR產物的序列示于SEQ ID NO1。2.克隆根據ёZap ExpressTM系統方案篩選AS019ёZap ExpressTM文庫(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd.，La Jolla，Califomia 92037)。然后對分離的克隆進行Southem印跡分析。如Schleicher和Schuell方法手冊所述，將NytranTM(“Nytran，修飾的尼龍-66濾膜”(1987年3月)，Schleicher和Schuell，Dassbl，德國)作為膜進行DNA的Southern轉移。將使用上述相同引物和最佳PCR條件產生的雙鏈DNA片段，用Amersham生命科學公司的MultiprimeTMDNA標記試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech UK Limited，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)，根據說明書用α-32p-dCTP放射標記。預雜交，雜交和沖洗條件如Schleicher和Schuell方法手冊所述。根據Sambrook等所述方法，用AgFa Curix RPIL膠片進行放射自顯影。由此鑒別一些gnd克隆。從稱為pBGNA(圖3)的一個克隆分離質粒DNA，并選擇其進行進一步分析。3.測序通過Sanger等的Sanger雙脫氧鏈終止法(美國科學院院報74，5463-5467(1977))，對pBGNA中克隆的插入體進行測序。用PharmaciaBiotech公司的T7測序試劑盒和α-32P-dCTP(St.Albans，Herts，UK)進行此方法。根據Pharmacia克隆和測序指導手冊(“T7SequencingTM試劑盒”，ref.XY-010-00-19，Pharmacia Biotech，1994)，將樣品在TBE緩沖液中于6％聚丙烯酰胺/尿素凝膠上，以恒定的50mA進行電泳3-8小時。用自內部gnd PCR產物的已知序列(SEQ ID NO1)設計的內部引物測序，以推導全部gnd基因序列。
內部引物的序列如下內部引物15’GGT GGA TGC TGA AAC CG 3’內部引物25’GCT GCA TGC CTG CTG CG 3’內部引物35’TTG TTG CTT ACG CAC AG 3’內部引物45’TCG TAG GAC TTT GCT GG 3’所得的序列在蘋果麥金托什機計算上用DNA Strider程序1.0版(Marck，(1998).核酸研究161829-1836)進行分析。這一程序可以進行限制性位點使用、開放讀框分析和密碼子使用分析。使用BLAST程序(Altschul等，(1997)核酸研究，253389-3402)在所得DNA序列和EMBL和Genbank中的序列之間進行查詢。DNA和蛋白質序列比較使用Clustal V和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1998基因73237-244)。
所得的序列如SEQ ID NO2所示。核苷酸序列分析揭示一1377個堿基對的開放讀框，命名為gnd基因，其編碼一個459個氨基酸的蛋白質，如SEQ ID NO3所示。實施例3穿梭載體pEC-T18mob2的制備根據現有技術構建大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。
此載體含有質粒pGA1的包括復制效應子per的復制區rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，細菌學雜志179，1525-1532(1997))，質粒pAG1的四環素抗性基因tetA(Z)(USA-5158891；國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的基因文庫，登記號AF121000)，質粒pMB1(Sutcliffe，關于定量生物學的冷泉港討論會43，77-90(1979))的復制起點oriV，包括lac啟動子及多克隆位點(mcs)(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))的lacZα基因片段，和質粒RP4(Simon等，(1983)生物/技術1784-791)的mob區域。
將此構建的載體轉化入大腸桿菌菌株DH5α中(Hanahan，DNA克隆實用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，華盛頓，美國)。通過將轉化混合物鋪板于補加5mg/l四環素的LB平板(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.)上，選擇攜帶質粒的細胞。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制備試劑盒從轉化體中分離質粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII限制，及隨后經瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)檢測。
此質粒稱為pEC-T18mob2并示于
圖1。其以大腸桿菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，德國)，保藏號DSM 13244。實施例4大腸桿菌-谷氨酸穿梭載體pEC-T18mob2中gnd基因的克隆用pBGNA作模板，經PCR擴增含有谷氨酸棒桿菌的全長gnd基因和兩側上游和下游區域的DNA片段。用設計自SEQ ID NO2的寡核苷酸引物進行PCR反應。所用引物是gnd正向引物5’ACT CTA GTC GGC CTA AAA TGG 3’gnd反向引物5’CAC ACA GGA AAC AGA TAT GAC 3’PCR參數如下35次循環 95℃ 6分鐘94℃ 1分鐘50℃ 1分鐘72℃ 45秒1mM MgCl2大約150-200ng pBGNA-DNA作模板。
將所得PCR產物克隆入購自Promega公司的pGEM-T載體(pGEM-T Easy Vector System 1，目錄號A1360，Promega UK，Southampton)中，用大腸桿菌菌株JM109(Yanisch-Perron等，基因33103-119(1985))作宿主。全長gnd基因隨后分離自pGEM-T載體的EcoRI片段，并克隆入大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2的lacZ EcoRI位點(
圖1)，并稱之為pECgnd(圖2)。用AccI(Boehringer Mannheim GmbH，德國)進行的限制酶分析顯示pEC-T18mob2的lacZα基因中gnd基因的正確方向(即在lac啟動子下游)。實施例5制備具有擴增的6-磷酸葡糖酸脫氫酶的氨基酸生產菌株通過Tauch等的電穿孔方法(FEMS微生物學通信，123343-347(1994))，將實施例3的質粒pECgnd電穿孔入谷氨酸棒桿菌菌株DSM5399和DSM5714中。DSM5399菌株是生產蘇氨酸的菌株，見于EP-B-0358940所述。DSM5714菌株是生產賴氨酸的菌株，見于EP-B-0435132所述。將電穿孔混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上選擇轉化體，所用LB瓊脂已補加25mg/l卡那霉素。以此方式形成菌株DSM5399/pECgnd和DSM5714/pECgnd。
首先，在33℃在具有適當抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環素的腦心瓊脂)上培養菌株24小時。此瓊脂板培養物用于接種預培養物(10ml培養基于100ml錐形瓶)。用于預培養的培養基是腦心浸液(Merck，Darmstadt，德國)。向此培養基中加入四環素(5mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養預培養物24小時。此預培養物接種主培養物，從而主培養物的起始OD(波長660nm)為0.1。培養基MM-蘇氨酸用作主培養物。
培養基MM-蘇氨酸CSL5g/lMOPS 20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/l
MgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lCaCO325g/l用氨水將CSL(玉米漿)，MOPS(嗎啉代丙磺酸)和鹽溶液調至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養。加入四環素(5mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養。
48小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定蘇氨酸生成量。
實驗結果示于表1。
表1
實施例7制備賴氨酸將實施例5中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5714/pECgnd，在適于生產賴氨酸的營養培養基中培養，并確定培養物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃在具有適當抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環素的腦心瓊脂)上培養菌株24小時。此瓊脂板培養物用于接種預培養物(10ml培養基于100ml錐形瓶)。用于預培養的培養基是完全培養基CgIII。
培養基CgIIINaCl2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 2％(w/v)pH調節為7.4。
加入四環素(5mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養預培養物24小時。此預培養物接種主培養物，從而主培養物的起始OD(波長660nm)為0.05。培養基MM用作主培養物。
培養基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌)0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養。加入四環素(5mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養。
48小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實驗結果示于表2。
實施例8制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘粒文庫如Tauch等(1995，質粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德國，產品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。將得自Stratagene公司(La Jolla，USA，產品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl等，(1987)美國科學院院報842160-2164)的DNA，用限制性內切酶XbaI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德國，產品描述XbaI編碼27-0948-02)酶切，并也用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的內切酶BamHI(AmershamPharmacia，Freiburg，德國，產品描述BamHI，編碼27-0868-04)酶切。將以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德國，產品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用Gigapack II XL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，USA，產品描述Gigapack II XL包裝提取物，編碼200217)包裝進噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細菌置于10mM MgSO4中并與噬菌體懸浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒文庫的感染和滴定，細胞在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox.1955，病毒學，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。實施例9poxB基因的分離與測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產品號27106，Qiagen，Hilden，德國)根據廠商指導分離單個菌落的粘粒DNA(實施例8)，并用限制性內切酶Sau 3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德國，產品描述Sau3AJ，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酶酶(Roche分子生物化學，德國曼海姆，產品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。經凝膠電泳分離后，用QiaExII凝膠提取試劑盒(產品號20021，Qiagen，Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。將得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產品描述Zero背景克隆試劑盒，產品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA，用限制性內切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德國，產品描述BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德國，產品描述BamHI，產品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，將DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biobech，Freiburg，德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物學通信，123343-7)進大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國科學院院報874645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學，1190)上鋪板。重組克隆的質粒制備用Biorobot 9600(產品號900200，Qiagen，Hilden，德國)進行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國科學院院報745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進行。使用得自PE應用生物系統公司的“RR羅丹明終止循環測序試劑盒”(產品號403044，Weiterstadt，德國)，在帶有購自PE應用生物系統公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism377”測序儀的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/雙丙烯酰胺”凝膠(291)(產品號A124.1，Roth，Karlsruhe，德國)中，進行凝膠電泳分離和序列分析。
所得原始序列數據資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個序列組裝成連續重疊群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進行計算機輔助編碼區分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對“國家生物技術信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數據庫進行進-步分析。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，對該核苷酸序列的分析顯示一1737堿基對的開放讀框，其被稱為poxB基因，poxB基因編碼579個氨基酸的多肽(SEQ ID NO5)。實施例10制備整合載體以整合誘變poxB基因從菌株ATCC13032中，通過Eikmanns等所述方法(微生物學1401817-1828(1994))分離染色體DNA?；趶膶嵤├?中已知的谷氨酸棒桿菌的poxB基因序列，選擇以下寡核苷酸進行聚合酶鏈反應poxBint15’TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3’poxBint25’GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3’所示引物是通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成的，通過Innis等的標準PCR方法(PCR方案，方法指導和應用，1990，Academic出版社)，用Boehringer的Pwo-聚合酶進行PCR反應。借助于聚合酶鏈反應，分離大約0.9kb的DNA片段，其攜帶poxB基因的內部片段，并如SEQ ID NO6所示。
將擴增的DNA片段用Invitrogen公司的TOPO TA克隆試劑盒(Carlsbad，CA，美國；Catalogue Number K4500-01)，連接在載體pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)，生物/技術9657-663)中。然后將連接混合物電穿孔入大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆實用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，華盛頓DC，美國，1985)。將轉化混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇攜帶質粒的細胞，所用LB瓊脂已補加25mg/ml卡那霉素。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制備試劑盒從轉化體中分離質粒DNA，并通過限制酶EcoRI限制及隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)檢測。此質粒稱為pCR2.1poxBint(圖4)。
質粒pCR2.1poxBint以大腸桿菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式，根據布達佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心，DSMZ；Braunschweig，德國)，保藏號DSM13114。實施例11在賴氨酸生產菌DSM5715中整合誘變poxB基因將實施例10中所述的載體pCR2.1poxBint，通過Tauch等的電穿孔方法(FEMS微生物學通信，123343-347(1994))，電穿孔入谷氨酸棒桿菌DSM5715中。菌株DSM5715是一種AEC抗性賴氨酸生產菌。載體pCR2.1poxBint在DSM5715中不能獨立復制，并只有已整合入DSM5715的染色體中時，才在細胞中保留。通過將電穿孔混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇具有整合入染色體的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB瓊脂已補加15mg/l卡那霉素。為檢測整合情況，將poxBint片段用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒，通過Boehringer Mannheim GmbH的“進行濾膜雜交的DIG系統使用指導”(Mannheim，德國，1993)進行標記。潛在整合子的染色體DNA是通過Eikmanns等的方法(微生物學1401817-1828(1994))分離的，并分別用限制酶SalI，SacI和HindIII酶切。形成的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，并在68℃用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒雜交。實施例9中所述的質粒pCR2.1poxBint已插入DSM5715的染色體中的染色體poxB基因內。此菌株稱為DSM5715∷pCR2.1poxBint。實施例12過表達gnd基因同時消除poxB基因對賴氨酸制備的作用12.1制備菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd通過Libel等所述電穿孔方法(FEMS微生物學通信，53299-303(1989))，將菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用質粒pECgnd轉化。在含有18.5g/l腦心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/lBacto-胰化蛋白胨，2.5g/lBacto-酵母膏，5g/lNaCl，和18g/lBacto-瓊脂，并補加5mg/l四環素和25mg/l卡那霉素的LBHIS瓊脂上，選擇轉化體。在33℃溫育2天。
通過常規方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物學144，915-927)從轉化體中分離質粒DNA，用限制性內切酶AccI酶切，并通過隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢測此質粒。以此方式獲得的菌株稱為DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd。12.2制備L-賴氨酸將實施例12.1中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd，在適于生產賴氨酸的營養培養基中培養，并確定培養物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃在具有適當抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環素和25mg/l的腦心瓊脂)上培養菌株24小時。此瓊脂板培養物用于接種預培養物(10ml培養基于100ml錐形瓶)。用于預培養的培養基是完全培養基CgIII。
培養基CgIIINaCl 2.5g/l
Bacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 2％(w/v)pH調節為7.4。
加入四環素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養預培養物16小時。此預培養物接種主培養物，從而主培養物的起始OD(波長660nm)為0.1。培養基MM用作主培養物。
培養基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 58g/lNH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌)0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養。加入四環素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養。
72小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實驗結果示于表3。
表3
序列表<110>國立愛爾蘭大學戈爾韋分校德古薩-于爾斯股份公司<120>用棒狀細菌發酵制備L-氨基酸的方法<130>990229 BT<140><141><160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>252<212>DNA<2l3>谷氨酸棒桿菌<400>1atggtccaca acggcatcga gtacgccgac atgcaggtca tcggcgaggc ataccacctt 60ctgccctacg cagcaggcat gcagccagct gaaatcgctg aggttttcaa ggaatggaac 120gcaggcgacc tggattccta cctcatcgaa atcaccgcag aggttctctc ccaggtggat 180gctgaaaccg gcaagccact aatcgacgtc atcgttgacg ctgcaggtca gaagggcacc 240ggcaagtgga ct 252<210>2<211>2335<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>CDS<222>(474)..(1850)<223>gnd<400>2ttgttcggcc acgatgacac cggagctcac agcagaaatg aagtcggtgt tgttgttgat 60gccgacgacc atttttccag gggcggaaat catgctggcg actgatccag tggattcggc 120gatggcggcg tagacaccac cgttgaccaa gcccaccact tgcaggtgct tggatgccac 180gtgaagttcg ctgaccaccc ggccgggctc gatggtggtg tagcgcagcc ccagattgcg 240gtcgaggcca taattggcgt tgttgagtgc ttcaagttcg tctgtggtta aagctctggt 300ggcggcaagt tctgcaagcg aaagcagatc ttggggttga tcatcgcggg aagtcataat 360taattactct agtcggccta aaatggttgg attttcacct cctgtgacct ggtaaaatcg 420ccactacccc caaatggtca caccttttag gccgattttg ctgacaccgg gct atg476Met1ccg tca agt acg atc aat aac atg act aat gga gat aat ctc gca cag 524Pro Ser Ser Thr Ile Asn Asn Met Thr Asn Gly Asp Asn Leu Ala Gln5 10 15atc ggc gtt gta ggc cta gca gta atg ggc tca aac ctc gcc cgc aac 572Ile Gly Val Val Gly Leu Ala Val Met Gly Ser Asn Leu Ala Arg Asn20 25 30ttc gcc cgc aac ggc aac act gtc gct gtc tac aac cgc agc act gac 620Phe Ala Arg Asn Gly Asn Thr Val Ala Val Tyr Asn Arg Ser Thr Asp35 40 45aaa acc gac aag ctc atc gcc gat cac ggc tcc gaa ggc aac ttc atc 668Lys Thr Asp Lys Leu Ile Ala Asp His Gly Ser Glu Gly Asn Phe Ile50 55 60 65cct tct gca acc gtc gaa gag ttc gta gca tcc ctg gaa aag cca cgc 716Pro Ser Ala Thr Val Glu Glu Phe Val Ala Ser Leu Glu Lys Pro Arg70 75 80cgc gcc atc atc atg gtt cag gct ggt aac gcc acc gac gca gtc atc 764Arg Ala Ile Ile Met Val Gln Ala Gly Asn Ala Thr Asp Ala Val Ile85 90 95aac cag ctg gca gat gcc atg gac gaa ggc gac atc atc atc gac ggc 812Asn Gln Leu Ala Asp Ala Met Asp Glu Gly Asp Ile Ile Ile Asp Gly100105 110ggc aac gcc ctc tac acc gac acc att cgt cgc gag aag gaa atc tcc 860Gly Asn Ala Leu Tyr Thr Asp Thr Ile Arg Arg Glu Lys Glu Ile Ser115 120 125gca cgc ggt ctc cac ttc gtc ggt gct ggt atc tcc ggc ggc gaa gaa 908Ala Arg Gly Leu His Phe Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Gly Glu Glu130 135 140 145ggc gca ctc aac ggc cca tcc atc atg cct ggt ggc cca gca aag tcc 956Gly Ala Leu Asn Gly Pro Ser Ile Met Pro Gly Gly Pro Ala Lys Ser150 155 160tac gag tcc ctc gga cca ctg ctt gag tcc atc gct gcc aac gtt gac 1004Tyr Glu Ser Leu Gly Pro Leu Leu Glu Ser Ile Ala Ala Asn Val Asp165 170 175ggc acc cca tgt gtc acc cac atc ggc cca gac ggc gcc ggc cac ttc 1052Gly Thr Pro Cys Val Thr His Ile Gly Pro Asp Gly Ala Gly His Phe180 185 190gtc aag atg gtc cac aac ggc atc gag tac gcc gac atg cag gtc atc 1100Val Lys Met Val His Asn Gly Ile Glu Tyr Ala Asp Met Gln Val Ile195 200 205ggc gag gca tac cac ctt ctg ccc tac gca gca ggc atg cag cca gct 1148Gly Glu Ala Tyr His Leu Leu Pro Tyr Ala Ala Gly Met Gln Pro Ala210 215 220 225gaa atc gct gag gtt ttc aag gaa tgg aac gca ggc gac ctg gat tcc 1196Glu Ile Ala Glu Val Phe Lys Glu Trp Asn Ala Gly Asp Leu Asp Ser230 235 240tac ctc atc gaa atc acc gca gag gtt ctc tcc cag gtg gat gct gaa 1244Tyr Leu Ile Glu Ile Thr Ala Glu Val Leu Ser Gln Val Asp Ala Glu245 250 255acc ggc aag cca cta atc gac gtc atc gtt gac gct gca ggt cag aag 1292Thr Gly Lys Pro Leu Ile Asp Val Ile Val Asp Ala Ala Gly Gln Lys260 265 270ggc acc ggc aag tgg act gtc aag gct gct ctt gat ctg ggt att gct 1340Gly Thr Gly Lys Trp Thr Val Lys Ala Ala Leu Asp Leu Gly Ile Ala275 280 285acc acc ggc atc ggc gaa cgt gtt ttc gca cgt gca ctc tcc ggc gca 1388Thr Thr Gly Ile Gly Glu Arg Val Phe Ala Arg Ala Leu Ser Gly Ala290 295 300 305acc agc cag cgc gct gca gca cag ggc aac cta cct gca ggt gtc ctc 1436Thr Ser Gln Arg Ala Ala Ala Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val Leu310 315 320acc gat ctg gaa gca ctt ggc gtg gac aag gca cag ttc gtc gaa gga 1484Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Lys Ala Gln Phe Val Glu Gly325 330 335ctt cgc cgt gca ctg tac gca tcc aag ctt gtt gct tac gca cag ggc 1532Leu Arg Arg Ala Leu Tyr Ala Ser Lys Leu Val Ala Tyr Ala Gln Gly340 345 350ttc gac gag atc aag gct ggc tcc gac gag aac aac tgg gac gtt gac 1580Phe Asp Glu Ile Lys Ala Gly Sar Asp Glu Asn Asn Trp Asp Val Asp355 360 365cct cgc gac ctc gct acc atc tgg cgc ggc ggc tgc atc att cgc gct 1628Pro Arg Asp Leu Ala Thr Ile Trp Arg Gly Gly Cys Ile Ile Arg Ala370 375 380 385aag ttc ctc aac cgc atc gtc gaa gca tac gat gca aac gct gaa ctt 1676Lys Phe Leu Asn Arg Ile Val Glu Ala Tyr Asp Ala Asn Ala Glu Leu390 395 400gag tcc ctg ctg ctc gat cct tac ttc aag agc gag ctc ggc gac ctc 1724Glu Ser Leu Leu Leu Asp Pro Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Gly Asp Leu405 410 415atc gat tca tgg cgt cgc gtg att gtc acc gcc acc cag ctt ggc ctg 1772Ile Asp Ser Trp Arg Arg Val Ile Val Thr Ala Thr Gln Leu Gly Leu420 425 430cca atc cca gtg ttc gct tcc tcc ctg tcc tac tac gac agc ctg cgt 1820Pro Ile Pro Val Phe Ala Ser Ser 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1.一種通過發酵棒狀細菌制備L-氨基酸的方法，包括進行以下步驟a)發酵產生所需L-氨基酸的細菌，該細菌中至少gnd基因是擴增的，b)濃縮培養基或細菌細胞中的L-氨基酸，及c)分離產生的L-氨基酸。
2.權利要求1的方法，其中使用的細菌中，所需L-氨基酸的生物合成途徑的其它基因也被擴增，尤其是過表達。
3.權利要求1的方法，其中使用制備L-蘇氨酸，L-賴氨酸，L-異亮氨酸或L-色氨酸的棒狀細菌。
4.權利要求3的方法，其中使用制備L-賴氨酸的的棒狀細菌。
5.如權利要求2發酵制備L-賴氨酸的方法，其中在尤其已經產生L-賴氨酸的棒狀微生物中，選自以下一組的一或多個基因被同時擴增、特別是過表達5.1編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，5.2編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，5.3編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，5.4編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，5.5編碼轉酮酶的tkt基因，5.6編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因，5.7編碼賴氨酸輸出的lysE基因，5.8zwal基因，5.9編碼烯醇化酶的eno基因。
6.如權利要求2發酵制備L-蘇氨酸的方法，其中在尤其已經產生L-蘇氨酸的棒狀微生物中，選自以下一組的一或多個基因被同時擴增、尤其是過表達6.1編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因或編碼“反饋抗性”高絲氨酸脫氫酶的homdr等位基因，6.2編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，6.3編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，6.4編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，6.5編碼轉酮酶的tkt基因6.6編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因，6.7編碼蘇氨酸輸出的thrE基因，6.8zwal基因，6.9編碼烯醇化酶的eno基因。
7.權利要求2的方法，其中為制備L-氨基酸尤其L-賴氨酸或L-蘇氨酸，發酵這樣的細菌，該細菌中選自以下一組的一或多個基因被同時弱化7.1編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，7.2編碼葡糖-6-磷酸異構酶的pgi基因，7.3編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，7.4zwa2基因。
8.權利要求2-6任一項的方法，其中為實現擴增，所述基因或核苷酸序列的拷貝數，通過用攜帶這些基因或核苷酸序列的質粒載體轉化微生物而提高。
9.
圖1所示的質粒載體pEC-T18mob2，其以在大腸桿菌K-12DH5α中的形式保藏，保藏號DSM 13244。
10.一種通過導入權利要求9的質粒載體而轉化的棒狀微生物，尤其棒桿菌屬，所述載體另外還含有gnd基因。
全文摘要
本發明涉及一種通過發酵棒狀細菌制備L－氨基酸的方法,包括進行以下步驟:a)發酵產生所需L－氨基酸的細菌,該細菌中至少gnd基因是擴增的,b)濃縮培養基或細菌細胞中的L－氨基酸,及c)分離產生的L－氨基酸。
文檔編號C12P13/08GK1350586SQ00807548
公開日2002年5月22日 申請日期2000年7月5日 優先權日2000年3月20日
發明者L·K·杜尼肯(死亡), 阿什令·麥科麥克, 克里奧娜·斯特普爾頓, 凱文·伯克, 貝蒂娜·默克爾 申請人:德古薩股份公司, 國立愛爾蘭大學