專利名稱：基于pcr檢測谷絲核菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及種特異性引物在聚合酶鏈式反應方法檢測谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)，一種小麥真菌病原體的用途。這些引物可用于監(jiān)控植物種群中病害的發(fā)展。
每年，植物病害引起相當可觀的作物減產(chǎn)，這既導致農(nóng)民的經(jīng)濟損失，又在世界許多地方導致當?shù)厝丝跔I養(yǎng)供應不足。殺真菌劑的廣泛使用為防止植物病原體侵襲提供了有力的安全保障。盡管用于殺真菌劑的費用達到10億美元，但在1981年全世界范圍內作物損失約占作物價值的10％(James，1981；Seed Sci.& Technol.9679-685)。
病害破壞的嚴重程度由病原體的進攻性和宿主的反應決定的。大多數(shù)植物育種計劃的一個目的是增加宿主植物對病害的抵抗能力。一般地，不同品種的病原體與同一作物的不同變種的相互作用不同，并且許多宿主抵抗源僅能抵御特定的病原體品種。而且，一些病原體品種導致病害早期癥狀，但對作物的傷害很小。Jones和Clifford(1983；谷類病害(Cereal Diseases)，John Wiley)報導，在將抗性引入宿主栽培品種時，預期會在病原體種群中出現(xiàn)強致病性的病原體類型。因此，有必要監(jiān)控病原體種群。另外，已有幾篇關于對特定殺真菌劑產(chǎn)生抗性的真菌菌株的進化的文獻案例。早至1981年，F(xiàn)letcher和Wolfe(1981；Proc.1981 Brit.Crop Prot.Conf.)主張，因殺真菌劑氯苯氧基二甲乙基三唑乙醇的使用，來自春大麥的24％白粉菌種群和來自冬大麥的53％白粉菌種群表現(xiàn)出相當可觀的變異性，并且在不同品種之間這些種群的比例不同，其中最敏感品種具有最高發(fā)生率的較不敏感變種。真菌對殺真菌劑的敏感性有相似的變異。已有文獻記載了小麥霉屬(同樣對氯苯氧基二甲乙基三唑乙醇)、葡萄孢屬(Botrytis)(對苯菌靈)、核腔菌屬(Pyrenophora)(對有機汞)、假尾孢霉屬(Pseudocercosporella)(對MBC型殺真菌劑)，以Mycosphaerella fijiensis對三唑類等等(Jones和Clifford；谷類病害，John Wiley，1983)。
在國際市場上，小麥是目前最重要的農(nóng)產(chǎn)品，約占全世界耕種土地的20％(1977；小麥病害概略(Compendium of Wheat Diseases)，美國植物病理學協(xié)會，第1頁)。全世界小麥供應量的80％來自北美、歐洲、中國和蘇聯(lián)。每年，因病害而損失大約全球小麥產(chǎn)量的20％。
尖銳眼狀斑紋病(sharp eyespot)是由谷絲核菌van der Hoeven(有性型Ceratobasidium cereale Murray & Burpee)引起，可發(fā)生在小麥、大麥、燕麥和黑麥(1977；小麥病害概略，美國植物病理學協(xié)會，第50頁)。一些病原體分離物仍能感染草坪草，引起黃斑病。嚴重的小麥感染會引起早熟和倒伏，因而影響產(chǎn)量。現(xiàn)在，還沒發(fā)現(xiàn)對尖銳眼狀斑紋病有抗性的栽培品種。
因此，的確需要發(fā)展能在感染早期鑒定出特定真菌病原體的技術。通過在作物出現(xiàn)明顯的病害癥狀之前鑒定出具體的病原體，農(nóng)學家能評估在作物品種中已鑒定出的病原體的進一步發(fā)展的可能影響，并且如果有必要運用殺真菌劑，將能選擇合適的殺真菌劑。
因此，本發(fā)明提供了一種分離的DNA分子，其包括選自下組的內部轉錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列(a)谷絲核菌的ITS1，其中谷絲核菌的ITS1包括SEQ ID NO17的核苷酸31-243，SEQ ID NO18的核苷酸31-242，SEQ ID NO19的核苷酸31-243，SEQ ID NO20的核苷酸31-241，SEQ ID NO21的核苷酸31-243，SEQ ID NO22的核苷酸31-243，SEQ ID NO243的核苷酸31-180，SEQ ID NO24的核苷酸31-240，SEQ ID NO25的核苷酸31-242，或SEQ ID NO26的核苷酸31-242；(b)谷絲核菌的ITS2，其中谷絲核菌的ITS2包括SEQ ID NO17的核苷酸397-630，SEQ ID NO18的核苷酸396-629，SEQ ID NO19的核苷酸397-630，SEQ ID NO20的核苷酸395-628，SEQ ID NO21的核苷酸397-630，SEQ ID NO22的核苷酸397-630，SEQ ID NO23的核苷酸397-630，SEQ ID NO24的核苷酸394-627，SEQ ID NO25的核苷酸396-629，或SEQ ID NO26的核苷酸396-629。
本發(fā)明還提供●一種在基于擴增的真菌內部轉錄間隔區(qū)DNA序列的檢測中使用的寡核苷酸引物，其中所述引物的序列與在上文提到的內部轉錄間隔區(qū)序列的至少10個連續(xù)核苷酸相同。
●一對在基于擴增的真菌內部轉錄間隔區(qū)DNA序列的檢測中使用的寡核苷酸引物，其中至少所述引物之一是上文提到的寡核苷酸引物。
●一種選自SEQ ID NO7-16的寡核苷酸引物。
●一對寡核苷酸引物，其中至少所述引物之一選自SEQ IDNO7-16。
●在上文提到的一對寡核苷酸引物，其中所述引物對選自下列引物對SEQ ID NO12和SEQ ID NO9，SEQ ID NO1和SEQ ID NO10，SEQ ID NO1和SEQ ID NO9，SEQ ID NO1和SEQ ID NO14，SEQ ID NO12和SEQ ID NO4，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9，SEQ ID NO15和SEQ ID NO9，SEQ ID NO16和SEQ ID NO9，SEQ ID NO15和SEQ ID NO4，SEQ ID NO16和SEQ ID NO4，SEQ ID NO15和SEQ ID NO10，和SEQ ID NO16和SEQ ID NO10●在上文提到的一對寡核苷酸引物，其中所述引物對是SEQ IDNO12和SEQ ID NO9。
本發(fā)明還提供●一種檢測真菌病原體的方法，包括步驟(a)從感染病原體的植物葉片中分離DNA；(b)用所述DNA進行聚合酶鏈式反應擴增，其中使用至少一種根據(jù)本發(fā)明的引物；和(c)通過顯示所述聚合酶鏈式反應擴增的產(chǎn)物來檢測所述真菌病原體，特別是，其中所述真菌病原體是谷絲核菌。
●一種檢測真菌病原體的方法，包括步驟(a)從感染病原體的植物葉片中分離DNA；(b)以所述DNA為模板，使用根據(jù)本發(fā)明的一對引物，進行聚合酶鏈式反應，擴增所述病原體的內部轉錄間隔區(qū)序列的一部分；和(c)通過顯示該內部轉錄間隔區(qū)序列的已擴增部分來檢測所述真菌病原體，特別是，其中所述真菌病原體是谷絲核菌。
●一種檢測谷絲核菌的方法，包括步驟(a)從感染谷絲核菌的植物葉片中分離DNA；(b)以所述DNA為模板，使用根據(jù)本發(fā)明的一對引物，進行聚合酶鏈式反應，擴增谷絲核菌的內部轉錄間隔區(qū)序列的一部分；和(c)通過顯示該內部轉錄間隔區(qū)序列的已擴增部分來檢測谷絲核菌。
●在上文提到的方法，其中所述引物對是SEQ ID NO12和SEQ IDNO9。
本發(fā)明還提供●用于檢測真菌病原體的診斷試劑盒，其中包括根據(jù)本發(fā)明的引物。
本發(fā)明描述了鑒定植物致病真菌的不同致病型的方法。本發(fā)明提供了在不同真菌致病型之間表現(xiàn)出多樣性的內部轉錄間隔區(qū)(ITS)DNA序列。這些DNA序列在本發(fā)明的方法中是有用的，因為可用它們衍生在基于聚合酶鏈式反應(PCR)的診斷檢測中所用的引物。這些引物在所用的DNA模板來自特定的真菌致病型的PCR反應中產(chǎn)生獨有的片段。因此在病害癥狀發(fā)生之前，可用于鑒定在宿主植物材料中特定的致病型的存在與否。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明為病原體谷絲核菌提供ITS1和ITS2 DNA序列(例如，SEQ ID NO17-26)。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明為檢測谷絲核菌提供ITS衍生的診斷引物(例如，SEQ IDNO7-16)。
本發(fā)明使評估作物變種與病原體菌株之間特定關系的潛在破壞成為可能，也使合理使用各種已有的殺真菌劑成為可能。而且，本發(fā)明能提供在擴展的地理區(qū)域里關于特定病原體品種發(fā)展和蔓延的詳細信息。本發(fā)明提供一種特別適用于檢測有長潛伏期的病害的方法。
也提供了在本發(fā)明的實踐中有用的試劑盒。這些試劑盒在鑒別真菌病原體谷絲核菌中有特殊用途。
對序列表中的序列的簡要描述SEQ ID NO1寡核苷酸引物ITS1。
SEQ ID NO2寡核苷酸引物ITS2。
SEQ ID NO3寡核苷酸引物ITS3。
SEQ ID NO4寡核苷酸引物ITS4。
SEQ ID NO5M13通用-20引物。
SEQ ID NO6用于實施例2中的反向引物。
SEQ ID NO7寡核苷酸引物JB643。
SEQ ID NO8寡核苷酸引物JB644。
SEQ ID NO9寡核苷酸引物JB645。
SEQ ID NO10 寡核苷酸引物JB646。
SEQ ID NO11 寡核苷酸引物JB647。
SEQ ID NO12 寡核苷酸引物JB648。
SEQ ID NO13 寡核苷酸引物JB649。
SEQ ID NO14 寡核苷酸引物JB650。
SEQ ID NO15 寡核苷酸引物JB687。
SEQ ID NO16 寡核苷酸引物JB688。
SEQ ID NO17 從谷絲核菌分離物44235 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸397-630)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-687)。
SEQ ID NO18從谷絲核菌分離物AGDC57 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-242)，5.8S rRNA基因(核苷酸243-395)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸396-629)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸630-686)。
SEQ ID NO19從谷絲核菌分離物CAG1BN1 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸397-630)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-687)。
SEQ ID NO20從谷絲核菌分離物AGDC73 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-241)，5.8S rRNA基因(核苷酸242-394)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸395-628)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸629-685)。
SEQ ID NO21從谷絲核菌分離物52182 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸397-630)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-687)。
SEQ ID NO22從谷絲核菌分離物Bn505 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸397-630)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-686)。
SEQ ID NO23從谷絲核菌分離物R88-303 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸397-630)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-687)。
SEQ ID NO24從谷絲核菌分離物52184 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-240)，5.8S rRNA基因(核苷酸241-393)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸394-627)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸628-684)。
SEQ ID NO25從谷絲核菌分離物62063 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-242)，5.8S rRNA基因(核苷酸243-395)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸396-629)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸630-686)。
SEQ ID NO26從谷絲核菌分離物52183 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸31-242)，5.8S rRNA基因(核苷酸243-395)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸396-629)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸630-686)。
SEQ ID NO27谷絲核菌的ITS區(qū)域的DNA序列的GenBank序列(編號#AF063019)列表，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-29)，內部轉錄間隔區(qū)1(核苷酸30-241)，5.8S rRNA基因(核苷酸242-394)，內部轉錄間隔區(qū)2(核苷酸395-628)和大亞基rRNA基因的5’末端(核苷酸629-685)。
SEQ ID NO28從曲毛假尾孢霉(P.herpotrichoides)分離物R1 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端，內部轉錄間隔區(qū)1，5.8S rRNA基因，內部轉錄間隔區(qū)2和大亞基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO29從穎枯殼針孢(5.nodorum)分離物24425 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端，內部轉錄間隔區(qū)1，5.8S rRNA基因，內部轉錄間隔區(qū)2和大亞基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO30從小麥殼針孢(S.tritici)分離物26517 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端，內部轉錄間隔區(qū)1，5.8S rRNA基因，內部轉錄間隔區(qū)2和大亞基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO31從偃麥草核腔菌(P.tritici-repentis)分離物6715 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端，內部轉錄間隔區(qū)1，5.8S rRNA基因，內部轉錄間隔區(qū)2和大亞基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO32從大刀鐮孢(F.culmorum)分離物62215 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端，內部轉錄間隔區(qū)1，5.8S rRNA基因，內部轉錄間隔區(qū)2和大亞基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO33從M.nivale分離物520 PCR擴增出的ITS區(qū)域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亞基rRNA基因的3’末端，內部轉錄間隔區(qū)1，5.8S rRNA基因，內部轉錄間隔區(qū)2和大亞基rRNA基因的5’末端。
本發(fā)明提供了在鑒定植物致病真菌的不同致病型中有用的獨特DNA序列。尤其是，在基于PCR分析以鑒別真菌致病型時，該DNA序列可用作引物。本發(fā)明的DNA序列包括特定真菌病原體的核糖體RNA基因區(qū)域的內部轉錄間隔區(qū)(ITS)序列，以及從這些區(qū)域衍生的能用于鑒定該特定病原體的引物。在同一病原體物種或屬的不同成員之間，ITS DNA序列不同，可用于鑒別這些特定的成員。
生物醫(yī)藥研究者使用基于PCR的技術檢測受感染動物組織中的病原體已有一段時間，并取得了一定成功。然而，僅僅在最近，該技術才應用于檢測植物病原體。已應用對病原體線粒體基因組特異的序列經(jīng)PCR檢測受感染小麥中禾頂囊殼(Gaumannomyces graminis)的存在(Schlesser等，1991；應用與環(huán)境微生物學(Applied andEnviron.Microbiol.)，57553-556)。隨機擴增的多態(tài)DNA(即RAPD)標記能區(qū)分針葉樹硬皮性潰瘍(scleroderris canker)致病因子的Gremmeniella abietina的眾多品種。美國專利No.5,585,238(在此完整引入作為參考)描述了來自殼針孢屬、假尾孢屬和球腔菌屬菌株的核糖體RNA基因區(qū)域的ITS序列的引物，以及這些引物在用基于PCR的技術鑒定這些真菌分離物中的使用。另外，WO95/29260(在此完整引入作為參考)描述了來自鐮孢屬菌株的核糖體RNA基因區(qū)域的ITS序列的引物，以及這些引物在用基于PCR的技術鑒定這些真菌分離物中的使用。并且，美國專利No.5,800,997(在此完整引入作為參考)描述了來自尾孢霉屬(Cercospora)、長蠕孢屬(Helminthosporium)、球梗孢屬(Kabatiella)、柄銹菌屬(Puccinia)菌株的核糖體RNA基因區(qū)域的ITS序列的引物，以及這些引物在用基于PCR的技術鑒定這些真菌分離物中的使用。
因為核糖體基因拷貝數(shù)量高，所以適合用作分子探針的靶基因。盡管成熟rRNA序列的保守性高，但非轉錄間隔區(qū)序列和轉錄間隔區(qū)序列通常保守性較差，因此適合作為檢測最近的進化分歧的靶序列。
真菌rRNA基因以單位形式組織起來，每個單位編碼18S(小亞基)、5.8S和28S(大亞基)三個成熟亞基。這些亞基被兩個約300bp的內部轉錄間隔區(qū)ITS1和ITS2分開(White等，1990；PCR方案；Innes等編著；315-322頁)。另外，這些轉錄單位被非轉錄間隔區(qū)序列(NTS)分開。ITS和NTS序列特別適合用于檢測不同真菌病原體的特定致病型。
本發(fā)明的DNA序列來自不同植物病原體的核糖體RNA基因區(qū)域的內部轉錄間隔區(qū)序列。來源于同一病原體種或屬的不同致病型的ITSDNA序列在這同一種或屬的不同成員之間不同。一旦確定了一種病原體的ITS序列，即可將這些序列與其他ITS序列進行比對。這樣，可從ITS序列推導出引物。即可以根據(jù)ITS內含有真菌致病型之間在序列上有最大差異的區(qū)域設計出引物。這些序列和基于這些序列設計出的引物可用于鑒定特定的病原體。
感興趣的特定DNA序列包括來自谷絲核菌的ITS DNA序列。該ITSDNA序列公開于SEQ ID NO17-26。來自這些ITS序列具有代表性的寡核苷酸引物序列公開于SEQ ID NO7-16。這些序列可用于基于PCR鑒別感興趣的病原體。
在PCR分析中使用本發(fā)明的引物的方法在本領域是眾所周知的。例如，見美國專利Nos.4,683,195和4,683,202，以及Schlesser等(1991)，應用與環(huán)境微生物學(Appfied and Environ.Microbiol.)，57553-556。還參見Nazar等(1991；生理與分子植物病理學(Physiol.and Molec.Plant Pathol.)391-11)，其中用PCR擴增方法檢測黃萎輪枝孢(Verticillium albo-atrum)和大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)在ITS區(qū)域的差異，并因此區(qū)分開這兩個物種；Johanson和Jeger(1993；真菌學研究(Mycol.Res.)97670-674)用相似的技術區(qū)分開香蕉病原體Mycosphaerella fijiensis和Mycosphaerella musicale。
本發(fā)明的ITS DNA序列可用本領域已知的方法從真菌病原體克隆。通常，從真菌分離物中分離DNA的方法是已知的。見Raeder和Broda(1985)，應用微生物通訊(Letters in Applied Microbiology)217-20；Lee等(1990)，真菌遺傳學通訊(Fungal GeneticsNewsletter)3523-24；Lee和Taylor(1990)，PCR方案方法和應用指南(InPCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Innes等編著)，282-287頁。
或者，可通過PCR擴增確定感興趣的ITS序列。在一個作為例子的實施例中，用于擴增整個ITS區(qū)域的引物是根據(jù)White等(1990；PCR方案；；Innes等編著，315-322頁)的方法設計的，并將擴增的ITS序列亞克隆到pCR2.1克隆載體。被亞克隆的序列包括左側ITS(ITS1)、右側ITS(ITS2)和位于中間的5.8S rRNA基因。該方法用于谷絲核菌的幾種分離物。
在每個病原體組中比較確定的ITS序列以定位序列差異，而這種差異可用于在PCR中區(qū)分不同菌種和/或菌株。典型的已確定的ITSDNA序列表示在SEQ ID NOs17-26中。用這些序列做了一個比較性的序列比對。在鑒定序列差異中，合成了大量引物并用于PCR擴增。作為PCR擴增檢測的模板首先用純化的病原體DNA，然后用從受感染的宿主植物組織中分離的DNA。這樣，有可能鑒定出診斷性的引物，即可鑒定特定的病原體菌種或菌株而不是同一病原體的另一菌種或菌株。
優(yōu)選的引物組合能用于區(qū)分受感染宿主組織中的不同菌種或菌株，即已感染了特定病原體菌種或菌株的宿主組織。本發(fā)明提供了大量達到檢測谷絲核菌標準的引物對。本發(fā)明的引物是依據(jù)真菌ITS區(qū)域的序列差異設計出的。序列之間一個堿基對的最小差異即能保證設計出區(qū)別性的引物。對特異真菌DNA的ITS區(qū)域設計的引物可與對核糖體DNA編碼區(qū)域的保守序列區(qū)域設計的引物聯(lián)合使用，以擴增出菌種特異性的PCR片段。通常，引物的理論熔解溫度應該在約60到70℃，以得到好的敏感性，并且在引物聯(lián)合中應避免形成顯著的二級結構和3’端重疊。通常，引物至少與ITS1或ITS2的約5-10個相鄰核苷酸有100％序列相同。在優(yōu)選的實施例中，任何來源的引物的長度大約是5-30個核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明易于制備包含進行該過程所必須的成分的試劑盒。該試劑盒包括一個被區(qū)室化的載體，從而在這封閉的區(qū)域里放下一個或更多的容器，例如試管或小瓶。其中的一個容器可包含未標記或可檢測標記的DNA引物。標記的DNA引物可處于凍干狀態(tài)或必要時處于合適的緩沖溶液中。一個或更多的容器可包含一種或更多的用于PCR反應的酶或試劑。這些酶或是純品或是混合品，可處于凍干狀態(tài)或合適的緩沖液中。
最后，試劑盒可含有進行本發(fā)明技術所必須的全部其他成分，例如緩沖液、提取試劑、酶、吸液管、平板、核酸、三磷酸核苷、濾紙、凝膠材料、轉移材料、放射自顯影設備等等。
下面的實施例展現(xiàn)了典型的實驗方案，該實驗方案可用于分離ITS序列、篩選合適的引物序列、檢測引物的篩選和診斷功效，以及這些引物在病害和真菌分離物檢測中的使用。通過例文性而非限制性的方式提供了這些實施例。
實施例這里使用的標準重組DNA和分子克隆技術在本領域是眾所周知的，這些技術在以下的書中有描述J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1984)；Ausubel，F(xiàn).M.等，分子生物學最新方案，Greene Publishing Assoc和Wiley-Interscience出版(1987)。
實施例1真菌分離物和真菌基因組DNA提取見表1，列出了使用的真菌分離物和它們的來源。通過用來自PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基的菌絲體片段接種150ml的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液，從而培養(yǎng)真菌。在有軌振蕩器上28℃培養(yǎng)7-11天。或者，可直接將菌絲體從PDA平板分離出。菌絲體經(jīng)離心而沉淀，再在液氮中研磨，用Lee和Taylor的方案(1990；PCR方案方法和應用指南；Innes等編著；282-287頁)提取總基因組DNA。
表1被測分離物的來源
1美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，馬里蘭，美國2Marc Cubeta博士，北卡羅萊納州立大學，Raleigh，北卡羅萊納，美國3Lee Burpee博士，喬治亞大學，Athens，喬治亞，美國4Simon Edwards博士，Harper Adams農(nóng)業(yè)學院，Newport，Shropshire，英國5Novartis Crop Protection AG，CH-4002 Basel，瑞士6Paul Nelson博士，賓夕法尼亞州立大學，賓夕法尼亞，美國7Novartis，Vero Beach，佛羅里達，美國8Cynthia Ocambi博士，俄勒岡州立大學，Corvallis，俄勒岡，美國9Paul Nicholson博士，John Innes Centre，Norwich，英國實施例2內部轉錄間隔區(qū)(ITS)區(qū)域的分離挑選表1所列的的真菌分離物，利用從中分離出的10ng基因組DNA，使用50pmol的ITS1引物(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；SEQ ID NO1)和ITS4引物(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’；SEQ ID NO4)，進行PCR擴增，得到大約700bp長的內部轉錄間隔區(qū)區(qū)域片段。按實施例4的描述進行PCR。用Invitrogen Corporation(San Diego，CA)的TA克隆試劑盒(分類編號K2000-01)和PCR2.1克隆載體對PCR產(chǎn)物進行克隆。用Applied Biosystems(Foster City，CA)的自動測序儀，通過雙脫氧法測定ITS區(qū)域的DNA序列，所用引物是ITS1引物(SEQ ID NO1)、ITS4引物(SEQ ID NO4)、M13通用-20引物(5’-gtaaaacgacggccagt-3’；SEQ ID NO5)和反向引物(5’-aacagctatgaccatg-3’；SEQ ID NO6)。White等(1990；PCR方案；Innes等編著，315-322頁)對ITS引物ITS1和ITS4有詳細描述。
實施例3從小麥中提取DNA用大塊浸解方法從小麥中提取DNA。用大塊浸解方法從大田里幾個自然感染的小麥莖稈分離DNA，以優(yōu)化用于高產(chǎn)率分析的大田取樣方法。
大塊浸解方法(1)從莖稈基部之上的主分蘗直接切下4cm長的小麥莖稈，將適當數(shù)量這樣的小麥莖稈放進Bioreba(Reinach，瑞士)高容量塑料袋(目錄號490100)中。秤量植物組織重量，用裝有莖稈部分塑料袋的重量減去無關部分重量(塑料袋重量)。
(2)每克小麥組織加等量體積(ml)的Muller提取緩沖液(0.1％w/v Tween-80；0.04M Tris-Cl，pH7.7；0.15M NaCl；0.1％w/vBSA-Pentex fraction V；0.01％w/v疊氮鈉；200mM EDTA)。用BiorebaHomex 6勻漿器以轉速70浸析組織。研磨葉片直到組織成纖維狀。
(3)使用時，集中多個塑料袋的提取物，并混勻。將提取液等量分裝到放在冰上的微量離心管中。
(a)將100μl濃縮提取物煮沸5分鐘。
(b)將煮沸的提取物放在冰上。
(c)通過將10μl煮沸的濃縮提取物加入90μl無菌dH2O中，使之按1∶10稀釋。
(d)將稀釋的提取物保存在冰上備用。
實施例4聚合酶鏈式反應擴增用購自Perkin-Elmer/Cetus的GeneAmp試劑盒(Norwalk，CT；分類編號N808-0009)進行聚合酶鏈式反應，其中在最終體積為50μl的反應中使用50mM KCl，2.5mM MgCl2，10mM Tris-HCl，pH8.3，包含dTTP、dATP、dCTP和dGTP各200μM，每種引物各50pmol，2.5個單位的Taq聚合酶，10ng基因組DNA或1μl的按1∶10稀釋的植物提取液。反應在Perkin-Elmer/Cetus9600型或9700型熱循環(huán)儀中進行30-40循環(huán)，每個循環(huán)為94℃時，15秒，50℃-70℃時，15秒，72℃時，45秒。每個PCR樣品在1.0％瓊脂糖凝膠上上樣10μl，電泳，由此分析產(chǎn)物。
實施例5寡核苷酸的合成與提純例如，寡核苷酸(引物)由Intergrated DNA Technologies(Coralville，IA)或Midland Certified Reagent(Midland，德克薩斯)合成。
實施例6物種特異性引物的選擇將來自谷絲核菌分離物44234的ITS區(qū)域與來自穎枯殼針孢、曲毛假尾孢霉-R型、偃麥草核腔菌、大刀鐮孢、M.nivale和小麥殼針孢的ITS區(qū)域進行序列比對。以對比序列的分析為基礎，根據(jù)實施例5，合成寡核苷酸引物，如下表2中所列引物。對在真菌菌種之間序列上含有最大差異的區(qū)域設計引物。在以下谷絲核菌分離物的ITS區(qū)域之間進行另一個序列比對44235、AGDC57、CAGBN1、AGDC73、52182、Bn505、R88/303和52184。對谷絲核菌分離物的高保守區(qū)域也設計引物。另外，合成已發(fā)表的核糖體基因特異引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4(White等，1990；PCR方案；Innes等編著，315-322頁)，用于與ITS區(qū)域特異性引物聯(lián)合進行檢測。
表2為檢測真菌設計的引物引物模板引物引物序列18S rDNA ITS1 5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’(SEQ ID NO1)5.8S rDNA ITS2 5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’(SEQ ID NO2)5.8S rDNA ITS3 5’-gcatcgatgaagaacgcagc-3’(SEQ ID NO3)25S rDNA ITS4 5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(SEQ ID NO4)谷絲核菌 JB6435’-gcgagagagaggctggct-3’(SEQ ID NO7)谷絲核菌 JB6445’-ctcgcgagagagaggctggct-3’(SEQ ID NO8)谷絲核菌 JB6455’-gagatcagatcataaagtgtg-3’(SEQ ID NO9)谷絲核菌 JB6465’-gagatcagatcataaagtgtgtttg-3’(SEQ ID NO10)谷絲核菌 JB6475’-ctgtgcaactgtttagacggtcg-3’(SEQ ID NO11)谷絲核菌 JB6485’-tgcaactgtttagacggtcg-3’(SEQ ID NO12)谷絲核菌 JB6495’-accgttagaagcggttcgtccat-3’(SEQ ID NO13)谷絲核菌 JB6505’-gttagaagcggttcgtccat-3’(SEQ ID NO14)谷絲核菌 JB6875’-tgcacctgtttagacggttg-3’(SEQ ID NO15)谷絲核菌 JB6885’-tgtgcacctgtttagacggt-3’(SEQ ID NO16)實施例7引物對純化的真菌基因組DNA的特異性的測定根據(jù)實施例4，使用不同的引物組合(表3)進行PCR，以擴增出單一的特異性片段。在每種感興趣的真菌菌株中，從由大、小核糖體DNA亞基之間的ITS區(qū)域設計的引物得到特異的PCR擴增產(chǎn)物。表3衍生自ITS的診斷性PCR引物引物特異性 5’端引物3’端引物擴增片段的大概長度谷絲核菌JB648(SEQ ID NO12)JB645(SEQ ID NO9) 523bp谷絲核菌ITS1(SEQ ID NO1) JB646(SEQ ID NO10) 637bp谷絲核菌ITS1(SEQ ID NO1) JB645(SEQ ID NO9) 637bp谷絲核菌ITS1(SEQ ID NO1) JB650(SEQ ID NO14) 596bp谷絲核菌JB648(SEQ ID NO12)ITS4(SEQ ID NO4)573bp谷絲核菌JB643(SEQ ID NO7) JB645(SEQ ID NO9) 485bp谷絲核菌JB687(SEQ ID NO15)JB645(SEQ ID NO9) 523bp谷絲核菌JB688(SEQ ID NO16)JB645(SEQ ID NO9) 525bp谷絲核菌ITS1(SEQ ID NO1) JB650(SEQ ID NO14) 596bp谷絲核菌JB648(SEQ ID NO12)ITS4(SEQ ID NO4)573bp谷絲核菌JB643(SEQ ID NO7) JB645(SEQ ID NO9) 485bp谷絲核菌JB687(SEQ ID NO15)JB645(SEQ ID NO9) 523bp谷絲核菌JB688(SEQ ID NO16)JB645(SEQ ID NO9) 525bp谷絲核菌JB687(SEQ ID NO15)ITS4(SEQ ID NO4)573bp谷絲核菌JB688(SEQ ID NO16)ITS4(SEQ ID NO4)575bp谷絲核菌JB687(SEQ ID NO15)JB646(SEQ ID NO10) 523bp谷絲核菌JB688(SEQ ID NO16)JB646(SEQ ID NO10) 525bp實施例8引物對已感染真菌的植物組織的特異性和引物與其他谷類真菌病原體的交叉反應性的測定按實施例3的描述，從健康小麥莖稈和已感染谷絲核菌的小麥莖稈分離總基因組DNA。按實施例4的描述，對小麥組織DNA進行PCR，以檢測引物組合，如表3中所列的那些。按實施例1的描述，獲得純化的真菌基因組DNA，并且按實施例4的描述，用診斷性引物進行PCR分析。對其他真菌DNA菌種和分離物進行測試，以分析各診斷性引物之間的交叉反應能力。
用谷絲核菌特異引物組合JB648(SEQ ID NO12)和JB645(SEQ IDNO9)，從表1所列的所有谷絲核菌分離物的DNA以及谷絲核菌感染的小麥組織的DNA中擴增出一個523bp片段。該引物組合不能從健康小麥組織擴增出診斷性片段。該引物組合也不能從下列常見谷類病原體的純化的基因組DNA中擴增出診斷性片段曲毛假尾孢霉-R-和W-致病型、D.sorokiniana、扁豆枝孢、小麥殼針孢、落花生尾孢、穎枯殼針孢、茄絲核菌、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、M.nivale、偃麥草核腔菌和圓核腔菌。用表3所列的其他谷絲核菌特異引物組合得到相似的診斷結果。
雖然只參考具體實施方案描述了本發(fā)明，但應當理解，大量的變更、修改和進一步的實施方案是有可能的，因此，所有這些變更、修改和實施方案被認為屬于本發(fā)明的范圍。
序列表序列表<110>Syngenta Participations AG<120>基于PCR檢測谷絲核菌<130>PB/5-31135A<140><141><150>US 09/481293<151>2000-01-11<160>33<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列ITS1的描述<400>1tccgtaggtg aacctgcgg 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列ITS2的描述<400>2gctgcgttct tcatcgatgc 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列ITS3的描述<400>3gcatcgatga agaacgcagc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列ITS4的描述<400>4tcctccgctt attgatatgc 20<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列M13通用20引物的描述<400>5gtaaaacgac ggccagt 17<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列反向引物的描述<400>6aacagctatg accatg16<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB643的描述<400>7gcgagagaga ggctggct18<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB644的描述<400>8ctcgcgagag agaggctggc t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB645的描述<400>9gagatcagat cataaagtgt g21<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB646的描述<400>10gagatcagat cataaagtgt gtttg25<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB647的描述<400>11ctgtgcaact gtttagacgg tcg23<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB648的描述<400>12tgcaactgtt tagacggtcg 20<210>13<211>23<213>人工序列<220><223>人工序列JB649的描述<400>13accgttagaa gcggttcgtc cat 23<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB650的描述<400>14gttagaagcg gttcgtccat20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB687的描述<400>15tgcacctgtt tagacggttg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB688的描述<400>16tgtgcacctg tttagacggt20<210>17<211>687<212>DNA<213>谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)<400>17tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta atgaaatgaa tgtagagtcg gttgtagctg 60ggtcttttaa tcgaggccat gtgcacacct tctctttcat ccactcacac ctgtgcacct 120gtttagacgg ttgaaggaaa aagtctttct cgcgagagag agggccggct ccttttcccg 180tccaatacat aaaatcttat atatttaatc agaatgtaat cgatgtaaac gcatctataa 240actaagtttc aacaacggat ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 300ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc accttgcgct 360ccttggtatt 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1.一種分離的DNA分子，其包括選自下組的內部轉錄間隔區(qū)(ITS)序列(a)谷絲核菌的ITS1，其中谷絲核菌的ITS1包括SEQ ID NO17的核苷酸31-243，SEQ ID NO18的核苷酸31-242，SEQ ID NO19的核苷酸31-243，SEQ ID NO20的核苷酸31-241，SEQ ID NO21的核苷酸31-243，SEQ ID NO22的核苷酸31-243，SEQ ID NO243的核苷酸31-180，SEQ ID NO24的核苷酸31-240，SEQ ID NO25的核苷酸31-242，或SEQ ID NO26的核苷酸31-242；(b)谷絲核菌的ITS2，其中谷絲核菌的ITS2包括SEQ ID NO17的核苷酸397-630，SEQ ID NO18的核苷酸396-629，SEQ ID NO19的核苷酸397-630，SEQ ID NO20的核苷酸395-628，SEQ ID NO21的核苷酸397-630，SEQ ID NO22的核苷酸397-630，SEQ ID NO23的核苷酸397-630，SEQ ID NO24的核苷酸394-627，SEQ ID NO25的核苷酸396-629，或SEQ ID NO26的核苷酸396-629。
2.一種在基于擴增的真菌內部轉錄間隔區(qū)DNA序列的檢測中可使用的寡核苷酸引物，其中所述引物與權利要求1的內部轉錄間隔區(qū)序列的至少10個連續(xù)核苷酸序列相同。
3.一對在基于擴增的真菌內部轉錄間隔區(qū)DNA序列的檢測中可使用的寡核苷酸引物，其中至少所述引物之一是權利要求2的寡核苷酸引物。
4.一種選自SEQ ID NO7-16的寡核苷酸引物。
5.一對寡核苷酸引物，其中至少所述引物之一是權利要求4的寡核苷酸引物。
6.根據(jù)權利要求5所述的一對寡核苷酸引物，其中所述引物對選自下列引物對SEQ ID NO12和SEQ ID NO9，SEQ ID NO1和SEQ ID NO10，SEQ ID NO1和SEQ ID NO9，SEQ ID NO1和SEQ ID NO14，SEQ ID NO12和SEQ ID NO4，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9，SEQ ID NO15和SEQ ID NO9，SEQ ID NO16和SEQ ID NO9，SEQ ID NO15和SEQ ID NO4，SEQ ID NO16和SEQ ID NO4，SEQ ID NO15和SEQ ID NO10，和SEQ ID NO16和SEQ ID NO10
7.根據(jù)權利要求6所述的一對寡核苷酸引物，其中所述引物對是SEQ ID NO12和SEQ ID NO9。
8.一種檢測真菌病原體的方法，包括步驟(a)從感染病原體的植物葉片中分離DNA；(b)用所述DNA進行聚合酶鏈式反應擴增，其中使用根據(jù)權利要求2所述的至少一種引物；和(c)通過顯示所述聚合酶鏈式反應擴增的產(chǎn)物來檢測所述真菌病原體。
9.權利要求8的方法，其中所述真菌病原體是谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)。
10.一種檢測真菌病原體的方法，包括步驟(a)從感染病原體的植物葉片中分離DNA；(b)以所述DNA為模板，使用根據(jù)權利要求3所述的一對引物，進行聚合酶鏈式反應，擴增所述病原體的內部轉錄間隔區(qū)序列的一部分；(c)通過顯示該內部轉錄間隔區(qū)序列的已擴增部分來檢測所述真菌病原體。
11.權利要求10的方法，其中所述真菌病原體是谷絲核菌。
12.一種檢測谷絲核菌的方法，包括步驟(a)從感染谷絲核菌的植物葉片中分離DNA；(b)以所述DNA為模板，使用根據(jù)權利要求6所述的一對引物，進行聚合酶鏈式反應，擴增谷絲核菌的內部轉錄間隔區(qū)序列的一部分；和(c)通過顯示該內部轉錄間隔區(qū)序列的已擴增部分來檢測谷絲核菌。
13.權利要求12的方法，其中所述引物對是SEQ ID NO12與SEQID NO9。
14.一種用于檢測真菌病原體的診斷試劑盒，其包括權利要求2的引物。
15.一種用于檢測真菌病原體的診斷試劑盒，其包括權利要求3的引物對。
全文摘要
描述了小麥真菌病原體谷絲核菌的不同菌株的核糖體RNA基因區(qū)域內部轉錄間隔區(qū)(ITS)DNA序列。證實來自這些序列的特異引物在基于PCR的技術鑒定谷絲核菌中是有用的。
文檔編號C12N15/31GK1395621SQ01803602
公開日2003年2月5日 申請日期2001年1月9日 優(yōu)先權日2000年1月11日
發(fā)明者J·J·貝克, C·J·巴奈特 申請人:辛根塔參與股份公司