專利名稱：改進(jìn)的發(fā)酵方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的發(fā)酵培養(yǎng)基和使用所述培養(yǎng)基制備脂肪族聚羧酸的方法。
長(zhǎng)鏈α、ω-二羧酸類(即那些帶有9個(gè)或9個(gè)以上碳原子的二羧酸類)被用作合成各種化學(xué)產(chǎn)物和聚合物中的原料。
目前在大多數(shù)情況下僅通過(guò)非生物轉(zhuǎn)化方法來(lái)生產(chǎn)帶有4個(gè)以上碳原子的二酸類。這些類型的用于生產(chǎn)二酸類的化學(xué)方法具有許多局限性和缺點(diǎn)。每種方法基于所用原料而限于生產(chǎn)特定碳鏈長(zhǎng)度的二酸類。例如，十二烷二酸(dodecandioic acid)法以丁二烯作為原料，由此該反應(yīng)過(guò)程的產(chǎn)物限于具有4的倍數(shù)的鏈長(zhǎng)的酸類。此外，該方法基于不可再生的石化原料且多重反應(yīng)轉(zhuǎn)化過(guò)程產(chǎn)生了不需要的副產(chǎn)物，它們可導(dǎo)致產(chǎn)量損耗、產(chǎn)生重金屬?gòu)U物和必須在還原爐中破壞的氧化氮。
用于生產(chǎn)二酸類的生物轉(zhuǎn)化方法比現(xiàn)存的非生物轉(zhuǎn)化方法有許多潛在的優(yōu)點(diǎn)。在這些優(yōu)點(diǎn)中最主要的特征是可再生的原料作為起始物質(zhì)的應(yīng)用和產(chǎn)生所述二酸而不會(huì)形成必須以昂貴方式進(jìn)行廢物處理加工的有害化學(xué)副產(chǎn)物。
通過(guò)使用生物方法獲得的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)在于可以易于將這類方法用于使用相同生物催化劑和相同設(shè)備生產(chǎn)各種二酸類。因?yàn)槟壳暗挠袡C(jī)化學(xué)合成法僅適合于生產(chǎn)單一二酸，所以幾種不同二酸的合成需要開(kāi)發(fā)針對(duì)每種二酸的新合成流程。另一方面，可以將酵母生物催化劑用于使用相同設(shè)備、培養(yǎng)基和僅通過(guò)為所述酵母提供不同底物的方案而生產(chǎn)不同長(zhǎng)度的二酸類。
美國(guó)專利US6,004,784中公開(kāi)了一種半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，它使用了玉米漿和釀造酵母提取物以便降低含有昂貴、高標(biāo)準(zhǔn)化酵母提取物和酵母氮堿的常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基的成本，將該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
與使用這類低廉替代品有關(guān)的困難是成倍的。在噴入空氣時(shí)它們使得發(fā)酵肉湯散發(fā)出明顯的氣味。在玉米漿和粗酵母提取物中含有的顆粒物質(zhì)、尤其是結(jié)合了高濃度細(xì)菌的顆粒物質(zhì)難以使得它們自身保持無(wú)菌并使培養(yǎng)基滅菌設(shè)備染菌。這些替代品還含有許多不可代謝的可產(chǎn)生顏色和顏色穩(wěn)定性困難的成分，這些困難 需要使用其它純化步驟來(lái)解決并且固然會(huì)使產(chǎn)物損耗。對(duì)這些替代品進(jìn)行選擇、同時(shí)降低培養(yǎng)基成本的考慮反而又增加了加工成本。因此，對(duì)可為維持酵母生物催化劑生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物的低成本生物發(fā)酵培養(yǎng)基，從而得到高特定產(chǎn)率的聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類存在需求。
盡管長(zhǎng)鏈二羧酸類以其未離解或部分鹽形式具有有限的水溶性，但是存在許多必須在含水培養(yǎng)基中處理它們的情況。實(shí)例包括用于生產(chǎn)二羧酸類的發(fā)酵和回收方法、界面聚合反應(yīng)、乳液聚合反應(yīng)和酶促反應(yīng)。
處理二羧酸類的含水混懸液易具有高度粘性且因此難以處理。用于制備二羧酸類的發(fā)酵反應(yīng)中的主要操作問(wèn)題包括氧的轉(zhuǎn)運(yùn)、熱轉(zhuǎn)移、發(fā)酵肉湯中氣體的維持和各自受到該肉湯流變學(xué)特性影響的存在氣體(發(fā)泡)中肉湯的維持。同樣，在用于從發(fā)酵肉湯中回收二羧酸類的過(guò)濾方法中，高粘度可導(dǎo)致不實(shí)際的濾過(guò)率。在聚合反應(yīng)和酶反應(yīng)中，粘度對(duì)質(zhì)量轉(zhuǎn)運(yùn)的影響因需要具有快速、可預(yù)測(cè)接觸的試劑而可能成為主要問(wèn)題。
在DE 29 09 420 A1中，Watanabe等描述了一種在不含細(xì)胞的發(fā)酵肉湯中處理長(zhǎng)鏈二羧酸類混懸液的方法以便改善濾過(guò)率和回收的二酸類的純度。他證實(shí)他可以通過(guò)在pH4或pH4以下將含水二羧酸混懸液加熱至50℃以上1小時(shí)或1小時(shí)以上而控制顆粒大小分布和顆粒形態(tài)。他描述了他可以通過(guò)使所述顆粒生長(zhǎng)至40-50μm的平均顆粒大小而獲得改善的濾過(guò)率、使濾餅水分降低而濾餅中二羧酸的純度較高。令人遺憾的是，這種方法對(duì)在遇到長(zhǎng)鏈二羧酸類含水混懸液的許多應(yīng)用而言應(yīng)用有限。
許多發(fā)酵和酶反應(yīng)在較寬pH范圍和低于50℃下發(fā)生。在許多情況中，在Watanabe等所述的條件下酶和微生物的活性可能降低或受到破壞。涉及二羧酸含水混懸液的界面和乳液聚合反應(yīng)可能僅限于熱穩(wěn)定性試劑。因此，對(duì)控制長(zhǎng)鏈二羧酸類含水混懸液的流變學(xué)特性的供替代方法存在需求。
發(fā)明概括本發(fā)明在一個(gè)方面中涉及一種發(fā)酵培養(yǎng)基和使用所述培養(yǎng)基制備聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類的方法。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有(a)可代謝的碳源和能源；(b)無(wú)機(jī)氮源；(c)磷酸鹽源；(d)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過(guò)渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(e)基本上不含顆粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源。
本發(fā)明還涉及一種聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類的制備方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種能夠產(chǎn)生聚羧酸、多元醇和聚羥基酸的有機(jī)體；(b)提供一種能夠通過(guò)該有機(jī)體轉(zhuǎn)化成聚羧酸、多元醇和聚羥基酸的底物；(c)提供一種含有下列組成的發(fā)酵培養(yǎng)基(i)可代謝的碳源和能源；(ii)無(wú)機(jī)氮源；(iii)磷酸鹽源；(iv)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過(guò)渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(v)基本上不含顆粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源；以及(d)使該有機(jī)體在所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。
本發(fā)明還涉及一種含有至少一種二羧酸的含水混懸液，它還包括水和導(dǎo)致有效形成基本上盤形、基本上部分球形或基本上球形二羧酸顆粒的用量的脂肪物質(zhì)。
本發(fā)明還涉及一種用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，該方法包括下列步驟向所述混懸液中添加使二羧酸顆粒有效成形的用量的脂肪物質(zhì)以便使具備某種形狀的二羧酸顆粒形成，其中所述的形狀選自基本上盤形、基本上部分球形或基本上球形組成的組。
發(fā)明詳述將表示組分用量和/或反應(yīng)條件的所有數(shù)字理解為在所有情況中可改變的術(shù)語(yǔ)″約″。
本發(fā)明通過(guò)正確選擇維持微生物生長(zhǎng)的可替代營(yíng)養(yǎng)物而提供了一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可以使得使用生物轉(zhuǎn)化方法以商業(yè)化方式生產(chǎn)大量重要的多功能物質(zhì)成為可能。本發(fā)明提供了現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基的低成本替代品及其易于制備和滅菌的使用方法、具有程度較低的氣味、為隨后的下游工藝提供了較低的雜質(zhì)負(fù)載分布、也使得產(chǎn)品的產(chǎn)量至少與現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法獲得的產(chǎn)量同樣高。令人意外的是玉米漿和酵母提取物中包含的無(wú)數(shù)不確定的成分可以被相對(duì)極少的成分所代替而不會(huì)損害微生物的生長(zhǎng)質(zhì)量和多功能化合物的產(chǎn)率。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種能夠有利于不同類型有機(jī)底物生物轉(zhuǎn)化的經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵培養(yǎng)基。該發(fā)酵培養(yǎng)基含有下列必不可少的成分(i)可代謝的碳源和能源；(ii)無(wú)機(jī)氮源；(iii)磷酸鹽源；(iv)至少一種選自堿金屬、堿土金屬及其混合物組成的組的金屬；和(v)基本上不含顆粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源。這些物質(zhì)可以單獨(dú)滿足微生物生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)需求、還可以產(chǎn)生足以進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化用量和質(zhì)量的生物質(zhì)。
可代謝的碳源和能源的合適來(lái)源包括但不限于葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘油、乙酸鈉、甲醇、短鏈醇類及其混合物。可代謝的碳源和能源的優(yōu)選來(lái)源是葡萄糖、優(yōu)選液體葡萄糖糖漿、例如95％葡萄糖當(dāng)量糖漿乃至95％以下葡萄糖當(dāng)量糖漿。這類物質(zhì)含有少量的二糖類、三糖類和可以在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)添加諸如淀粉酶、葡糖淀粉酶和纖維素酶這樣的淀粉酶而水解的多糖類。因此，可以在與生物氧化同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)中在原位提供葡萄糖。
無(wú)機(jī)氮源包括但不限于諸如硝酸鈉或硝酸鉀這樣的堿金屬硝酸鹽；諸如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和乙酸銨這樣的銨鹽。優(yōu)選的無(wú)機(jī)氮源是氨或氫氧化銨。
本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中另一種必不可少的成分是包括含磷酸鹽的任意化合物在內(nèi)的磷酸鹽源。其實(shí)例包括但不限于磷酸鉀、磷酸鈉和磷酸銨。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的磷酸鹽源是磷酸鉀。
用于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的合適的金屬包括堿金屬、堿土金屬、過(guò)渡金屬及其混合物。特別優(yōu)選的金屬包括組合形式的鉀、鈣和鎂。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基中最關(guān)鍵的成分是基本上不含顆粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素。
所述培養(yǎng)基成分中的任意一種可以作為部分原始無(wú)菌培養(yǎng)基進(jìn)料、作為隨后向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的濃縮水溶液進(jìn)行滅菌或可以大量過(guò)量地包含在發(fā)酵罐接種物中以便于將其攜帶入生產(chǎn)發(fā)酵罐。
為了避免與散發(fā)氣味、顏色不穩(wěn)定性和污染相關(guān)的問(wèn)題，必需使生物素不含可使這類問(wèn)題加重并需要其它工藝純化步驟的顆粒物質(zhì)和細(xì)菌。所需生物素的量低于它替代現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基在水溶液中含有(a)約10g/l-約60g/l、優(yōu)選約20g/l-約40g/l的可代謝的碳源和能源、優(yōu)選葡萄糖；(b)約50ppm-約2000ppm、優(yōu)選約50ppm-約250ppm且最優(yōu)選約100ppm-約250ppm的由包含的無(wú)機(jī)氮源提供的氮；(c)約1g/l-約10g/l、優(yōu)選約1g/l-約7g/l的磷酸鹽源、優(yōu)選磷酸鉀；(d)約0.01g/l-約2g/l、優(yōu)選約0.01g/l-約1g/l的至少一種選自堿金屬、堿土金屬及其混合物組成的組的金屬、優(yōu)選鈣與鎂的混合物；和(e)約1μg/l-約2000μg/l、優(yōu)選約4μg/l-約200μg/l且最優(yōu)選約4μg/l-約20μg/l的生物素，其中該生物素基本上不含有害的顆粒物質(zhì)和細(xì)菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基中含有的水可以是通過(guò)蒸餾、去離子化或軟化而純化的生產(chǎn)用水。優(yōu)選的水源包括那些來(lái)自城市水分布系統(tǒng)、生產(chǎn)用再循環(huán)水流的水或因這些水源中已經(jīng)含有的礦物而需要考慮調(diào)節(jié)礦物含量的井水。例如，水與其它所需組分中可能已經(jīng)含有足以為有機(jī)體生長(zhǎng)提供全部或基本上全部所需礦物的礦物成分。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基滿足了微生物生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)物需求，同時(shí)將需要因作為廢物處理和產(chǎn)生工藝氣味散發(fā)而需要從產(chǎn)物中分離的有機(jī)和無(wú)機(jī)成分的添加量減少到最低限度。與本領(lǐng)域中公知的發(fā)酵培養(yǎng)基組成相反，本發(fā)明的培養(yǎng)基不含顆粒物質(zhì)、特別適合于在自動(dòng)培養(yǎng)基制備工藝中的連續(xù)滅菌且非常低廉。盡管本發(fā)明提供了營(yíng)養(yǎng)程度極低的培養(yǎng)基組成，但是在配制培養(yǎng)基方面存在很大的靈活性，同時(shí)可獲得高產(chǎn)率的聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類。
在本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中還可以使用不同類型的輔助成分以便進(jìn)一步加速生物發(fā)酵過(guò)程。其實(shí)例包括但不限于不同類型的微量金屬、螯合劑、消泡劑等。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中可以使用任意的產(chǎn)聚羧酸、產(chǎn)多元醇和產(chǎn)聚羥基酸的酵母和各種底物。例如，在所需產(chǎn)物是諸如二酸這樣的聚羧酸的情況中，可以使用任意類型的脂肪酸、脂肪酸酯或烷烴底物。用于生產(chǎn)二酸類的合適底物的實(shí)例包括但不限于月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、棕櫚油酸及其甲酯及其混合物。烷烴的實(shí)例包括十二烷、十二碳烯、十三烷、十四烷、十八烷等。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種聚羧酸、多元醇和聚羥基酸的制備方法。僅為了舉例目的，以制備所需終產(chǎn)物聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類為基礎(chǔ)描述本發(fā)明的方法。
可以在微生物可以生長(zhǎng)和催化所需轉(zhuǎn)化反應(yīng)的任意pH范圍內(nèi)實(shí)施該方法。優(yōu)選且特別有利的pH范圍是在酸性環(huán)境中，即pH約為7或7以下。盡管可以將低pH改善用于任意發(fā)酵方法，但是當(dāng)將它用于生產(chǎn)聚羧酸類的發(fā)酵方法時(shí)特別有利。合適的pH調(diào)控試劑是氨水、氫氧化銨溶液、濃氫氧化鉀或氫氧化鈉。
有機(jī)底物可以是可生物氧化成一-或聚羧酸的任意有機(jī)化合物。這類化合物可以是飽和或不飽和的脂肪族化合物或帶有至少一個(gè)末端甲基、末端羧基和/或通過(guò)生物氧化而氧化成羧基的末端官能基的任意羧酸或雜環(huán)芳香化合物。屬于羧基衍生物的末端官能基可以存在于底物分子上且可以通過(guò)非生物氧化的反應(yīng)而被轉(zhuǎn)化成羧基。例如，在發(fā)酵步驟中可以添加例如脂酶以便從其它不可代謝的酯中釋放游離脂肪酸。
烷烴類是用于實(shí)施本發(fā)明方法的飽和有機(jī)底物的類型。烷烴類可以是線性或環(huán)狀、支鏈或直鏈、取代或不被取代的。特別優(yōu)選的烷烴類是那些帶有約4-約25個(gè)碳原子的烷烴，它們的實(shí)例包括但不限于丁烷、己烷、辛烷、壬烷、十二烷、十三烷、十四烷、十八烷等。
可以用于本發(fā)明方法的不飽和有機(jī)底物的實(shí)例包括但不限于內(nèi)烯烴類，諸如2-戊烯、2-己烯、3-己烯、9-十八烯等；不飽和羧酸類，諸如包括具有相對(duì)高油酸含量的甘油三酯類在內(nèi)的2-己烯酸及其酯類、包括具有相對(duì)高芥酸含量的甘油三酯類在內(nèi)的芥酸及其酯類、包括具有相對(duì)高蓖麻油酸含量的甘油三酯類在內(nèi)的蓖麻油酸及其酯類、包括具有相對(duì)高油酸含量的甘油三酯類在內(nèi)的亞油酸及其酯類；不飽和醇類，諸如3-己烯-1-醇、9-十八烯-1-醇等；不飽和醛類，諸如3-己烯-1-醛、9-十八烯-1-醛等。除上述物質(zhì)外，可以用于本發(fā)明方法的有機(jī)底物還包括帶有至少一個(gè)內(nèi)部碳-碳雙鍵和至少一個(gè)末端甲基、末端羧基和/或通過(guò)生物氧化而氧化成羧基的末端官能基的脂環(huán)族化合物。這類化合物的實(shí)例包括但不限于3，6-二甲基-1， 4-環(huán)己二烯、3-甲基環(huán)己烯、3-甲基-1，4-環(huán)己二烯等。
可以用于本發(fā)明方法的芳香化合物的實(shí)例包括但不限于芳烴類，諸如鄰-二甲苯、間-二甲苯、對(duì)-二甲苯；鄰甲基-苯甲酸、間-甲基苯甲酸、對(duì)-甲基苯甲酸；二甲基吡啶等。有機(jī)底物還可以含有可生物氧化成羧基的其它官能基、諸如醛基或醇基。有機(jī)底物還可以含有不會(huì)生物氧化成羧基且不會(huì)干擾生物氧化的其它官能基，諸如鹵素、醚類。
當(dāng)培養(yǎng)物主動(dòng)將底物氧化成產(chǎn)物時(shí)，可以在發(fā)酵階段過(guò)程中給該培養(yǎng)物提供共底物。這種情況特別正確，即如果不能從底物反應(yīng)自身中回收純粹可利用的碳或能量，那么這種碳和能量由所述的共底物提供。
共底物是一種可發(fā)酵的諸如葡萄糖、果糖或麥芽糖這樣的碳水化合物或例如甘油、乙酸鈉、甲醇或短鏈醇類這樣可發(fā)酵的其它有機(jī)化合物或其混合物。優(yōu)選的共底物是葡萄糖、優(yōu)選液體葡萄糖糖漿、例如95％葡萄糖當(dāng)量糖漿乃至95％以下葡萄糖當(dāng)量糖漿。這類物質(zhì)含有少量的二糖類、三糖類和可以在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)添加諸如淀粉酶、葡糖淀粉酶和纖維素酶這樣的淀粉酶而水解的多糖類。因此，可以在與生物氧化同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)中在原位提供葡萄糖。
如果用于使生物質(zhì)生長(zhǎng)的碳源和能源與用于啟動(dòng)氧化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的共底物相同，那么是便利的、但并非絕對(duì)必要。實(shí)際益處在于需要處理較少的原料且可以充分整合不同的發(fā)酵階段。因此，可以將單一共底物滅菌和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)運(yùn)碳源和能源以便使啟動(dòng)氧化反應(yīng)的生物質(zhì)和共底物生長(zhǎng)。
可以用于本發(fā)明方法的微生物是能夠使本文所定義的底物生物氧化的任意微生物。微生物可以是任意的微生物，其中通過(guò)使一種或多種酰基輔酶A氧化酶基因受到破壞、失活或缺失而部分或完全阻斷β氧化；任意的酵母，其中使一種或多種酰基輔酶A氧化酶基因受到失活或缺失而部分或完全中斷β氧化；任意的假絲酵母屬菌株，其中使一種或多種酰基輔酶A氧化酶基因受到失活或缺失而部分或完全中斷β氧化反應(yīng)。當(dāng)發(fā)酵方法包括使底物生物氧化成羧酸時(shí)，所述的微生物通常是酵母。這類微生物能夠以形成的一-和/或二羧酸類不會(huì)進(jìn)一步被導(dǎo)致鏈縮短的降解所氧化的方式使底物氧化。然而，本發(fā)明的方法涉及任意微生物的應(yīng)用。
當(dāng)在作為碳源的烷烴或脂肪酸上培養(yǎng)時(shí)，已知分泌α、ω-二羧酸類作為副產(chǎn)物的酵母菌株是美國(guó)專利US5,254,466中所列的酵母菌株，將該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。這些菌株是部分或完全氧化阻斷的菌株；即將它們進(jìn)行遺傳修飾，使得染色體POX4A、POX4B和兩種POX5基因受到破壞。在該菌株上的底物流重新定向于ω-氧化途徑作為通過(guò)POX基因破壞而使競(jìng)爭(zhēng)性B-氧化途徑發(fā)生功能性失活的結(jié)果。完全氧化阻斷的菌株是熱帶假絲酵母菌株，即美國(guó)專利US5,254,466中所述的菌株H5343(ATCC20962)。
另一種合適的菌株是這樣一種菌株，其中一種或多種還原酶基因被擴(kuò)增、從而導(dǎo)致限速ω-羥化酶用量通過(guò)P450基因擴(kuò)增而增加且底物流比例通過(guò)ω-氧化途徑而增加。選擇性增加已知對(duì)脂肪酸氧化重要的酶的量的菌株也是優(yōu)選的。這類菌株含有增加的CYP和CPR基因拷貝。已經(jīng)將這些基因鑒定為那些與催化氧化途徑中第一個(gè)步驟的ω-羥化酶復(fù)合物產(chǎn)生相關(guān)的基因。菌株HDC1是含有整合入菌株H5343基因組的CYP52A2A基因的多拷貝。該菌株和類似菌株描述在05/01/98提交的未審申請(qǐng)順序號(hào)60/083,798中，將該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。可以在本發(fā)明方法中使用的其它菌株是如PCT/US99/20797中所述的熱帶假絲酵母菌株HDC1、HDC5、HDC10、HDC15、HDC20、HDC23、HDC23-1、HDC23-2和HDC23-3，將該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
無(wú)機(jī)氮的合適來(lái)源包括任意的含銨的化合物。其實(shí)例包括但不限于堿金屬硝酸鹽或諸如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和乙酸銨這樣的銨鹽。優(yōu)選的氮源是銨鹽或通過(guò)有機(jī)體的代謝作用產(chǎn)生氨的化合物、諸如脲。特別優(yōu)選的用于本發(fā)明的無(wú)機(jī)氮源是氨。
通過(guò)使用甘油三酯脂肪或油作為有機(jī)底物和共底物的來(lái)源可以改變發(fā)酵方法。使用發(fā)酵肉湯配制的脂酶將所述的脂肪或油水解或裂解成脂肪酸和甘油。有機(jī)體消耗甘油用于促使裂解反應(yīng)至完全，同時(shí)提供將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的二元酸類所必不可少的能量。屬于油特異性的脂酶是特別優(yōu)選的。油特異性脂酶對(duì)具有高油酸含量的甘油三酯表現(xiàn)出高選擇性并選擇性地催化油酸酯部分的水解。這類油特異性脂酶的實(shí)例包括但不限于由假單胞菌屬的種類、腐質(zhì)霉屬(Humicolalanuginosa)、皺摺假絲酵母、白地霉和假單胞菌屬(Burkholderia)產(chǎn)生的脂酶。特別優(yōu)選的脂酶是來(lái)自美國(guó)專利US5,470,741中所述白地霉ATCC No.74170的UNLipase，將該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
發(fā)酵步驟優(yōu)選按照生長(zhǎng)階段、誘導(dǎo)階段和轉(zhuǎn)化階段這三個(gè)階段進(jìn)行。可以在溫度、pH、通風(fēng)等相同或不同的發(fā)酵罐條件下進(jìn)行每個(gè)階段。當(dāng)將細(xì)胞培養(yǎng)物導(dǎo)入發(fā)酵罐時(shí)生長(zhǎng)階段開(kāi)始且快速生長(zhǎng)階段隨后發(fā)生。生長(zhǎng)隨所用培養(yǎng)基組成的不同而可以成指數(shù)狀態(tài)或亞指數(shù)狀態(tài)。這種過(guò)程持續(xù)至培養(yǎng)物達(dá)到通過(guò)耗氧減少而測(cè)定的線性生長(zhǎng)為止。當(dāng)生長(zhǎng)受到向培養(yǎng)基添加關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物的速率的限制時(shí)，發(fā)生線性生長(zhǎng)；由此生長(zhǎng)與提供有限營(yíng)養(yǎng)物的速率成正比。在本發(fā)明的方法中，所述的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物通常是共底物。第二個(gè)階段是誘導(dǎo)階段。在誘導(dǎo)階段中，開(kāi)始將所需底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的關(guān)鍵代謝活性被啟動(dòng)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)物前可以將該培養(yǎng)物在線性生長(zhǎng)階段維持一定的時(shí)間期限。誘導(dǎo)劑通常是底物本身，但就不會(huì)啟動(dòng)其自身轉(zhuǎn)化的化合物而言，可以將另一種誘導(dǎo)劑與底物同步使用。可以將誘導(dǎo)階段用于使快速生長(zhǎng)階段過(guò)渡到轉(zhuǎn)化階段。當(dāng)將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物時(shí)，發(fā)酵過(guò)程進(jìn)入下一階段、即轉(zhuǎn)化階段。
在轉(zhuǎn)化階段中，發(fā)酵肉湯處于2-7的酸性pH范圍內(nèi)。優(yōu)選的操作pH范圍約為3.5-7.0、甚者更優(yōu)選約5.0-約6.5的范圍。可以通過(guò)使用強(qiáng)堿自動(dòng)滴定來(lái)控制pH，所述強(qiáng)堿的實(shí)例是氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、氫氧化銨溶液或氨氣。注意通過(guò)在該pH環(huán)境下進(jìn)行發(fā)酵與可以將氨用于pH控制的現(xiàn)有技術(shù)的方法相比較，這是由于氨反應(yīng)形成不揮發(fā)性含水銨離子。在堿性pH環(huán)境下操作時(shí)，制備二羧酸的現(xiàn)有技術(shù)的方法不會(huì)有效地形成含水銨離子，由此導(dǎo)致肉湯中累積的廢氣和毒性氨中揮發(fā)出不需要的氨蒸汽。發(fā)酵可以在約26℃-約40℃的溫度下進(jìn)行。
在第一個(gè)階段中，給培養(yǎng)基接種諸如熱帶假絲酵母菌株這樣β-氧化阻斷的微生物活性培養(yǎng)物，其中發(fā)生快速指數(shù)生長(zhǎng)期。通過(guò)添加堿來(lái)控制培養(yǎng)基的pH，所述堿的實(shí)例包括但不限于氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉或氨氣。向發(fā)酵罐中添加的共底物優(yōu)選是轉(zhuǎn)化階段中的補(bǔ)料分批添加。指數(shù)生長(zhǎng)階段的終點(diǎn)以葡萄糖耗盡、溶解的氧快速增加和最敏感的是廢氣中氧快速增加和廢氣中CO2減少為標(biāo)志。在沒(méi)有誘導(dǎo)底物存在的情況下，生物質(zhì)以與葡萄糖進(jìn)料速率成正比的速率持續(xù)累積(即線性生長(zhǎng))。需要在指數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束或當(dāng)達(dá)到所需生物質(zhì)水平時(shí)啟動(dòng)轉(zhuǎn)化階段。如果生產(chǎn)容器中氧轉(zhuǎn)運(yùn)特征使得可能不能通過(guò)以指數(shù)生長(zhǎng)方式維持培養(yǎng)物而達(dá)到所需生物質(zhì)的水平，那么可以將指數(shù)生長(zhǎng)、隨后是線性葡萄糖受限生長(zhǎng)階段(誘導(dǎo)階段)以組合方式用于獲得給定的生物質(zhì)水平。
為了在過(guò)渡到葡萄糖受限線性生長(zhǎng)過(guò)程中維持健康狀態(tài)的培養(yǎng)物，需要在生長(zhǎng)過(guò)程中開(kāi)始葡萄糖進(jìn)料，使得在培養(yǎng)物中始終可利用葡萄糖。以使生長(zhǎng)過(guò)程中投入的微生物用量較少所需的總葡萄糖為基準(zhǔn)來(lái)選擇最初培養(yǎng)基進(jìn)料中的葡萄糖濃度。可以從生長(zhǎng)開(kāi)始時(shí)的任意時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始葡萄糖進(jìn)料。然而，因?yàn)樵诮o生產(chǎn)容器接種后在接種液質(zhì)量和延遲期方面存在一定的可變性，所以優(yōu)選在指數(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中以通過(guò)直接生物質(zhì)測(cè)定值或類似于光密度、二氧化碳放出率或氧攝取率的間接方法判定的某些預(yù)定生物質(zhì)濃度開(kāi)始葡萄糖進(jìn)料。葡萄糖可以是精制或未精制的玉米漿。可以將葡萄糖從容器上部經(jīng)過(guò)蒸汽空間作為連續(xù)蒸汽或作為連續(xù)系列脈沖或沖擊方式進(jìn)料。還可以使葡萄糖進(jìn)入容器表面下、尤其是進(jìn)入接近攪拌器的高剪切區(qū)以便使進(jìn)料在整個(gè)容器中快速分布。在大容器中，在相同容器內(nèi)可以存在多個(gè)葡萄糖進(jìn)料點(diǎn)。
氧化底物的轉(zhuǎn)化階段通過(guò)添加誘導(dǎo)劑和含有可氧化甲基的底物而啟動(dòng)。就烷烴而言是脂肪酸、脂肪酸甲酯和脂肪酸鹽；這些物質(zhì)及其組合誘導(dǎo)其自身氧化成二羧酸類且可以用于誘導(dǎo)其它物質(zhì)的氧化。可以分批或作為連續(xù)進(jìn)料或作為系列連續(xù)脈沖或沖擊方式進(jìn)料來(lái)添加底物。可以從容器上部經(jīng)蒸汽空間添加底物或?qū)⒌孜锛尤氲饺萜鞅砻嫦隆⒂绕涫鞘蛊溥M(jìn)入高剪切區(qū)。在大容器中，可以存在多個(gè)底物進(jìn)料點(diǎn)。氧化在低于7的酸性pH下進(jìn)行且優(yōu)選在接近或低于通過(guò)氧化形成的羧基的pKa下進(jìn)行或存在于底物中。
當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)行至防止生物質(zhì)和三酰基甘油酯類累積時(shí)，優(yōu)選逐步降低對(duì)發(fā)酵罐的葡萄糖進(jìn)料比例。由于轉(zhuǎn)化了商品油酸，所以胞內(nèi)儲(chǔ)存液泡的累積是需要調(diào)整的葡萄糖進(jìn)料比例的有用的指標(biāo)。通過(guò)在轉(zhuǎn)化階段每24小時(shí)將進(jìn)料比例減少約5％-25％且通常約為10％來(lái)進(jìn)行調(diào)整。還可以使用其它指標(biāo)，諸如堿的利用率、CO2放出率或呼吸商。
發(fā)酵過(guò)程中通常遇到的一個(gè)難題是形成羧酸皂和作為在傳統(tǒng)堿性pH范圍內(nèi)操作結(jié)果的發(fā)泡。在堿性環(huán)境中，羧酸形成導(dǎo)致發(fā)酵肉湯中不需要的發(fā)泡的皂。形成皂的結(jié)果是通過(guò)向肉湯中添加諸如強(qiáng)堿這樣的堿以將該肉湯的pH維持在所需值下而調(diào)節(jié)的肉湯pH降低。此外，向堿性環(huán)境中添加葡萄糖這一步驟導(dǎo)致形成影響發(fā)酵肉湯pH的碳酸鹽。為了補(bǔ)償對(duì)皂pH和碳酸鹽形成的影響，必須加入大量堿以便維持所需水平的肉湯pH。
已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)通過(guò)在2-7、優(yōu)選3-7且甚至更優(yōu)選5-6.5的酸性pH范圍而非強(qiáng)堿pH范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程，發(fā)泡現(xiàn)象基本上得到減少且由在葡萄糖代謝過(guò)程中產(chǎn)生的二氧化碳形成碳酸鹽的反應(yīng)減少，由此基本上減少了控制發(fā)酵肉湯pH所需原料的用量。通過(guò)在酸性pH下進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程，這些問(wèn)題基本上得到減少，從而使發(fā)酵過(guò)程中所用的堿的用量降低。在導(dǎo)致培養(yǎng)基pH下降的生長(zhǎng)反應(yīng)過(guò)程中對(duì)存在的陽(yáng)離子當(dāng)量的凈消耗超過(guò)陰離子當(dāng)量。需要在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)在控制pH時(shí)添加堿而將該培養(yǎng)基的pH控制在2-7且優(yōu)選約3-6.5的范圍。在這些用于該目的的堿中有氫氧化銨、氨、氫氧化鈉和氫氧化鉀。需要選擇可提供在生長(zhǎng)過(guò)程中消耗的一種或多種主要營(yíng)養(yǎng)物的諸如氫氧化銨、氨、氫氧化鈉或氫氧化鉀這樣的堿的組合物。對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基制品的調(diào)節(jié)要考慮到添加pH控制試劑。使用控制pH的NH4OH或氨氣減少了通過(guò)將pH控制試劑與氮源合并成添加到發(fā)酵罐中的一種原料而使微生物生長(zhǎng)所需的原料數(shù)量。
就使用諸如氨或氫氧化銨這樣的氮源而言，在培養(yǎng)基中必須僅含有250ppm或250ppm以下的氮源以便啟動(dòng)生長(zhǎng)和消耗這些pH控制試劑。氨的濃度由此在培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)程中幾乎保持恒定。因此，可以通過(guò)向最初培養(yǎng)基裝料中添加氨或銨鹽而方便地預(yù)選誘導(dǎo)時(shí)培養(yǎng)基中氨的所需濃度。用于最初發(fā)酵罐裝料的氨型氮的有用來(lái)源包括磷酸氨(ammoniaphosphate)、硫酸銨、硝酸銨、氨、脲和氫氧化銨。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于繁殖熱帶假絲酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基制品且獲得了將帶有可氧化甲基的底物轉(zhuǎn)化成羧酸的高產(chǎn)率。通過(guò)調(diào)節(jié)進(jìn)入發(fā)酵肉湯中物質(zhì)的進(jìn)料速率可以控制微生物的生長(zhǎng)。微生物在葡萄糖上生長(zhǎng)過(guò)程中消耗的主要營(yíng)養(yǎng)物是氨型氮、鉀、鎂、磷酸鹽和硫酸鹽。并不消耗鈉和鈣，不過(guò)，隨接種培養(yǎng)基制品的不同，鈣應(yīng)以約5-50ppm或5-50ppm以上的濃度存在以便獲得正常生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基中還包括微量礦物和生物素。這種生物素可以是相對(duì)純的等級(jí)或作為諸如生物素酵母、酵母提取物或玉米漿形式這樣的較粗制的等級(jí)提供。
有用的磷酸鹽來(lái)源是磷酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸三鉀、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和磷酸三鈉以及磷酸。有用的鉀來(lái)源是硫酸鉀、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和苛性鉀。
可以將發(fā)酵助劑用于烷烴類的氧化和/或脂肪酸類的氧化。優(yōu)選的發(fā)酵助劑是脂肪酸酯，特別優(yōu)選的發(fā)酵助劑是甲酯。使用這類發(fā)酵控制試劑的一個(gè)主要益處在于控制泡沫和控制發(fā)酵肉湯的液體特性。如果產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)分布在最終產(chǎn)物的性能上是重要的，那么需要選擇與烷烴或脂肪酸相似的甲酯的鏈長(zhǎng)，這是因?yàn)檫€可以將所述甲酯轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。可以將這種酯分批加入或混入進(jìn)料。如果混入進(jìn)料，那么它在進(jìn)料中可以占到約10％或10％以下且優(yōu)選約1％或1％以下。某些商品脂肪酸天然含有一定的甲酯類且可以將它們直接用作二羧酸生產(chǎn)的底物。例如，EMERSOL267(Cognis Corporation)是一種含有約1％或1％以下甲酯類的商品油酸且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它在本發(fā)明中是一種良好的底物。典型的工業(yè)用油酸、即用于本方法的EMERSOL267具有下列近似組成0.3％C12、2.4％C14、0.6％C14∶1、4.7％C16、4.6％C16∶1、0.2％C17、0.8％C18、69.9％C18∶1、10.5％C18∶2、0.3％C18∶3。
就烷烴氧化成二羧酸類而言，已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有用的是使用脂肪酸或脂肪酸鹽作為發(fā)酵助劑。這種情況會(huì)使得所述烷烴在整個(gè)發(fā)酵肉湯中具有較好的分布。可以將脂肪酸分批加入或可以將其配制成烷烴進(jìn)料。如果配制成進(jìn)料，那么脂肪酸或脂肪酸鹽在所述進(jìn)料中一般可以占到約10％或10％以下且優(yōu)選約5％或5％以下。這里再次強(qiáng)調(diào)，如果產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)分布在最終產(chǎn)品性能上是重要的，那么需要選擇與烷烴相似的脂肪酸的鏈長(zhǎng)分布，這是因?yàn)檫€可以將所述脂肪酸轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。
已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)例如脂肪酸類和脂肪酯類這樣的脂肪物質(zhì)的特定組合在低于50℃的溫度下使長(zhǎng)鏈二羧酸類的精制含水混懸液形成高度精細(xì)的顆粒。還可以單獨(dú)或以組合方式使用包括脂肪醇類、脂肪醚類等在內(nèi)的其它脂肪物質(zhì)并將它們看作是本發(fā)明的組成部分。所得的混懸液具有理想的有利于其操作和實(shí)際應(yīng)用的剪切稀化特性。要求在所述混懸液中如此形成的顆粒具有很窄的大小分布內(nèi)的大小。本發(fā)明的該方面充分適合于在大規(guī)模生產(chǎn)設(shè)備中應(yīng)用。實(shí)際上，在這類設(shè)備中出現(xiàn)的性能優(yōu)于在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的設(shè)備中出現(xiàn)的性能。這一結(jié)果提示壁效應(yīng)可能在顆粒生長(zhǎng)過(guò)程中起作用。
有用的脂肪物質(zhì)包括C10-C20的飽和和不飽和脂肪酸類及其酯類，它們包括但不限于向日葵脂肪酸類、向日葵脂肪酸甲酯類、動(dòng)物脂肪酸類和動(dòng)物脂肪酸甲酯類。這些物質(zhì)的典型商品組合物的實(shí)例如表1中所示。
下面所列的每種組合物均商購(gòu)自Cognis Corp.，Cincinnati，OH。
在發(fā)酵肉湯中制備的二羧酸類一般作為1-10μm長(zhǎng)的針狀晶體存在。該二酸類的組成反映出所氧化底物的鏈長(zhǎng)。這類發(fā)酵肉湯可以高度粘化成固體點(diǎn)。當(dāng)將本文所述的脂肪物質(zhì)用于這類發(fā)酵時(shí)，它能夠在低于約50℃的溫度下在原位生長(zhǎng)成基本上盤形、基本上部分球形(例如杯形)和/或基本上球形的約15-40μm或15-40μm以上直徑和約1-5μm厚度的二羧酸顆粒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有約1cm直徑的基本上球形的顆粒。因此，關(guān)注的是按照本發(fā)明生產(chǎn)的二羧酸顆粒可以具有約1μm-約1cm或1cm以上范圍的直徑和/或厚度。當(dāng)將本文所述的脂肪物質(zhì)用于生產(chǎn)或含有二羧酸類的發(fā)酵時(shí)，所得肉湯具有低表觀粘度，使得可以在最佳條件下持續(xù)處理發(fā)酵肉湯。為方便起見(jiàn)，本文所用的術(shù)語(yǔ)″盤形″還可以指基本上部分球形的顆粒。本文所用的″基本上″指的是近似精確。
就產(chǎn)生二羧酸類的發(fā)酵反應(yīng)而言，使用這類脂肪物質(zhì)的有益之處在于也能夠?qū)⑦@些試劑添加劑轉(zhuǎn)化成二羧酸類。這一結(jié)果簡(jiǎn)化了從肉湯中回收二羧酸類的步驟，使得不再需要為除去添加劑而進(jìn)行其它加工處理。
可以直接使用某些商購(gòu)脂肪酸制品以便形成盤形顆粒，這是因?yàn)樵谄渲苽溥^(guò)程中，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中所需顆粒生長(zhǎng)和大小分布的脂肪衍生物被遺留下來(lái)。這些脂肪酸制品的實(shí)例包括含有低濃度甲酯的Emersol267 Oleic acid(商購(gòu)自Cognis Corp.，Cincinnati，Ohio)和含有低濃度甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的部分水解的脂肪酸類。就二羧酸發(fā)酵而言，可以由此使得從由本發(fā)明方法獲知的商購(gòu)底物中正確選擇底物成為可能。
關(guān)注的是可以在本文所述的各種發(fā)酵培養(yǎng)基中與諸如硅氧烷聚丙二醇這樣的消泡劑一起使用脂肪物質(zhì)而不會(huì)對(duì)顆粒生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。
可以按照分批或批量進(jìn)料方式向二羧酸含水混懸液中添加脂肪物質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，以二羧酸的質(zhì)量為基準(zhǔn)，所用脂肪物質(zhì)的濃度可以在約10ppm-約5％或5％以上、而優(yōu)選約50ppm-約1％的范圍。顆粒開(kāi)始生長(zhǎng)，條件是含有最低濃度的添加劑。認(rèn)為脂肪酸添加劑有助于二羧酸顆粒生長(zhǎng)，而脂肪酸酯類和其它脂肪衍生物有助于提供很窄的顆粒大小分布。
就由烴類生產(chǎn)二羧酸類的發(fā)酵而言，需要添加包括脂肪酸類和脂肪酸甲酯類在內(nèi)的脂肪衍生物的組合。最適宜的是將這些物質(zhì)混入烴類進(jìn)料以便簡(jiǎn)化進(jìn)入發(fā)酵的添加劑的準(zhǔn)備、滅菌和進(jìn)料步驟。
同樣，就由脂肪酸生產(chǎn)二羧酸類的發(fā)酵而言，需要添加類似相應(yīng)的甲酯。因此，添加劑不會(huì)改變二羧酸產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)分布。
在實(shí)施具有使二羧酸盤形顆粒生長(zhǎng)并描述對(duì)所述混懸液流變學(xué)特性益處的公開(kāi)的這些方法的本發(fā)明過(guò)程中許多組合和應(yīng)用是可能的。
已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)通過(guò)將溶解的氧濃度水平維持在占飽和空氣的約25％以下且優(yōu)選20％以下，在轉(zhuǎn)化階段中所需的共底物的用量減少。當(dāng)溶解的氧的濃度低于這些水平時(shí)，葡萄糖更有效地用于提供氧化用能量。添加過(guò)多葡萄糖的結(jié)果包括在轉(zhuǎn)化階段中生物質(zhì)和三酰基甘油酯類進(jìn)一步累積，而產(chǎn)生的二羧酸減少。
可以部分通過(guò)調(diào)節(jié)最初培養(yǎng)基進(jìn)料中鎂的濃度或鎂與磷酸鹽的比例來(lái)控制含油酵母中三酰基甘油酯的形成或?qū)⑵錅p少到最低限度。優(yōu)選的鎂在發(fā)酵接種物中的濃度約為0.1-約1.0gm/L且更優(yōu)選約0.2-約0.8g/L的濃度。優(yōu)選的磷酸鹽∶鎂之比為20∶1-約2∶1、優(yōu)選15∶1-約3∶1。
還令人意外地發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化階段中發(fā)酵肉湯中累積了可消耗H2O2的熱不穩(wěn)定性過(guò)氧化氫酶樣活性。這種情況可能干擾測(cè)定由葡萄糖氧化酶產(chǎn)生的H2O2的葡萄糖濃度試驗(yàn)。
本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是通過(guò)對(duì)油酸進(jìn)行生物氧化來(lái)制備9-十八碳烯二酸(octadecenedioic acid)。盡管可以將任意等級(jí)的油酸用作底物，但是典型的工業(yè)用油酸由下列羧酸組成0.42％C12；2.7％C14；0.86％C141；6.3％C16；4.6％C161；0 93％C17；2.8C18；71.8％C1818.3％C182；0.58％C183。該油酸還可以是獲自例如美國(guó)專利US4,627,192中所述向日葵(Helianthus annuus)(向日葵籽油)種類脂肪油的高等級(jí)油酸，將該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。還可以將其它油籽變種的高級(jí)油酸用于本方法。這類油富含大量油酸且至少含有70-80％(重量)的油酸。
根據(jù)下列實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，所有這些實(shí)施例僅用于解釋目的而不意味著以任何方式來(lái)過(guò)度限制本發(fā)明的范圍。在所有的實(shí)施例中，成分的濃度以其無(wú)水形式表示。可以使用所列成分的商購(gòu)水合物，條件是適當(dāng)調(diào)節(jié)該濃度以便包括水合物中的水。
表2合成成分 生產(chǎn)培養(yǎng)基濃度(g/L)葡萄糖 27.0硫酸銨 7.0磷酸二氫鉀 5.1硫酸鎂 0.5氯化鈣 0.1檸檬酸 0.06氯化鐵 0.023生物素 0.0002微量金屬硼酸 0.0009硫酸銅 0.00007碘化鉀 0.00018氯化鐵 0.00036硫酸錳 0.00072鉬酸鈉 0.00036硫酸鋅 0.00072水 平衡SAG471(E)消泡劑0.8ml以合適的方式對(duì)表2中的培養(yǎng)基成分進(jìn)行加熱滅菌以避免任何沉淀反應(yīng)，然后將它們混入無(wú)菌發(fā)酵罐容器、同時(shí)冷卻。發(fā)現(xiàn)完整的未接種培養(yǎng)基完全澄清并帶有輕度的稻草色且沒(méi)有強(qiáng)烈的氣味。添加消泡劑產(chǎn)生輕度渾濁。使熱帶假絲酵母H5343ALK2-1在無(wú)菌條件下的攪拌、充氣發(fā)酵罐內(nèi)在表2中所列培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，該發(fā)酵罐中最初的液體體積為12L。給該無(wú)菌培養(yǎng)基接種5％的熱帶假絲酵母H5343ALK2-1接種液并使其在35℃和pH5.8下生長(zhǎng)約10小時(shí)，同時(shí)攪拌并通氣，其比例足以使溶解的氧保持在20％以上。當(dāng)培養(yǎng)物停止以指數(shù)方式生長(zhǎng)且溶解的氧開(kāi)始增加時(shí)，通過(guò)以0.7g/L/小時(shí)的速率開(kāi)始通入混有發(fā)酵助劑1.25％Emersol267(工業(yè)用油酸)和1.25％Emery2203(工業(yè)用牛油酸甲酯)的Exxon Developmental Fluid137(含有約94.4％十三烷的烴，用于平衡的主要是十二烷)的連續(xù)進(jìn)料流而啟動(dòng)轉(zhuǎn)化階段。同時(shí)發(fā)酵罐中的溫度從35℃降低至30℃、通風(fēng)率降低至0.4vvm并將0.4巴的反壓施用于容器。在生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化階段中用6N KOH將pH維持在5.8-5.9。當(dāng)生物質(zhì)的濃度達(dá)到約10g/L時(shí)，開(kāi)始向發(fā)酵罐中以1.58g/L/小時(shí)的速率通入連續(xù)的葡萄糖進(jìn)料流。根據(jù)顯微鏡觀察和對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)累積儲(chǔ)存液泡的估計(jì)發(fā)現(xiàn)基于每天轉(zhuǎn)化過(guò)程中的葡萄糖進(jìn)料比例減少了0-15％。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中向發(fā)酵罐中添加7ml的PPG(聚丙二醇)消泡劑以控制輕度發(fā)泡。在50小時(shí)的轉(zhuǎn)化階段后，發(fā)酵罐中的全部肉湯含有41.5g/Kg1，13-十三烷二酸。
微量金屬硫酸銅 0.00007硫酸錳 0.00432硫酸鋅 0.00072檸檬酸鹽0.00708水 平衡SAG471(E)消泡劑 0.6ml以合適的方式對(duì)表3中的培養(yǎng)基成分進(jìn)行加熱滅菌以避免任何沉淀反應(yīng)并將它們混入無(wú)菌發(fā)酵罐容器。發(fā)現(xiàn)完整的未接種培養(yǎng)基完全澄清并帶有輕度的稻草色且沒(méi)有強(qiáng)烈的氣味。使熱帶假絲酵母H5343 HDC23-3在無(wú)菌條件下的攪拌、充氣發(fā)酵罐內(nèi)在表3中所列培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，該發(fā)酵罐中最初的液體體積為12L。給該無(wú)菌培養(yǎng)基接種3％的熱帶假絲酵母H5343 HDC 23-3接種液并使其在35℃下生長(zhǎng)約12小時(shí)，同時(shí)攪拌并通氣，其比例足以使溶解的氧保持在20％以上。在該生長(zhǎng)階段中通過(guò)添加6N NH4OH將pH調(diào)節(jié)至并維持在5.8-5.9，其中6N NH4OH也是培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)氮的來(lái)源。當(dāng)培養(yǎng)物停止以指數(shù)方式生長(zhǎng)且溶解的氧開(kāi)始增加時(shí)，通過(guò)添加誘導(dǎo)進(jìn)料且同時(shí)以2.0g/L/小時(shí)的速率開(kāi)始通入高油酸向日葵脂肪酸(High Oleic Sunflower Fatty Acids)(含有84.4％油酸、5.2％亞油酸、4.7％硬脂酸、3.9％棕櫚酸，其中平衡物包括少量二十烷酸(20∶0)、二十碳烯酸(eicosaenoic acid)(20∶1)、十五烷酸、月桂酸和肉豆蔻酸)的連續(xù)進(jìn)料流而啟動(dòng)轉(zhuǎn)化階段。同時(shí)發(fā)酵罐中的溫度從35℃降低至30℃、通風(fēng)率降低至0.4vvm并將pH控制試劑由NH4OH切換成NaOH。在轉(zhuǎn)化階段用6N NaOH將pH維持在5.8-5.9。當(dāng)生物質(zhì)的濃度達(dá)到約10g/L時(shí)，開(kāi)始向發(fā)酵罐中以1.22g/L/小時(shí)葡萄糖的速率通入連續(xù)的葡萄糖進(jìn)料流。根據(jù)顯微鏡觀察和對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)累積儲(chǔ)存液泡的估計(jì)發(fā)現(xiàn)基于每天轉(zhuǎn)化過(guò)程中的葡萄糖進(jìn)料比例減少了0-45％。在轉(zhuǎn)化階段中沒(méi)有再使用消泡劑。在50小時(shí)的轉(zhuǎn)化階段后，發(fā)酵罐中的全部肉湯含有71g/Kg總二羧酸類。實(shí)施例3表4合成培養(yǎng)基制品培養(yǎng)基成分 濃度(g/L)葡萄糖 20.0硫酸銨 0.5磷酸二氫鉀 5.1硫酸鎂 0.9NaCl0.5氯化鈣 0.1生物素 0.0002微量金屬硼酸0.00075硫酸銅 0.00006碘化鉀 0.00015硫酸鐵 0.04氯化鐵 0.0003硫酸錳 0.0006鉬酸鈉 0.0003硫酸鋅 0.0006水 平衡SAG 471(E)消泡劑2滴以合適的方式對(duì)表4中的培養(yǎng)基成分進(jìn)行加熱滅菌以避免任何沉淀反應(yīng)，然后將它們混入無(wú)菌發(fā)酵罐容器。發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基完全澄清而帶有輕度顏色且?guī)缀鯖](méi)有氣味。添加消泡劑產(chǎn)生輕度渾濁。最初使用6N氫氧化銨溶液將該培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至pH5.8。使用在具有相似組成的培養(yǎng)基中制備的4％接種液使熱帶假絲酵母H5343(ATCC 20962)在攪拌和通風(fēng)的發(fā)酵罐內(nèi)的該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在短暫延遲期后開(kāi)始指數(shù)生長(zhǎng)。當(dāng)通過(guò)光密度測(cè)定值判定培養(yǎng)物中含有約5g/L干重的生物質(zhì)時(shí)，基于最初培養(yǎng)基的體積以1.25g/L/小時(shí)的速率開(kāi)始葡萄糖進(jìn)料。指數(shù)生長(zhǎng)持續(xù)了約9小時(shí)，此時(shí)葡萄糖使生長(zhǎng)達(dá)到極限而同時(shí)在該期限內(nèi)指數(shù)生長(zhǎng)率僅輕度降低。
在該快速生長(zhǎng)期限結(jié)束時(shí)，將pH控制試劑改變成6N氫氧化鉀溶液并在接下來(lái)的110小時(shí)中使葡萄糖進(jìn)料保持恒定。在該期限過(guò)程中，在整個(gè)指數(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中濃度保持恒定的銨從培養(yǎng)基中耗盡且磷酸鹽的濃度下降至低水平。盡管消耗了這些關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，但是生物質(zhì)以恒定的線性速率持續(xù)在培養(yǎng)基中累積。存活細(xì)胞計(jì)數(shù)也以線性方式增加至銨從培養(yǎng)基中耗盡為止。此后它們保持恒定。最終該發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生了71.5g/L干重的生物質(zhì)。對(duì)比例1生產(chǎn)培養(yǎng)基成分 濃度(g/L)葡萄糖40.0硫酸銨8.0玉米漿9.0磷酸二氫鉀2.0磷酸氫二鉀1.0硫酸鎂0.5NaCl 0.5氯化鈣0.1微量金屬硼酸 0.00075硫酸銅0.00006
碘化鉀 0.00015氯化鐵 0.0003硫酸錳 0.0006鉬酸鈉 0.0003硫酸鋅 0.0006SAG471(E)消泡劑 2滴以合適的方式對(duì)對(duì)比例1中的培養(yǎng)基成分進(jìn)行加熱滅菌以避免任何沉淀反應(yīng)并將它們混入無(wú)菌發(fā)酵罐容器。發(fā)現(xiàn)完整的未接種培養(yǎng)基顏色極暗且?guī)в袕?qiáng)烈的玉米漿的氣味特征。使熱帶假絲酵母H5343(ATCC20962)在無(wú)菌條件下的攪拌、充氣發(fā)酵罐內(nèi)在表4中所列培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，該發(fā)酵罐中最初的液體體積為10L。給該無(wú)菌培養(yǎng)基接種6％的熱帶假絲酵母H5343(ATCC 20962)接種液并使其在35℃下生長(zhǎng)約9.5小時(shí)，同時(shí)攪拌并通氣，其比例足以使溶解的氧保持在20％以上。在生長(zhǎng)過(guò)程中向發(fā)酵罐中添加5ml的SAG471消泡劑以控制培養(yǎng)物中的發(fā)泡現(xiàn)象。在生長(zhǎng)階段中通過(guò)添加6N NH4OH將pH維持在5.8-5.9。當(dāng)培養(yǎng)物停止以指數(shù)方式生長(zhǎng)且溶解的氧開(kāi)始增加時(shí)，通過(guò)以2.0g/L/小時(shí)的速率開(kāi)始通入Emersol267(含有71.8％油酸、8.3％亞油酸、6.3％棕櫚酸、4.6％棕櫚油酸、2.8％硬脂酸、2.7％肉豆蔻酸、0.93％C17∶0酸、0.86％肉豆蔻腦酸、0.58％亞麻酸和0.42％月桂酸的商品級(jí)油酸)的連續(xù)進(jìn)料流而啟動(dòng)轉(zhuǎn)化階段。同時(shí)發(fā)酵罐中的溫度從35℃降低至30℃、通風(fēng)率降低至1.2vvm并將pH控制試劑由NH4OH切換成KOH。在轉(zhuǎn)化階段用6N KOH將pH維持在5.8或5.8以上。在即刻開(kāi)始轉(zhuǎn)化階段的指數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)以1.8g/L/小時(shí)葡萄糖的速率開(kāi)始使葡萄糖進(jìn)料流連續(xù)進(jìn)入發(fā)酵罐。在整個(gè)轉(zhuǎn)化階段對(duì)發(fā)酵罐維持這種相同的葡萄糖進(jìn)料速率。在轉(zhuǎn)化階段的前3小時(shí)過(guò)程中向發(fā)酵罐中添加17ml的SAG471消泡劑以控制極為明顯的發(fā)泡現(xiàn)象。在50小時(shí)的轉(zhuǎn)化階段后，發(fā)酵罐中的全部肉湯含有64g/Kg總二羧酸類。實(shí)施例4十二烷二酸含水混懸液的改變首先通過(guò)使用過(guò)量KOH將12.5克的Dupont產(chǎn)品(AldrichChemical Company)十二烷二酸(99％)溶于水而形成水-可溶性二羧酸鹽來(lái)制備25g/l長(zhǎng)鏈二羧酸的細(xì)粒含水混懸液。然后使用H2SO4將該溶液快速滴定至pH6以便沉淀所述的二酸。
將20毫升該混懸液分散入各8只安裝了攪棒的平底螺絲帽小瓶中。因此，各小瓶中含有懸浮于水中的0.5克的細(xì)粒十二烷二酸。在30℃下將它們置于磁攪拌器上的水浴中并通過(guò)攪拌過(guò)夜使該混懸液達(dá)到平衡。
通過(guò)在平衡小瓶中分批加入不同濃度的測(cè)試物質(zhì)來(lái)測(cè)試不同添加劑對(duì)混懸液特性的影響。商品測(cè)試物質(zhì)的組成如表1中所示。
各小瓶中的純凈制品如表5中所示。
表5
在加入測(cè)試添加劑后4小時(shí)、24小時(shí)或24小時(shí)以上觀察該混懸液的外觀和特性并與對(duì)照品(小瓶7)進(jìn)行比較。正如在相襯顯微鏡下觀察到的，作為混懸液的對(duì)照品中出現(xiàn)一定程度的各個(gè)顆粒的結(jié)合。
兩種甲酯添加劑在兩種濃度下使得DDDA更好地與相似大小的分散顆粒結(jié)合(小瓶3-6)。這種情況在將它們從攪拌的小瓶中取出并使之沉降時(shí)是明顯的。含有甲酯添加劑的混懸液的沉降遠(yuǎn)比對(duì)照品迅速。剩余的水相比對(duì)照品澄清，而對(duì)照品保持了渾濁，因?yàn)樵诨鞈乙褐斜Ａ袅溯^小的DDDA顆粒。
使用含有4小時(shí)后顆粒開(kāi)始結(jié)合成大團(tuán)塊的油酸添加劑的混懸液獲得了最令人意外的結(jié)果。在20小時(shí)時(shí)，小瓶1在接近底部有較大的DDDA密集團(tuán)塊且在小瓶上部有一些較小的團(tuán)塊。在20小時(shí)時(shí)，小瓶2中含有約1cm直徑的單個(gè)DDDA球且水相澄清。
當(dāng)將小瓶1和2持續(xù)保溫超過(guò)20小時(shí)時(shí)，數(shù)塊較大團(tuán)塊已經(jīng)破碎。然后這些團(tuán)塊粘附在攪拌棒自身上。最終所有的DDDA在攪拌棒上生長(zhǎng)，使得小瓶中的澄清水中含有渦動(dòng)的DDDA大團(tuán)塊。
本實(shí)施例表明了如何將脂肪酸類和脂肪酸衍生物的添加用于使二羧酸類的含水混懸液更適合于通過(guò)使用過(guò)濾、沉降或大小分級(jí)的方法的分離。
為了進(jìn)行比較，接著將樣品加熱至70℃并快速冷卻至室溫以破壞在原始肉湯中形成的盤形結(jié)構(gòu)。然后也如表6中所示進(jìn)行類似分析。
在不同濃度水平的二羧酸混懸液下進(jìn)行的一系列相似實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上述結(jié)果，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出基本上相似形式的特性。就熱殺樣品而言，這類濃度如下27.6g/kg、57.3g/kg、83.2g/kg、95.8g/kg、100.9g/kg、117.0g/kg和117.0g/kg。
這些結(jié)果表明脂肪酸衍生物對(duì)發(fā)酵肉湯中二羧酸形態(tài)和粘度具有驚人的影響。
權(quán)利要求
1.一種含有至少一種二羧酸的含水混懸液，它包括水、至少一種二羧酸和有效導(dǎo)致基本上盤形、基本上部分球形或基本上球形二羧酸顆粒形成的用量的脂肪物質(zhì)。
2.一種權(quán)利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的二羧酸顆粒的直徑大于約15μm。
3.一種權(quán)利要求2的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的二羧酸顆粒的直徑在約15μm-約1cm的范圍。
4.一種權(quán)利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的基本上盤形或基本上部分球形二羧酸顆粒的厚度在約1μm-約5μm的范圍。
5.一種權(quán)利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中將該混懸液的溫度維持在約50℃以下。
6.一種權(quán)利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪物質(zhì)是脂肪酸。
7.一種權(quán)利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪物質(zhì)是脂肪酸酯。
8.一種權(quán)利要求7的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
9.一種權(quán)利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中以二羧酸的質(zhì)量為基準(zhǔn)，所述脂肪物質(zhì)的含有量大于約10ppm。
10.一種權(quán)利要求9的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中以二羧酸的質(zhì)量為基準(zhǔn)，所述脂肪物質(zhì)的含有量在約10ppm-約5％的范圍。
11.一種權(quán)利要求10的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中以二羧酸的質(zhì)量為基準(zhǔn)，所述脂肪物質(zhì)的含有量在約50ppm-約1％的范圍。
12.一種權(quán)利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪物質(zhì)包括脂肪酸與脂肪酸酯的組合。
13.一種權(quán)利要求12的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
14.一種權(quán)利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中該含水混懸液是包括下列組成的發(fā)酵培養(yǎng)基(a)可代謝的碳源和能源；(b)無(wú)機(jī)氮源；(c)磷酸鹽源；(d)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過(guò)渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(e)基本上不含顆粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源。
15.一種用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，該方法包括下列步驟向所述混懸液中添加使二羧酸顆粒有效成形的用量的脂肪物質(zhì)以便使具備某種形狀的二羧酸顆粒形成，其中所述的形狀選自基本上盤形、基本上部分球形或基本上球形組成的組。
16.一種權(quán)利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的顆粒具有約大于15μm的直徑。
17.一種權(quán)利要求16的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的二羧酸顆粒的直徑在約15μm-約1cm的范圍。
18.一種權(quán)利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的基本上盤形或基本上部分球形二羧酸顆粒的厚度在約1μm-約5μm的范圍。
19.一種權(quán)利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，進(jìn)一步包括將該混懸液的溫度維持在約50℃以下的步驟。
20.一種權(quán)利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的脂肪物質(zhì)是脂肪酸。
21.一種權(quán)利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的脂肪物質(zhì)是脂肪酸酯。
22.一種權(quán)利要求21的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
23.一種權(quán)利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中加入的脂肪物質(zhì)占二羧酸質(zhì)量的約10ppm以上。
24.一種權(quán)利要求23的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的用量占二羧酸質(zhì)量的約10ppm-約5％。
25.一種權(quán)利要求24的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的用量占二羧酸質(zhì)量的約50ppm-約1％。
26.一種權(quán)利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的脂肪物質(zhì)是脂肪酸與脂肪酸酯的組合。
27.一種權(quán)利要求26的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
28.一種權(quán)利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中該含水混懸液包括發(fā)酵培養(yǎng)基。
29.一種權(quán)利要求28的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學(xué)特性的方法，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括(a)可代謝的碳源和能源；(b)無(wú)機(jī)氮源；(c)磷酸鹽源；(d)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過(guò)渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(e)基本上不含顆粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源。
全文摘要
一種發(fā)酵培養(yǎng)基，它含有(a)可代謝的碳源和能源；(b)無(wú)機(jī)氮源；(c)磷酸鹽源；(d)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過(guò)渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(e)基本上不含顆粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素。可以將脂肪物質(zhì)加入到含有至少一種二羧酸的含水混懸液中以便改變?cè)摶鞈乙旱牧髯儗W(xué)特性。
文檔編號(hào)C12N1/16GK1394232SQ01803479
公開(kāi)日2003年1月29日 申請(qǐng)日期2001年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月7日
發(fā)明者K·W·安德森, J·D·溫澤爾 申請(qǐng)人:科金斯公司