專利名稱：一種凝乳酶基因及其編碼的氨基酸序列與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種由枯草芽孢桿菌誘變株分泌的凝乳酶的基因序列及其蛋白序列與應用。
背景技術：
在食品加工領域，尤其是奶酪加工領域，凝固酶是必不可少的添加劑。凝乳酶不僅可以使牛奶凝固，而且在奶酪成熟中具有不可忽視的作用(Kumar et al.，2005)。小牛皺胃凝乳酶首次被發現是一個偶然的機會，人們用動物的皮保存牛奶時，牛奶有時會出現凝固，之后小牛皺胃凝乳酶就被廣泛應用在奶酪加工領域。自從1961起，由于世界乳酪業的高速發展，使得小牛凝乳酶供應持續短缺，科學家不斷尋找能夠替代小牛皺胃凝乳酶的蛋白酶。之后，人們發現了一些蛋白酶具有類似的凝乳效果。這些凝乳酶廣泛分布在不同的生物和組織內(Chitpinityol and Crabbe, 1998)。因此，由于各類蛋白酶具有不同的理化性質、水解活性和凝乳活性，所以其用途就各不相同。人們通過向不同來源的奶液(奶牛，牦牛，山羊以及駱駝)中添加凝乳酶，并采用不同的加工手段，最終獲得口味各異的奶酪。青藏高原(Qingha1-Tibet Plateau)是世界海拔最高的高原,氣候環境惡劣，因此其擁有許多獨特的生物質資源。牦牛，就是其中最典型的一種(Zi，2003)。牦牛常年以豐富的、無污染的草料為食，因此可以為當地居民提供大量的潔凈的食物(牦牛乳，肉，酥油)。藏民們通常會將牦牛乳加工成各種乳制品，牦牛奶酪就是其中最主要且最常見的一種。牦牛乳在總蛋白含量，脂肪含量，酪蛋白組成方面與牛奶具有明顯的差異(Brunner，1981 ；Liet al.，2010)，尤其特別的是牦牛乳中含有大量的β-casein，使傳統凝乳酶的凝乳速度大大降低；其次，在牦牛乳奶液的PH通常在6.0-8.0之間，而傳統的動物源和真菌源的凝乳酶在pH < 5.0情況下具有最大活性，那么在中性環境下具有高凝乳活性的凝乳酶非常適合牦牛乳奶酪的生產；第三 ，高溫處理是牦牛乳制作奶酪之前的必要步驟，如果高溫處理后立即添加凝乳酶，那么就縮短了前處理時間，在奶酪制備過程中，高溫環境不僅可以提高酶的反應效率，而且會減少酶的用量，節約成本。然而，傳統的凝乳酶通常只能在50°C以下的環境中保持活性的穩定(Ageitos et al., 2007 ；Kumar et al., 2005 ；Nouani et al., 2009),而在高溫環境下會迅速失活，無法滿足牦牛奶酪加工的需要。綜上所述，傳統的凝乳酶不再適用于牦牛乳奶酪的生產過程。因此，亟須開發出一種具有熱穩定性的、高效凝結牦牛乳的凝乳酶。迄今為止，沒有文獻或專利報道過具備牦牛乳特異性、熱穩定性、并在PH6.0-8.0保持高活性的微生物源凝乳酶，更沒有明確這類蛋白質或其編碼蛋白質的基因序列。
Ageitos, J.M.，Vallejo, J.A.，Sestelo, A.B.，Poza, Μ.，and Villa, T.G.(2007).Purification and characterization of a milk-clotting protease from Bacilluslicheniformis strain USC13.J Appl Microbiol 103,2205-2213.Brunner, J.(1981).Cow milk proteins:twenty-five years of progress.J DairySci 64,1038.Chitpinityol,S.,and Crabbe,M.(1998).Chymosin and aspartic proteinases.FoodChem 61,395-418.Kumar, S., Sharma, N., Saharan, M., and Singh, R.(2005).Extracellular acidprotease from Rhizopus oryzae -purification and characterization.ProcessBiochem40,1701-1705.Li, H.M.,Ma, Y., Dong, A., Wang, J., Li, Q., He, S., and Maubois, J.-L.(2010).Proteincomposition of yak milk.Dairy Sci Technol 90,111-117.Nouani, A., Belhamiche, N., Slamani, R., Belbraouet, S., Fazouane, F., andBelial, M.(2009).Extracellular protease from Mucor pusillus:purification andcharacterization.1nt J Dairy Technol 62,112-117.Zi, X.(2003).Reproduction in female yaks (Bos grunniens)and opportunitiesfor improvement.Theriogenology 59,1303-1312.

發明內容
本發明的目的是提供一種凝乳酶基因。本發明的另一個目的是提供一種本發明的基因編碼的蛋白質。本發明的所述的凝乳酶，是指來自可高產凝乳酶的枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)YB-3菌株的培養液、培養液的上清液或菌體的蛋白質。該菌種已經于2009年4月17日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國.武漢.武漢大學，郵編430072，電話
(027)68754052，傳真(027)68754833，E-mail:cctcciwhu.edu.cn，其保藏號為 CCTCC NO:M209075。

本發明的再一個目的是提供一種本發明的蛋白質的應用。為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案:本發明對菌株Bacillus subtilis YB-3產生的凝乳酶進行了純化:
(I)乙醇分級沉淀法初步純化凝乳酶。將粗酶液置于冰浴中，經過30-60%乙醇分級沉淀后，12，OOOg 30min離心獲得的蛋白沉淀復溶于的50mM的pH 6.0的磷酸緩沖液中。經檢測，沉淀中的凝乳酶活力回收達到71.4%。(2)分子篩層析法進一步純化凝乳酶。通過SDS-PAGE電泳分析，表明:經過兩步純化，該凝乳酶已經達到電泳純，其亞基分子量約為42+ IkDa ;最終，凝乳酶純化倍數(表I)為9.5，回收率為19.1%，比活達到8889SU/mg。該凝乳酶，基于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分子量為42±lkDa。菌株Bacillus subtilis YB_3產生的凝乳酶具備牦牛乳特異性,可以用于生產牦牛乳乳酪和牛乳乳酪中的應用。這里所說的牦牛乳特異性是指，當以不同哺乳動物奶液為底物時，菌株BacillussubtilisYB-3產生的凝乳酶對牦牛乳的凝乳活性最高，使牦牛乳最快凝固。菌株Bacillus subtilis YB-3產生的凝乳酶在ρΗ5.0-8.0時，具有較高的凝乳活性，其最適反應pH是6.0。該酶在pH5.0-8.0放置一小時保持較高的穩定性，在此范圍外，其凝乳活性大幅度下降。該酶在40°C _80°C內都具有較高的凝乳活性，在70°C活性最強，在0-50°C放置一小時后，仍然能保留初始活力的100%，較穩定。當溫度大于等于60°C時，該酶活力隨著放置時間的變化迅速失活。
Ca2+、Al3+、K+離子對該凝乳酶有激活作用，而Fe2+、Cu2+、Zn2+對該凝乳酶有抑制作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、巰基蛋白酶抑制劑β-Mercaptoethanol、天冬氨酸蛋白酶抑制劑抑肽劑(P印statin)對該酶活力幾乎無抑制作用，而EDTA對該酶凝乳活性有顯著抑制作用。本發明分離克隆了菌株Bacillus subtilis YB_3產生的凝乳酶,所述凝乳酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。該凝乳酶的編碼基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
LC/MS/MS (HPLC-mass spectrometryanalysis)分析結果顯不，該凝乳酶屬于金屬蛋白酶家族。在NCBI上進行比對，發現該凝乳酶編碼基因與Bacillus subtilismetalloprotease gene (Bacillus subtilis 金屬蛋白酶基因)同源性為 98.97%,有 16 個堿基不同。CDS區域編碼基因對應的氨基酸比對結果發現相似度為99.03%，有五個氨基酸不同。本發明的優點為，1、該種凝乳酶，具有牦牛乳特異性，可以加速牦牛乳凝固，在牦牛乳酪生產領域具有廣闊的應用前景。2、該種凝乳酶具備熱穩定性，并在中性環境下保持高凝乳活性，所以與小牛皺胃凝乳酶相比，更適用于牦牛乳奶酪的制備。3、該酶也可以同時應用于普通牛奶的凝乳。


圖1是凝乳酶的SDS-PAGE電泳分析，其中1_標準分子量蛋白，2_粗酶液，3_乙醇分級沉淀后凝乳酶液，4-分子篩層析后凝乳酶液；圖2表示純化凝乳酶的最適反應溫度、pH和溫度、pH穩定性,其中圖2a表示凝乳酶的最適反應溫度，圖2b表示凝乳酶的溫度穩定性；圖2c表示凝乳酶的最適反應pH，圖2d表示凝乳酶的pH穩定性。圖 3表不Bacillus subtilis YB-3產生的凝乳酶(MCE from Bacillus subtilis)對于牛奶(cow milk)和牦牛奶(yak milk)的凝乳活性。其中以小牛皺胃凝乳酶Maxiren1800和真菌源凝乳酶MCE from Rhizomucor pusillus作為對照凝乳酶。圖4表示純化Bacillus subtilis YB-3產生的凝乳酶制備牛乳乳酪和牦牛乳乳
酪圖5表示Bacillus subtilis YB-3產生的凝乳酶的指紋圖譜與Bacilluspumilus金屬蛋白酶(gi56405351)匹配結果。下劃線為一致性序列。
具體實施例方式實施例一Bacillus subtilis YB-3的培養及發酵液的制備。Bacillus subtilis YB-3的搖瓶發酵在IOOml三角瓶中進行，其中包含30ml的發酵培養基。發酵培養基由10g/L酪蛋白，3g/L牛肉膏，5g/LNaCl，5g/LNa2HP04*12H20組成，初始pH 7.0。上述培 養基接種Iml的對數期的菌液，37°C，150轉/分鐘振蕩培養。發酵結束后，發酵液離心5分鐘除去菌體，離心力3020g，上清液即為粗酶液。
實施例二凝乳酶蛋白水解活性測定和凝乳活性的測定。凝乳酶測定方法參照IDF的方法157A: 1997。蛋白水解活性測定方法參照改良的Lorry法。實施例三菌株Bacillus subtilis YB-3所產凝乳酶的純化程序。首先，粗酶液經過30-60%乙醇分級沉淀后，12，OOOg 30min離心獲得的蛋白沉淀復溶于的50mM的pH 6.0的磷酸緩沖液中。上述復溶的酶液通過Waters protein pak i_125分子篩層析柱(7.5x300mm)進一步分離純化，上述層析柱預先用50mM pH6.0磷酸緩沖液(含有0.15M Na2SO4)平衡。分離過程中，樣品檢測波長為OD28tl,流動相采用相同的緩沖液，流速1.0ml/min，每1.0ml洗脫液作為一個組分，分部收集。收集活性組分并通過Amicon Ultra (Milipore)超濾濃縮及脫鹽。最終獲得的酶濃縮液進行SDS-PAGE電泳分析(圖1)。:經過兩步純化，該凝乳酶已經達到電泳純，其亞基分子量約為42± IkDa ;最終，凝乳酶純化倍數(表I)為9.5，回收率為19.1%，比活達到8889SU/mg。該凝乳酶，基于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分子量為42±lkDa。表IBacillus subtilis YB-3所產凝乳酶的純化步驟及結果:凝乳酶活性
權利要求
1.一種凝乳酶，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.根據權利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:該凝乳酶最適凝乳pH是6.0 ;該酶在PH5.0-8.0放置一小時保持穩定。
3.根據權利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:該凝乳酶最適凝乳溫度70°C;在0-50°C放置一小時后，仍然能保留初始活力的100%。
4.根據權利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:Ca2+、Al3+、K+離子對該凝乳酶有激活作用，而Fe2+、Cu2+、Zn2+對該凝乳酶有抑制作用。
5.根據權利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:純化后的酶的分子量按SDS-PAGE所確定為 42 土 lkDa。
6.根據權利要求1所述的凝乳酶，其特征在于:該凝乳酶對于牦牛乳具有底物特異性。
7.根據權利要求1所述凝乳酶用于生產奶酪、干酪素以及酸奶等乳制品中的應用。
8.根據權利要求1所述凝乳酶用于生產奶酪、干酪素以及酸奶等乳制品中的應用，其特征在于:所述乳制品的原料為牛奶或牦牛奶。
9.一種編碼 如權利要求1所述凝乳酶的基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
全文摘要
本發明提供了一種凝乳酶，其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發明所述的凝乳酶具備牦牛乳底物特異性，該凝乳酶可用于制備牦牛乳乳酪。本發明還提供了一種編碼權利要求1所述的凝乳酶的基因，其中，其核昔酸序列如SEQ ID NO1所示。本發明的優點為，該種凝乳酶使牦牛乳快速凝固，可以克服傳統凝乳酶不適宜牦牛乳乳酪生產的問題，作為小牛皺胃凝乳酶的替代品，在牦牛乳深加工領域具備廣泛的應用前景。
文檔編號A23C19/02GK103243081SQ20121003301
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月14日 優先權日2012年2月14日
發明者不公告發明人 申請人:蘭州小涼河生物技術有限責任公司