專利名稱：耐高溫dna聚合酶基因序列及編碼的多肽和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物遺傳領(lǐng)域，具體涉及屬于嗜熱厭氧菌的一種分離的耐高溫DNA聚合酶基因序列及編碼的多肽和制備方法。耐高溫DNA聚合酶可廣泛用于基因克隆，基因診斷和基因治療等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
DNA聚合酶是與DNA修復(fù)及復(fù)制過(guò)程有關(guān)的酶家族，DNA聚合酶已從大腸桿菌(如大腸桿菌DNA聚合酶I和Klenow片段)中分離，T4DNA聚合酶以及近來(lái)一些耐高溫DNA聚合酶已經(jīng)被分離，如來(lái)自T.aquaticus的DNA聚合酶(美國(guó)專利號(hào)4,889,818)，以及來(lái)自T.litoralis的DNA聚合酶，耐高溫DNA聚合酶被建議用來(lái)擴(kuò)增現(xiàn)有核苷酸序列，其數(shù)量比原有的要多。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和鏈置換擴(kuò)增(SDA)是擴(kuò)增核苷酸序列的兩種方法。PCR是基于寡聚核苷酸引物雜交到特異靶DNA分子的兩條鏈上，隨后在DNA聚合酶作用下引物延伸產(chǎn)生兩條新的DNA雙鏈，其每條鏈都能用作下輪雜交與延伸的模板。SDA區(qū)別PCR在于其恒溫?cái)U(kuò)增過(guò)程，即所有反應(yīng)在同一溫度下進(jìn)行，無(wú)需升高溫度來(lái)溶解DNA雙鏈。DNA聚合酶如測(cè)序酶，Klenow酶，Taq酶等已經(jīng)廣泛用于DNA測(cè)序(美國(guó)專利號(hào)5,173,411)。目前，耐高溫DNA聚合酶已經(jīng)廣泛用于基因克隆技術(shù)領(lǐng)域，主要是來(lái)自T.aquaticus嗜熱菌的Taq DNA多聚酶，然而該酶在工作時(shí)易產(chǎn)生一定的誤差。
騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)是生活在我國(guó)云南省騰沖縣的熱泉中的一種微生物，是一種嗜熱的真細(xì)菌(eubacteria)，最適生長(zhǎng)溫度為75攝氏度，厭氧生長(zhǎng)，革蘭氏染色反應(yīng)呈陽(yáng)性。它由中國(guó)科學(xué)院微生物所首先發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行了分類學(xué)上的分析。菌種保存在中國(guó)微生物保存中心MB4T(Chinese collection ofmicroorganisms AS 1.2430T＝JCM 11007T)。該嗜熱厭氧菌是我國(guó)特有的一個(gè)物種，其體內(nèi)所具有的耐高溫DNA聚合酶也具有自己特有的結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種非常實(shí)用的，性能良好的耐高溫DNA聚合酶基因序列及編碼的多肽和制備方法。本發(fā)明通過(guò)對(duì)騰沖嗜熱厭氧菌全基因組測(cè)序，利用基因預(yù)測(cè)軟件得到一段含10，020堿基對(duì)的序列，用PCR擴(kuò)增該基因，然后克隆到表達(dá)載體pBV220中，并在大腸桿菌中獲得高表達(dá)。通過(guò)堿基缺失和突變研究以及蛋白質(zhì)功能研究表明，該基因是一個(gè)編碼耐高溫DNA聚合酶的基因序列，同時(shí)，該耐高溫DNA聚合酶兼具有反轉(zhuǎn)錄酶的活性。該基因?qū)τ谥苽溆糜谏a(chǎn)耐高溫DNA聚合酶的轉(zhuǎn)基因微生物或動(dòng)植物，并回收獲得該基因編碼的酶有用。
另外，本發(fā)明還提供了具有耐高溫DNA聚合酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同體。同時(shí)，本發(fā)明還提供了制備，分離，純化具有耐高溫DNA聚合酶活性的多肽的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明涉及一種分離的DNA，它能編碼具有耐高溫DNA聚合酶活性的多肽的核苷酸序列。
上述分離的DNA，它還具有編碼SEQ ID NO2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式的核苷酸序列，該修飾形式功能上相當(dāng)或與耐高溫DNA聚合酶相關(guān)。
上述分離的DNA，它還具有SEQ ID NO1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無(wú)義、插入、錯(cuò)義。
本發(fā)明還涉及一種分離出的多肽，它具有耐高溫DNA聚合酶活性。
上述分離出的多肽，它具有SEQ ID NO2中的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
本發(fā)明還涉及一種載體，它含有能編碼具有耐高溫DNA聚合酶活性的多肽的核苷酸序列之分離的DNA。
本發(fā)明還涉及一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)耐高溫DNA聚合酶的方法，包括1)分離出具有編碼耐高溫DNA聚合酶多肽的核苷酸序列SEQ.ID NO.1；2)構(gòu)建含SEQ.ID NO.1核苷酸序列的表達(dá)載體；3)將步驟2)中表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成能生產(chǎn)耐高溫DNA聚合酶多肽的重組細(xì)胞；4)培養(yǎng)步驟3)中的重組細(xì)胞；5)分離、純化得到耐高溫DNA聚合酶活性的多肽。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對(duì)于制備用于生產(chǎn)耐高溫DNA聚合酶的轉(zhuǎn)基因微生物或動(dòng)植物，并回收獲得該基因編碼的酶有用。
在本發(fā)明中，“分離的”DNA是指該DNA或片斷已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片斷已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，“耐高溫DNA聚合酶基因”指編碼具有耐高溫DNA聚合酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指該序列中有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于公知的密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
在本發(fā)明中，“分離的”蛋白的多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析，PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度。分離的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組份。
在本發(fā)明中，“耐高溫DNA聚合酶蛋白”指具有耐高溫DNA聚合酶活性的SEQ IDNO.2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括SEQ ID NO.2序列的變異體，這些變異體具有與天然耐高溫DNA聚合酶相同的功能。這些變異體包括(但不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失，插入和/或取代，以及在C末段和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如，為本領(lǐng)域所公知的，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末段和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括耐高溫DNA聚合酶的活性片斷和活性衍生物。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的各種質(zhì)粒，粘粒，噬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的耐高溫DNA聚合酶時(shí)，可以將耐高溫DNA聚合酶基因序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成耐高溫DNA聚合酶表達(dá)載體。表達(dá)載體含有復(fù)制起始點(diǎn)和表達(dá)調(diào)控序列，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和必要的加工信息位點(diǎn)。表達(dá)載體還必須含有可供選擇的標(biāo)記基因，如a)提供對(duì)抗生素或其他毒性物質(zhì)(氨芐青霉素，卡那霉素，氨甲蝶呤等)的抗性的蛋白質(zhì)或b)互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型蛋白質(zhì)或c)提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒(méi)有的必需營(yíng)養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)。各種不同宿主的合適標(biāo)記基因是本領(lǐng)域中所熟知或生產(chǎn)廠商說(shuō)明書著名的。這些表達(dá)載體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組DNA技術(shù)制備，如可參考Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1992。
重組表達(dá)載體可以用本領(lǐng)域熟知的方法引入宿主細(xì)胞，這些方法包括電轉(zhuǎn)化法，氯化鈣法，基因槍法等。將外源重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過(guò)程稱為“轉(zhuǎn)化”。通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)所需蛋白的表達(dá)，并通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的蛋白分離技術(shù)，如柱層析等得到所需的蛋白質(zhì)。也可采用固相技術(shù)等人工合成該蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核細(xì)胞如大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，或各種動(dòng)植物細(xì)胞。
本發(fā)明的耐高溫DNA聚合酶基因全長(zhǎng)序列或其片斷通常可以用PCR擴(kuò)增法，重組法，或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備的嗜熱厭氧菌全基因組DNA為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)序列，就可以將其克隆入有關(guān)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到大批量的有關(guān)序列。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建步驟圖。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例測(cè)序與數(shù)據(jù)分析流程圖。
具體實(shí)施例方式
下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述1)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建采用全基因組霰彈法(shotgun)進(jìn)行。首先培養(yǎng)騰沖嗜熱厭氧菌，培養(yǎng)方法按(Yanfen Xue，2000)改進(jìn)的MB培養(yǎng)基(Balch et al.，1979)，按Marmur(1961)方法收集細(xì)菌，提取總DNA。為了保證測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的隨機(jī)性，最大程度地避免產(chǎn)生斷裂熱點(diǎn)的問(wèn)題，采用多種方法、不同條件的建庫(kù)原則。先采用物理剪切方法(包括超聲波法及用Hydroshear Machine進(jìn)行剪切)，其次根據(jù)該菌基因組特征選用AluI進(jìn)行隨機(jī)部分酶切。物理剪切時(shí)采用不同強(qiáng)度處理樣品，酶切時(shí)通過(guò)設(shè)置酶量梯度處理樣品。處理后的樣品經(jīng)平末端處理后，采用電泳分部收集1.5-4kb DNA片段，與去磷酸化的經(jīng)SmaI酶切的pUC18進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物通過(guò)電轉(zhuǎn)化E.coli DH5α構(gòu)建了隨機(jī)測(cè)序的文庫(kù)。同時(shí)，為了便于以后長(zhǎng)片斷(contig)的搭接還構(gòu)建了長(zhǎng)插入片段(10kb左右)的測(cè)序文庫(kù)(將基因組DNA以Sau3AI隨機(jī)部分酶切，電泳收集10kb左右的片段，與去磷酸化的經(jīng)BamHI酶切的pUC18進(jìn)行連接、構(gòu)建文庫(kù))。該文庫(kù)經(jīng)兩個(gè)末端的測(cè)序在完成圖(finishing)的過(guò)程中可以得到contig之間的關(guān)系，并可以解決較大的gap對(duì)補(bǔ)洞造成的困難。建庫(kù)流程如圖1所示。
2)基因組測(cè)序在完成騰沖嗜熱厭氧菌基因組的測(cè)序時(shí)，主要使用了兩種全自動(dòng)測(cè)序儀ABI377和MegaBACE 1000。這兩種測(cè)序儀都是利用電泳原理進(jìn)行測(cè)序，每次可完成96個(gè)樣品。ABI377是PE公司的產(chǎn)品，是ABI系列的一種。它屬于平板凝膠電泳測(cè)序儀。MegaBACE 1000是法瑪西亞公司的產(chǎn)品，屬于毛細(xì)管凝膠電泳測(cè)序儀。
3)Basecalling和測(cè)序質(zhì)量監(jiān)控所謂Basecalling是指從測(cè)序儀上得到的原始數(shù)據(jù)文件中得到正確的堿基序列的過(guò)程。由于測(cè)序儀上得到的是A，T，G，C四種堿基對(duì)應(yīng)的不同波長(zhǎng)的光的強(qiáng)度變化軌跡(trace)，需要用計(jì)算機(jī)采取一定的算法從中正確識(shí)別出不同的軌跡對(duì)應(yīng)的堿基。這里我們使用的是Phred軟件(Ewing B，Hillier L，1998)，原因是其結(jié)果更可靠，并且其結(jié)果輸出更便于同一軟件包中的其他程序進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
Phred進(jìn)行Basecalling的算法原理，是根據(jù)軌跡中各個(gè)峰的形狀，間距，以及信噪比等因素，判斷堿基類型，同時(shí)對(duì)這個(gè)堿基給出可信度信息，即堿基的測(cè)序質(zhì)量。在大規(guī)模測(cè)序中，測(cè)序質(zhì)量的監(jiān)控是十分重要的，它直接影響對(duì)測(cè)序的決策，包括文庫(kù)的構(gòu)建，覆蓋率的大小。同時(shí)對(duì)測(cè)序?qū)嶒?yàn)中可能出現(xiàn)的失誤能及時(shí)反饋。
4)序列拼接所謂序列拼接，就是把全基因組霰彈法，又稱鳥槍法隨機(jī)測(cè)序得到的樣品序列組裝成連續(xù)的長(zhǎng)片斷(contig)，主要利用它們之間的重疊序列作參考。考慮到測(cè)序中存在載體的影響，需要先對(duì)樣品序列進(jìn)行去載體處理。這里所用的軟件cross_match和后面拼接所用的軟件Phrap都是美國(guó)Washington大學(xué)的軟件(Gordon D，Abajian c，1998)，其基本原理為Swith-Waterman算法(Waterman MS，1990)。這是一種動(dòng)態(tài)算法，在考慮了兩兩序列之間的比較之后，可以得到一組序列的公有序列(consensus sequence)。去除載體后的樣品序列再用Phrap進(jìn)行拼接。在拼接時(shí)，堿基的測(cè)序質(zhì)量也被考慮了，所得到的公有序列各堿基的可信度，由組成該公有序列的樣品的測(cè)序質(zhì)量計(jì)算得到。
5)基因注釋在大體得到基因組的大部分序列(完成工作框架圖)后，就需要對(duì)基因組進(jìn)行注釋，包括進(jìn)行開(kāi)讀框架(Open Reading Frame，ORF)的預(yù)測(cè)，基因功能的預(yù)測(cè)，以及特殊RNA片斷的分析等。
第一步采用缺省參數(shù)的GLIMMER2.0(Delcher，A.L.，Harmon，D.1999)和ORPHEUS(Frishman，D.1998)軟件預(yù)測(cè)基因編碼序列，然后所有預(yù)測(cè)的開(kāi)讀框和非編碼區(qū)(intergenicregion)都用BLAST軟件(Altschul，S.F.et al.1997)與NCBI的無(wú)冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundant protein database)比較來(lái)發(fā)現(xiàn)可能漏掉的基因。在判斷一個(gè)基因的起始點(diǎn)時(shí)，將參考各種相關(guān)信息，如序列同源性，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，可能的信號(hào)肽序列和啟動(dòng)子序列等。如果在一個(gè)開(kāi)讀框內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)啟動(dòng)子時(shí)，一般采用第一個(gè)啟動(dòng)子作為基因的起始點(diǎn)。采用TransTerm軟件(Ermolaeva，M.D.2000)在非編碼區(qū)預(yù)測(cè)不依賴于Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止子。如果該終止子位于一個(gè)基因的下游區(qū)的太遠(yuǎn)處，則可能暗示一個(gè)小基因的丟失或測(cè)序錯(cuò)誤人為地縮短了該基因，可作為進(jìn)一步分析的參考。在確定移框突變和點(diǎn)突變時(shí)，主要根據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)的相似性來(lái)判斷。如果出現(xiàn)一個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)于兩個(gè)彼此相鄰的編碼序列的情況，則被認(rèn)為是一個(gè)無(wú)活性基因(假基因pseudogenes)，因?yàn)檫@說(shuō)明這兩個(gè)編碼序列之間由于突變而產(chǎn)生異常中止現(xiàn)象，進(jìn)而使基因失去活性。所有分析結(jié)果再用Artemis sequence viewer軟件(Rutherford，K.et al.2000)進(jìn)行手工分析。一些明顯與其它編碼序列有重疊的開(kāi)讀框，長(zhǎng)度小于150堿基對(duì)并且在已有數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有同源性和其中沒(méi)有明顯的啟動(dòng)子或終止區(qū)域的開(kāi)讀框?qū)⒈蝗コ?br> 蛋白質(zhì)的功能片斷(motif)和功能區(qū)域(domain)分別采用與Pfam、PRINTS、PROSITE、ProDom和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果再用InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)(Apweiler，R.et al.2001)進(jìn)行匯總分析。根據(jù)NCBI的COGs數(shù)據(jù)庫(kù)(Tatusov，R.L.et al.2001)并且參照其他數(shù)據(jù)庫(kù)的查詢結(jié)果來(lái)確定蛋白質(zhì)在COGs分類中的功能分類和可能的代謝途徑。用TMHMM軟件(Krogh，A.et al.2001)來(lái)確認(rèn)膜蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和跨膜功能域。采用革蘭氏陰性菌為參數(shù)，用SIGNALP2.0軟件(Nielsen，H.et al.1999)分析信號(hào)肽區(qū)域。
6.耐高溫DNA聚合酶的制備和提純根據(jù)實(shí)施例中基因注釋的到的耐高溫DNA聚合酶全長(zhǎng)編碼序列(SEQ IDNO.1)，設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。根據(jù)基因預(yù)測(cè)結(jié)果，在該基因上游和下游設(shè)計(jì)引物，為便于克隆，在上游引物增加了Xbal I位點(diǎn)。
為獲得有部分堿基缺失的基因突變體，在所需要缺失部分的兩側(cè)再設(shè)計(jì)引物。所有引物由北京奧科生物公司負(fù)責(zé)合成。
以第1)部分中獲得的測(cè)序文庫(kù)的質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在保證閱讀框正確的前提下重組至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。再將重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中(轉(zhuǎn)化方法為CaCL2法或電轉(zhuǎn)化法)。篩選鑒定的到含有表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-Dna。
挑取單菌落的工程菌DH5α-pGEX-2T-Dna于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)37℃過(guò)夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)所需蛋白的工程菌。
按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)所需蛋白的工程菌后，將細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20mlPBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結(jié)合了所需蛋白的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，上清即為洗脫的蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)純化效果。在？Kda處的蛋白質(zhì)條帶即為耐高溫DNA聚合酶。
對(duì)耐高溫DNA聚合酶的保真性進(jìn)行鑒定步驟1 設(shè)計(jì)10對(duì)PCR引物，用騰沖嗜熱厭氧菌熱穩(wěn)定性DNA多聚酶對(duì)已知序列的10個(gè)目的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)條件如下95度變性5分鐘---95度變性30秒---52度復(fù)性30秒---72度延伸3分鐘(35個(gè)循環(huán))---72度延伸10分鐘---4度結(jié)束步驟2 PCR產(chǎn)物純化并測(cè)序PCR產(chǎn)物純化用QIANQEN公司純化試劑盒，測(cè)序引物用PCR引物，雙向測(cè)序，在PE公司的ABI-377測(cè)序儀上進(jìn)行。
步驟3序列結(jié)果分析將測(cè)序結(jié)果與已知序列的10個(gè)目的DNA系列進(jìn)行比較，結(jié)果完全吻合。
總結(jié)本發(fā)明介紹了一種純化的耐高溫DNA聚合酶或片段及其基因。它有騰沖嗜熱厭氧菌(T.tengcongensis)耐高溫DNA聚合酶的活性。本發(fā)明中純凈酶在SDS-PAGE下的分子量約90,000D，具有5’--3’外切酶活性，實(shí)驗(yàn)條件下DNA合成的最適溫度是75度，Mg2+、Mn2+的濃度分別為1mM和0.5mM。該酶適用于鏈置換合成DNA、DNA測(cè)序反應(yīng)以及DNA反轉(zhuǎn)錄合成。與騰沖嗜熱厭氧菌耐高溫DNA聚合酶具有相同的DNA復(fù)制效率的各種突變(如缺失或替換)也被包括在當(dāng)前的發(fā)明中。
序列表1.SEQ ID NO.1(1)序列特征a.長(zhǎng)度10020堿基對(duì)b.類型DNA/RNAc.鏈型雙鏈d.幾何結(jié)構(gòu)線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述atgaaatttgtgtgtgataaaaattcattgttggaaggcgtcaatatagccataaggggggtatcctcccgtaccacccttcccatattgcaaggaataaaaataacagcaagaggcaatgtcataaagctttcaggtactgacctcgagatagggatagagtgtcaaatacccgcagttattgaagaagagggggagacagttgttccagcaaggatttttagtgacctcgtaaaaaaattgcctgaaggagaagtggaagtaaaaagcgattcacagaatactgtaaatgtggtttcaggagacataaacttctcaattgcaggaagcaatccagaagaatttcctgaaatacctgaagtatcaagagaaaagtcatttaaacttccccaatcaatcctcaaagacttgataaaaaagacagttttttgcgtctcagaagagcagactaggccaattctaacaggggtactttttgaagtatttccaaatgagcttaaagcagtggcattggacggatttagaatggccatatactcttataagtcggaaaagtccttttttgacgaagaagcggagaagtactctcttgtcattccgggagataccatcgatgaaatttcaaggatattggaagatgaagagacagaggtaataatataccacacttccaaccaggtgcttttccagattgataacactaaagtcatctcaaggcttcttgaagggagttttataaactacaacgctgtgctccctaaagattttaagacagagatcactataaataaagatgtgtttatggaaagccttgaaagggcatctctaattgctgagagcaagaacaatttagtaaaatttgaaataggagatagctttattgtgatttcttcaagttcggaaaaaggaagtatgtcagaaaagttggaagtggaagttaaaggaatgcttctagagattgcttttaactctagatatttacttgatgcgctcaaggcaattaatgaagaagaagtaaatctttacttcataaacagcataaatccgctaataataaaaccagtgggggaaaaggaatacctctacatgatactgccggtgaagcttaactaaatgtatcagtctttgtacaggaaatacaggccaaaaagtttcagtgaagttgtggggcaggaccacattgtgaggactctgaggaatcaaataaaaatgggaaggatagggcatgcatatctttttacaggcacaagggggacagggaaaactagtgtagcaaaaatttttgcaaaggcggtaaactgtttaaatccaaaagacggtgagccctgcaattcctgtgaggtgtgtcaggcgataaacactggtactactatggatgtcttggaaatagatgctgcatctaataacagcgtgaatgacgtgagagaacttagagagtctgtaatctactctccttctctgacaaagtacaaagtatatataatagatgaagtgcatatgctttctacaggagcttttaacgcccttttaaaaacacttgaagagccccctcgccatgtgattttcattcttgctaccactgaacctgagaaactgcctgacactatcctctcgcgttgccagaggttcgattttaaaaagataccgacaaagcagattgcacagaatctagaaaggatttgccaagatagcggtatacagattgaacaaaacgggataagagctatcgctctttatggaaatggttcaatgagagatgcgataagtcttttagagcaatgcgcttcttacaaggaaggattaataacctatgaagatgtttgtgaaatattgggagttgcgaatgaagaaatgcttttttcacttttagatcatatttacgagaaggatgcggtagcttctttacagcaactggataaaatattgtcctatggaatagatttaggaaattttctaaggtcctttacttatatgctaagagatatggttatatacaaaactgggggagatgagctaatagagattttgtacggagatcaagagaccataaaagcaaagtcgcagaaatacagcataggatttttgacaaatgctttggagaagtttactgctttgcagagagagataagatatgctgtttcacctgttacattgcttgaattgacgattttaagacttattaggccggaaatttcttacgatatgggaagcttgatagctagaatagaagagctagaggaaaaaataaataaagggtatgtggtaacaaaagaagagagtgcgaaaacacatgaaaaagatgagctagaaaaaaaggttgatgctacaaaagaggcaaaaaaagaaagggaggaaattgatttaggaagagtttggcttgaagtaaagggaattctcaaaaaggaaaggatgatgctctatactttcctagagaagggtgttccccatttaaaggatggcaaaattgttgtggagtattccgaagaagacgctcttttggtggaacagcttggtaggccagagaataaagactttattgaaggagtagtagaaaaagtagtgaagaaaagaattccaatagagtttgctctaaaaaaaagcgaagaggaccttttaattaagcaggtaaaggaattttttggggatggaattgacatagaaataatatagatgaactatagggaatttgtagaaagcataaaaaagggacagatagctcctttataccttttttacggagaagagagatttttgcttttagatgctgttaagaggttgaaggcaaggctcttggtgccagagtttgaggatatgaattacattgtaattgagagggaaaatccggaggaatacgtagaagccatcattgagaattgcgagactctcccttttttttcaaattataaaattgtagtggtgaaaaatgaagaagaacagctttccaagataggtgataaagagttaaaaaggcttactgattattttaaaaacagggtgctaggaaatactagtcttgttgttgtagttgtaagtggtgaaaaaatagattcgagaaaaaaattgtacaagtttatggaaaaagaagctgctgtggtggagtttaaaaagctcactccggaagaggcagttaattatgccggctatttcttaaaaaaacacggtaaaaaggctgcaaaaaaggatgtagaatctcttgtgaaaaacataggaactgacctttactcaattgtgaacgagctggagaaagtgatagcctattcagaaggggaaacgcttgatttggaggaagcaagagaggtgctttcagttactctccagcagaacgtgtttcaccttgtgaatgcaatagggatgaaaaaagagaaagaggcttatagagctctttatgcgcttctttcaaaaggggaagtgccgcttataatcttaacgatgattgcaaggcagataaggcttattgcaaagttgaaatctctagaaggaaaggctttcgataaaaagtctatagccagttacttaggcattcctttctttgctgtagatgatatcgtaaggcagagcaagctttttacaagagaagatttgtataaggcgtacaaagagtgtttgaggtgcgacatagcattaaaaagcggaacagagccttcatttgcgctggaaaatctcataaaaaaattatgcaagcaataaatggttccagcgactttcttggaaaacatgcaaataaaaaaagtaagagttgaaaaaaagagccgaaaactcactgtggttgtctcctctttctcatcaaatgcacaaaagctctcagaatttcagtcttttttggaggaaagctttccttctctaaaggagataaagattgtggtggaaagcccttctttatcaacagtagaagaggttttggaaaactgggagaaagtagtattagagcttagcgaagagtacccttcttccttaagttttttaaagacctgtgatgtcgcaaaagagggacagaataggataactgtaaaggctccaacttacgcaatttacgaaatggctaaaagcagcaaattagattttgcaataagagaatttttaaggaacaggtatgaacttaatttagatgtagaacttattttttcagaagaaggggaagaaattgcagaaaaaataatcgaagaagacataaaagcaattgaggaagttatccaaaaagatgagaagtctaaaaaggagaagagtaggtctgaagaaaatagagttctccttggcaaagaaatgaaagctaaacctatctctattaaggatgtaagtgcagaaaccgatgaggtagtgattgaaggagaaatattttctattgattttaaagagttgaagtcaaaagttctcatggtgtttgacattacagattatactagttcaatacttgtcaaaacctttttgacagaagaaaaatatgaaattttgaaagatgaaatagatgtaggaacttttgtcaggttaagaggaaatgtgatatacgataagtacgaaggagaccttgtaattgatttgaaagacttagagctcattcctccaaaaaagagaatggatttgtccgaagaaaagagagtggagcttcaccttcacacccagatgagcactttagatgccgtcccttctgctactgaagtgataaagagagcggcagaatggggacacaaggctgttgcaataacagaccacgcagtggttcaagcttttccagaggcaatggaagcatctcgagagtatggggttaaggttatatacggaatggaagggtatatggtggatgacggaataccaattgtcactggagaatccgaagctagtttggaaggcgaatttgtggtatttgatatcgaaaccacaggcctttcaaacataaatgacgagataatagagattgg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ID NO.2(1)序列特征a.長(zhǎng)度3754氨基酸b.類型多肽c.鏈型單鏈d.幾何結(jié)構(gòu)立體(2)分子類型蛋白質(zhì)(3)序列描述MKFVCDKNSLLEGVNIAIRGVSSRTTLPILQGIKITARGNVIKLSGTDLEIGIECQIPAVIEEEGETVVPARIFSDLVKKLPEGEVEVKSDSQNTVNVVSGDINFSIAGSNPEEFPEIPEVSREKSFKLPQSILKDLIKKTVFCVSEEQTRPILTGVLFEVFPNELKAVALDGFRMAIYSYKSEKSFFDEEAEKYSLVIPGDTIDEISRILEDEETEVIIYHTSNQVLFQIDNTKVISRLLEGSFINYNAVLPKDFKTEITINKDVFMESLERASLIAESKNNLVKFEIGDSFIVISSSSEKGSMSEKLEVEVKGMLLEIAFNSRYLLDALKAINEEEVNLYFINSINPLIIKPVGEKEYLYMILPVKLNMYQSLYRKYRPKSFSEVVGQDHIVRTLRNQIKMGRIGHAYLFTGTRGTGKTSVAKIFAKAVNCLNPKDGEPCNSCEVCQAINTGTTMDVLEIDAASNNSVNDVRELRESVIYSPSLTKYKVYIIDEVHMLSTGAFNALLKTLEEPPRHVIFILATTEPEKLPDTILSRCQRFDFKKIPTKQIAQNLERICQDSGIQIEQNGIRAIALYGNGSMRDAISLLEQCASYKEGLITYEDVCEILGVANEEMLFSLLDHIYEKDAVASLQQLDKILSYGIDLGNFLRSFTYMLRDMVIYKTGGDELIEILYGDQETIKAKSQKYSIGFLTNALEKFTALQREIRYAVSPVTLLELTILRLIRPEISYDMGSLIARIEELEEKINKGYVVTKEESAKTHEKDELEKKVDATKEAKKEREEIDLGRVWLEVKGILKKERMMLYTFLEKGVPHLKDGKIVVEYSEEDALLVEQLGRPENKDFIEGVVEKVVKKRIPIEFALKKSEEDLLIKQVKEFFGDGIDIEIIMNYREFVESIKKGQIAPLYLFYGEERFLLLDAVKRLKARLLVPEFEDMNYIVIERENPEEYVEAIIENCETLPFFSNYKIVVVKNEEEQLSKIGDKELKRLTDYFKNRVLGNTSLVVVVVSGEKIDSRKKLYKFMEKEAAVVEFKKLTPEEAVNYAGYFLKKHGKKAAKKDVESLVKNIGTDLYSIVNELEKVIAYSEGETLDLEEAREVLSVTLQQNVFHLVNAIGMKKEKEAYRALYALLSKGEVPLIILTMIARQIRLIAKLKSLEGKAFDKKSIASYLGIPFFAVDDIVRQSKLFTREDLYKAYKEGLRGDIALKSGTEPSFALENLIKKLGKQMVPATFLENMQIKKVRVEKKSRKLTVVVSSFSSNAQKLSEFQSFLEESFPSLKEIKIVVESPSLSTVEEVLENWEKVVLELSEEYPSSLSFLKTCDVAKEGQNRITVKAPTYAIYEMAKSSKLDFAIREFLRNRYELNLDVELIFSEEGEEIAEKIIEEDIKAIEEVIQKDEKSKKEKSRSEENRVLLGKEMKAKPISIKDVSAETDEVVIEGEIFSIDFKELKSKVLMVFDITDYTSSILVKTFLTEEKYEILKDEIDVGTFVRLRGNVIYDKYEGDLVIDLKDLELIPPKKRMDLSEEKRVELHLHTQMSTLDAVPSATEVIKRAAEWGHKAVAITDHAVVQAFPEAMEASREYGVKVIYGMEGYMVDDGIPIVTGESEASLEGEFVVFDIETTGLSNINDEIIEIGAVKIKNKKIVDTFETFVNPQIPISSFITKLTGIDESMVKDAPLIEEVLPKFLEFAKGAVLVAHNANFDVSFIKSKAKKLGLTVENTVLDTLELSRHLYQDLKNYKLDTLAEFFEVKLLHHHRAVEDAKATAEIFIKMLEKLQEIGIKSVSEINSVLMEREVDVKKLPVYHVTILVKDQKGLRNLYEIISRSNLEFFHRTPRIPKSLLVKMREGLIIGSACEQGEVFRALVSNLEEKKLEDIINFYDYLEIQPVGNNEFLIERGEVRSVEELKEINRKIYELGKKYNKLVVATGDVHFLDPWDDVYRKILMAGKGYKDADRQPPLYFRTTEEMLMEFEYLGEEAAREVVIENPNKIAEIVEDVKPIPEGTFPPVIEGAEEELRRITLEKAHEIYGDPLPPIVQERLDRELNAIINNGYAVMYVIAQKLVSKSLQDGYLVGSRGSVGSSLVATMSGITEVNPLPPHYVCPKCKHSEFVTDGSFGCGVDMPDKYCPNCGTLMKKDGFDIPFEVFMGFEGDKEPDIDLNFSGEYQPIAHRYTEELFGKGHVFRAGTIGTLADKTAYGYVKKYFEERNLTVHKSEIKRLTMGCTGIKRTTGQHPGGVMVVPKDKSIYDFTPIQRPADAEDTDVITTHFDYHSLSGKLLKLDILGHDDPTVIRMLEDLTGVNARKIPLDDKKTMSLFTSVEALGIDPEELGTPVGTLGLPEFGTKFVRQMLIETRPTTFDELVRISGLSHGTDVWLNNAQDIIREGIATLKEVIAARDDIMLYLISKGMDKKLSFKIMENVRKGKGVTQEEIEEMKKHGVPDWFIQSCQKIKYMFPKAHAVAYVIMAFRIAYFKVYYPEAFYATYFTVRADDFNLDIVLGGKESIKRAIKEIEAKGNNATPKEKNLLTVLEVALEMYLRGIKFTNVDLYRSDAEKFLITEEGLLPPLNSLEGVGIQAAKAIAQERENGKFISIEDFRNRTRVSKTVIEILKQYGCLEDLPESNQLSLFVRAMFVHLHVHTEYSLLDGSCRIKDLIAKTKELGMKAIAITDHGAMYGVIDFYKEAVAQGIKPIIGCEIYVAPRRMQDREYGIDDENYHLVLLAKDMTGYKNLMKIVTAASLEGFYYKPRVDKEFLKNHSEGLIALSACLAGEVPSLILRGDYEKAKEVALFYDSIFGRGNFYLELQDHGILEQKKVNRELVRMSKETGIPLVATNDVHYLEKKDARAHEVLLCIQTGKTIEDEDRMLFPTDEFYLKSPEEMEELFACCKEAIENTEKIAEMCNIEFEFNKTKLPKYDLPEGVDSYEYLRNLCYEGLYKRYKSPSQEVIDRLEYELSVIKQMGYVDYFLIVWDFIKFAKDNGIMTGPGRGSAAGSLVAYTLGITNVDPIKYNLLFERFLNPERVSMPDIDSDFCYERRQEVIDYVVRKYGKDNVAQIITFGTMAARAVIRDVGRALNYPYAEVDEIAKMIPFELGMTIDRALELNPELKERYEKDERVKQLIDISKALEGLPRHASTHAAGVVISKEPLVNYVPLQKNDDSVVTQFPMTTLEELGLLKMDFLGLRTLTVIRDTIEMVKKNKGIIIDLDSLNYDDPKVYELISKGETEGVFQLESPGMRQFMTELKPKNLEDIIAGISLYRPGPMDQIPKYLANRNNPEKIEYEHPILKPILEVTYGSLVYQEQVMQIVRDVAGYSLGRADLVRRAMAKKKMDVMEQERKNFIYGIVDEEGNVVVPGALRNGLDEETANRLFDQMLEFANYAFNKSHAAAYAVIAYQTAYLKRYFPVEFMAALLNSFVDNLDKIAFYVQVCKKMGIKVLPPDINESDSYFTVVGDKIRFGLSAVKNVGINVTEEIVREREARGKFKSVIDFFERMQDSQLNKKAIESLIKAGAFASLGVKRSQLLQSYDKLIESVKKAKSSAIEGQISLFEVSEEHKEIDFRFPDVEEYPKNRILSMEKETLGLYISGHPLEEYLEDIPKITNVTTLDFKINPEDEMFTSKLEDNQEVTIAGVIVAKKVKFTRNSNIMAFVTLEDMYGTVEVIVFPAVYERYSSLIKEDNAVLIKGKVSVKEEEEPKILCDDIKLLSQVVVKKLYINMEDSSKIEEVKEVLKKCPGNMPVVLKVNSKLLAAKRDLWVNGSKELIKKLEDIVGKENVKVV
權(quán)利要求
1.一種分離的DNA，其特征在于它是編碼具有耐高溫DNA聚合酶活性的多肽的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的DNA，其特征在于它的編碼具有SEQ ID NO2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式的核苷酸序列，該修飾形式功能上相當(dāng)或與耐高溫DNA聚合酶相關(guān)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的DNA，其特征在于它具有SEQID NO1的多核苷酸序列以及它的突變形式，突變類型包括缺失、無(wú)義、插入、錯(cuò)義。
4.一種分離出的多肽，其特征在于它具有耐高溫DNA聚合酶活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離出的多肽，其特征在于它具有SEQ ID NO2中的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
6.一種載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1中之DNA。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于它是用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
8.一種制備耐高溫DNA聚合酶蛋白的方法，其特征在于該方法包括1)分離出編碼耐高溫DNA聚合酶蛋白的核苷酸序列SEQ IDNO.1；2)構(gòu)建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表達(dá)載體；3)將步驟2)中表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成能生產(chǎn)耐高溫DNA聚合酶蛋白的重組細(xì)胞；4)培養(yǎng)步驟3)中的重組細(xì)胞；5)分離、純化得到耐高溫DNA聚合酶蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼具有活性或其功能等同變異體的分離的DNA和利用重組DNA技術(shù)以所述分離的DNA生產(chǎn)具有耐高溫DNA聚合酶活性的多肽或其功能等同變異體。以騰沖嗜熱厭氧菌全基因組測(cè)序與分析為基礎(chǔ)，克隆分離了耐高溫DNA聚合酶基因。該基因?qū)τ谥苽溆糜谏a(chǎn)耐高溫DNA聚合酶的轉(zhuǎn)基因微生物或動(dòng)植物，并回收獲得該基因編碼的酶有用。另外，本發(fā)明還提供了具有耐高溫DNA聚合酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同體。同時(shí)，本發(fā)明還提供了制備，分離，純化具有耐高溫DNA聚合酶活性的多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1417338SQ0113211
公開(kāi)日2003年5月14日 申請(qǐng)日期2001年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月6日
發(fā)明者李蔚, 汪建, 包其郁, 胡詠武, 胡松年 申請(qǐng)人:杭州華大基因研發(fā)中心