專利名稱：通過rna編輯在水稻和其他作物上制備細胞質雄性不育系的方法
技術領域：
本發明涉及細胞質雄性不育(CMS)轉基因植物，以及利用RNA編輯作為分子工具制備這種植物的方法。本發明特別涉及利用RNA編輯培育水稻雜交種(CMS)。
背景技術：
CMS是在植物線粒體中通過母體遺傳的性狀，它能在減數分裂之后，在小孢子發生期間導致花粉粒敗育，對CMS的高度興趣是因為它在雜交種子生產方面在經濟上的重要性。通過異花授粉產生的植物保持雄性不育，除非花粉親本的核基因組具有核雄性可育恢復(MFR)等位基因(1)。生產含有重組線粒體基因組的品系的能力在研究CMS方面具有極高的價值。另一種有價值的遺傳資源是被稱為Rf的顯性核基因，該基因能恢復CMS性狀。通過比較被恢復的育性和具有不育性細胞質的不育植物，獲得了某些重要信息。在某些場合下，通過由mtDNA序列之間的重組事件所產生的嵌合基因的存在，可以在遺傳學水平上將上述現象關聯起來(2，3)，并可以根據ATP產量的顯著降低從生物化學角度加以驗證。
第二次綠色革命取決于將分子生物學應用到作物，特別是水稻上的重大進步。現代分子生物學已經發展了一系列技術，這些技術可以分析作物基因組，并且以適合高產，提高抗病性和提高對極端環境的耐受性的方式對其加以改變。水稻是第二大一年生谷類作物，并且與小麥不同，它是在小塊土地上種植，并且以手工方式管理和收獲。栽培的水稻是一種一年生作物，在長葉子上長有由小穗組成的花序(圓錐花序)，由花產生種子或谷粒。水稻包括大約25個種，大約在公元前3000年在印度被馴化，隨后傳入中國、印度支那、印度尼西亞和日本列島。中國和印度的水稻產量占全球產量的將近60％，大約有2億噸。水稻產量取決于地理位置、天氣條件和栽培方法。水稻構成了世界上農藥消費的最大單一市場，每年將近要花費30億美元，因此，為生物技術提供了大的機遇。在印度，在1930-1980年之間，水稻產量提高了一倍以上。目前，在3億5千萬英畝的栽培面積上的產量為4億2千萬噸。產量的提高是因為使用了改良的品種和農藝措施。
雜交水稻的栽培，間接促進了細胞質的均勻性。在培育新的雜交種時，在培育細胞質雄性不育(CMS)系方面要花費大量時間。需要5-6代回交才能將具有需要的核背景的品系轉化成可用于雜交種子生產的雄性不育系。對使用分子工具鑒定并設計一種比較快的方法來制備新的細胞質資源的需要是迫切的。
RNA編輯是一種轉錄后加工，能在植物線粒體中導致RNA中的C改變成U。RNA編輯將改變RNA分子的核苷酸序列，使它不同于編輯它的DNA模板的序列，從而違背了分子生物學的中心法則(4，5)。這種轉錄后加工會導致RNA上C向U的轉變，并且更少見的是發生T向C的轉變(6，7)。對密碼子中的關鍵核苷酸進行編輯，導致氨基酸的改變，在大多數情況下，并且在產生以前不存在的起始密碼子和終止密碼子時，最終組裝成一種有功能的基因。在RNA編輯之后，相應的蛋白序列與未編輯過的基因組推測蛋白的序列不同。對蛋白的修飾涉及到呼吸鏈的復合體，業已證實這種復合體通常決定著雄性不育表型，因為它們能影響線粒體呼吸鏈復合體I的功能。編輯事件有時候是物種專一性的(8)，并且在某些場合下是沉默的，在月見草屬和小麥、玉米或豌豆中的保守區上部分或完全相同(9)。業已在小麥和月見草屬上產生剪接位點時觀察到了編輯(10，11)。
微管植物線粒體(mt)基因組的特征是具有多種不同的特征。這些基因組比非植物線粒體的基因組大，并且它們的物理結構由于決定活性DNA重新排列的重復而不一致。對擬南芥線粒體基因組進行的全面測序(Unseld，1997#2562)證實，盡管大部分高等植物線粒體DNA是不編碼的，但是在其基因組中仍然存在50個以上的開放讀框(orf)，包括存在于動物mt基因組中的正常的基因組，還包括核糖體蛋白基因，類似于細菌基因的與細胞色素c生物發生相關的新的基因(Gonzalesz，1993#1874；Schuster，1994#2194；Bonnard，1995#2331；Gruska，1995#2340)以及諸如orfB和orf25的具有未知功能的基因。業已在多種不同的物種上報導了葉綠體DNA插入片段的存在，用若干種有功能的tRNA基因補充線粒體(Marechel，1987#810)。以上插入片段，以及內含子和經常重復的序列的存在導致了高等植物線粒體基因組具有大的體積。
該基因組的獨特性還表現在其表達所需要的機制方面，該機制包括順式和反式剪接，以及RNA編輯。在大多數場合下，RNA編輯會導致氨基酸改變，包括產生以前不存在的起始和終止密碼子。幾乎所有蛋白編碼基因的所有轉錄物都是編輯過的，最常見的結果是導致物種之間蛋白序列的相似性。同樣在高等植物葉綠體結構RNA，如內含子上發現了類似的從C→U的mRNA編輯活性(Maier，1996#2560)，還在若干物種的線粒體中發現了tRNA的編輯(Wissinger，1992#1608；Marechal-Drouard，1993#1991)。最初是在cox2基因上檢測到高等植物線粒體內含子的(Fox，1981#367)，它們屬于II型內含子，其特征表現在它的結構(Michel，1983#1764Michel，1989#820)以及除掉它所采用的機制方面(Cech，1990#17645)。在植物線粒體中，某些II型內含子業已通過重組而分離，使外顯子分布在不同的基因組位點上。因此，分離的轉錄物需要通過反式剪接連接在一起。這種現象最初是在核基因上報導的(Borst，1986#1778)，同樣是葉綠體rps12(Koller，1987#255)和psaA(Goldschmidt-Clermont，1991#1394)基因表達所需要的。
NADH-泛醌氧化還原酶(復合物I)包括25個以上的蛋白亞基，它是最大的呼吸復合體，并且位于線粒體內膜上(Herz，1994#2080)。這種酶能催化NADH的氧化，并將電子轉移到泛醌。迄今為止，業已在高等植物線粒體中鑒定了所述基因，這些基因是9個線粒體編碼的亞基。
nad1、nad2、nad3、nad4、nad4L、nad5和nad6基因(Schuster，1994#2195)在哺乳動物線粒體中具有對應體，與此不同的是，nad7(Bonen，1994#2123)和nad9(Lattina，1993#1491)是由哺乳動物核基因組編碼的(Walker，1992#1834)。nad基因的表達很好地說明了可能出現在高等植物線粒體基因組中的各種復合體。nad3、nad4L、nad6和nad9是連續的基因，而nad4(Lattina，1991#1080)和nad7(Bonen，1994#2123)由若干順式剪接內含子間隔開。在各種植物物種中，nad1(Wissinger，1991#1124；Chapdelaine，1991#1097)、nad2(Binder，1992#1416)和nad5的基因(Knoop，1993#1250；Pereira de Souza，1991#1128)是順式剪接和反式剪接的，由此表現出最復雜的表達形式。
業已研究了小麥nad2的結構和表達，編碼NADH泛醌還原酶亞基2的線粒體基因的表達，揭示了微管植物線粒體基因組的某些特征，順式、反式剪接和mRNA編輯是該基因正確表達所必須的。在小麥線粒體中，編碼NADH泛醌氧化還原酶亞基2的基因(nad2)分成5個外顯子，位于兩個不同的基因組區。該基因的頭2個外顯子a和b是從同一條DNA鏈上的外顯子c、d和e下游22kb處轉錄的。nad2的所有內含子都是II型的。推測外顯子b和c的反式剪接會使兩個獨立轉錄的編碼序列結合在一起。發生在結構域IV環中的DNA重排似乎決定著該基因組構，因為所述反式剪接事件涉及到在被中斷的結構域IV的莖上的2個前體RNA的堿基配對。編碼tRNATyr的基因位于外顯子c的上游，并有可能與外顯子c-e共同轉錄。除了剪接加工之外，nad2的正確表達同樣需要mRNA編輯。成熟的mRNA在隨機分布在其5個外顯子上的36個位置上進行編輯，導致了28種密碼子修飾。編輯能提高蛋白的疏水性和保守性。
太窄的細胞質基礎，會導致作物容易發生病蟲害的大爆發，并對環境產生負面影響。大多數現有的雜交種都具有非常窄的細胞質基礎，如“WA”細胞質，使得有關作物容易受到病蟲害的侵害，并且對環境造成負面影響。
因此，本發明的主要目的是鑒定并開發能產生CMS的細胞質的新資源。
本發明的另一個目的是優化通過遺傳工程超量表達未編輯過的形式的應用，以便產生CMS，和用于恢復其核育性的它的反義形式。
本發明的目的還在于將RNA編輯在精確轉錄加工中的根本重要性與更常用的方法結合在一起，以便在作物上，特別是在水稻上產生CMS系。
本發明的另一個目的是將RNA編輯在精確轉錄加工中的根本重要性與更常用的方法結合在一起，以便在作物上，特別是在水稻上產生CMS系。
本發明的再一個目的是將未編輯過的形式基因的表達與雄性不育性的出現聯系在一起。雄性不育表型是由于能影響正常花粉發育和減少花粉粒形成的線粒體異常造成的。
為了實現上述目的，本發明涉及一種通過RNA編輯制備的細胞質雄性不育(CMS)轉基因植物，用于表達未編輯過的nad9基因，使得該植物的線粒體不能產生ATP。
所述細胞質雄性不育性(CMS)轉基因植物是從水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea Mays)、大豆(Glycinemax)等中選擇的。
所述細胞質雄性不育性(CMS)轉基因植物是水稻。
本發明還提供了一種通過RNA編輯制備細胞質雄性不育性(CMS)轉基因植物的方法，用于表達未編輯過的nad9基因，使得該植物的線粒體不能產生ATP。該方法包括以下步驟-通過PCR由擬南芥cDNA(At-mRBP1a)克隆線粒體導向肽，-用SacI和XbaI消化所述PCR產物的SacI和XbaI位點，以便將它克隆到pBSK載體上，獲得被稱為pNG1的結構，-通過消化所述PCR產物，將從線粒體中獲得的未編輯過的nad9基因克隆到來自作物品種的pNG1上，-消化所述具有未編輯過的nad9基因的克隆產物，獲得pNG3，-克隆具有未編輯過的nad9和受遍在蛋白啟動子和NOS終止子控制的導向序列的作物，以便獲得pNG11，-用pNG11和潮霉素基因(pLAU6hph結構)一起共同轟擊，以便獲得未編輯過的nad9植物。
發明詳述本發明的目的是通過利用兩種形式的同一個基因，改變線粒體內膜的四種質子泵多蛋白復合體中一種或多種的功能(NADH-還原酶，細胞色素c還原酶、以及細胞色素c氧化酶或ATP合成酶復合體)，導致細胞能量水平的下降。一種形式的基因是天然存在的、功能性編輯過的轉錄物，而另一種是未編輯過的轉錄物，導致產生不同的RNA和推測的蛋白，并因此妨礙亞基排列，并使該復合體喪失功能。
復合體I(NADH泛醌氧化還原酶)的亞基(nad9)是呼吸鏈的第一種復合體，它會導致泛醌-線粒體內膜上電子轉運物的減少。復合體I在電子流上占據著戰略地位，并且業已證實，能干擾其組裝的突變會誘導雄性不育。該亞基(nad9)相當于哺乳動物復合體I的30kDa的蛋白。在復合體I中，nad9位于鐵硫亞級份中，朝向線粒體基質。其推測的氨基酸組成表明，它是一種親水性蛋白。nad9可能是用于本發明目的的最佳候選者，因為它是一種小的轉錄物，在小麥中在14個位置上進行編輯，導致11種氨基酸修飾，在所有情況下都會產生更保守的蛋白。
具體地講，以上方法包括步驟1克隆線粒體導向序列(

圖1)線粒體導向序列是通過PCR由擬南芥cDNA(At-mRBP1a)克隆的，寡聚物正向引物aagagcTccc ATG GTC TTC TGT AAC AAA CTC G反向引物Aa tct Aga CTT GGT AGA CAT CAA CCG G所述正向引物具有SacI位點，而所述反向引物具有XbaI位點，以便克隆到pBS(SK)上。
用于克隆線粒體導向序列的PCR條件為50納克具有At-mRBP1a cDNA的載體10微升10倍Pfu克隆緩沖液2微升10mM dNTP’s1微升正向寡聚物(50皮摩爾)1微升反向寡聚物(50皮摩爾)1微升pfu聚合酶加水到最終體積為100微升92℃3分鐘92℃45秒40℃1分鐘(5輪)72℃1分鐘92℃45秒47℃1分鐘(30輪)72℃1分鐘72℃10分鐘用SacI和XbaI消化PCR產物，并克隆到pBS(SK)上。該結構被稱為pNG1。
步驟2
克隆水稻編輯過的nad9編輯過的nad9是通過RT-PCR從水稻總RNA中獲得的。在黑暗中，在250c下，在潮濕的蛭石上使印度水稻(IR64)種子發芽，并使它生長3周時間，將3周齡的幼苗用于提取總RNA，并且用于分離線粒體。提取總RNA·在液氮中研磨3毫克組織，轉移到falcon試管中。
·添加9毫升提取緩沖液，渦旋攪拌·添加0.6毫升pH4.8的3M乙酸鈉，3.0毫升水飽和的苯酚和1.8毫升氯仿∶異戊醇(24∶1)，渦旋攪拌·在冰上培養15分鐘·在JA25.50轉子上，以15000rpm的速度離心30分鐘·用苯酚∶氯仿提取，直到兩相之間的界面透明·向水相中添加等體積的異丙醇·在-20℃下保存1小時·以15000rpm的速度離心30分鐘·用70％的乙醇洗滌·使沉淀干燥·溶解在水中提取緩沖液4M硫氰酸胍25mM檸檬酸鈉，pH7.00.5％sarcosyl0.1mM/3-巰基乙醇3M乙酸鈉，pH4.8水平衡的苯酚氯仿∶異戊醇(24∶1)異丙醇和70％的乙醇RT-PCR逆轉錄如果RNA溶解在乙醇中，添加1/10體積的3M乙酸鈉，在-20℃下使RNA沉淀1小時，以12000rpm的速度離心30分鐘，用70％的乙醇洗滌沉淀，溶解在milli Q水中。
另外添加500納克隨機的六聚體，在65℃下培養5分鐘，并放置在冰上，另外添加以下成分-10微升5倍RT緩沖液-5微升DTT(0.1M)-10微升dNTP’s(2mM)-1微升逆轉錄酶M-MLV(＝200個單位)然后在37℃下再培養2小時添加5微升ATP 10mM1微升T4多核苷酸激酶(10個單位)在37℃下培養15分鐘添加2微升T4 DNA連接酶(2個單位)在37℃下培養45分鐘寡聚物正向aa Tct aga ATG GAT AAC CAA TTC ATT TTC CAA反向aag gAt cCG GAA TTA TCC GTC GCT ACG正向引物具有XbaI位點，而反向引物具有BamHI位點，以便克隆與線粒體導向序列相鄰的、編輯過的nad9基因。按照標準條件實施PCR。用Xba和BamHI消化PCR產物，并且克隆到pNG1上，并稱之為pNG2。用Xba和BamHI消化pNG2上的編輯過的nad9基因，并將其克隆到遍在蛋白啟動子上，稱之為pNG10，如圖2所示。
步驟3克隆水稻未編輯過的nad9用標準方法分離線粒體提取緩沖液0.4M蔗糖50.0mM Tris-HCl，pH7.53.0mM EDTA
0.1％BSA4.0mM b-/3-巰基乙醇2mM DTT洗滌緩沖液——不含BSA和DTT的提取緩沖液2倍梯度緩沖液0.5M蔗糖100mM Tris-HCl，pH7.56.0mM EDTA用2倍梯度緩沖液制備的Percoll梯度裂解線粒體以便獲得線粒體DNA將大約75微克水稻線粒體重新懸浮在再懸浮緩沖液中。為了重新懸浮線粒體，添加1/4體積的裂解緩沖液。倒轉試管，并馬上添加苯酚，然后再添加氯仿。然后進行3次苯酚氯仿提取，接著進行氯仿提取。向水相中添加2.5倍體積的乙醇和1/10倍體積的3.0M乙酸鈉。在-20℃下保存30分鐘，以13000rpm的速度離心20分鐘，用70％的乙醇洗滌，干燥，并溶解在水中。
寡聚物正向aa Tct aga ATG GAT AAC CAA TCC ATT TTC CAA反向aag gAt cCG GGA TTA TCC GTC GCT ACG正向引物具有XbaI位點，而反向引物具有BamHI位點，以便克隆與線粒體導向序列相鄰的未編輯過的的nad9基因。
PCR取1微升1∶10稀釋的線粒體DNA進行PCR10微升10倍Pfu克隆緩沖液2微升10mM dNTP’s1微升正向寡聚物(50皮摩爾)1微升反向寡聚物(50皮摩爾)1微升pfu聚合酶加水到最終體積為100微升
92℃3分鐘92℃45秒42℃1分鐘(5輪)72℃1分鐘92℃45秒49℃1分鐘(30輪)72℃1分鐘72℃10分鐘用XbalI和BamHI消化PCR產物，并克隆到pNG1上，稱之為pNG3。
用XbalI和BamHI將未編輯過的nad9基因從pNG3上消化下來，并克隆到遍在蛋白啟動子上，稱之為pNG11，如圖3所示。
步驟4將編輯過的nad9(pNG10)和未編輯過的nad9(pNG11)用于biolistic轉化。轉化方法是共同轟擊，因此，用于biolistic轉化的結構，在一種質粒上具有感興趣的基因(具有遍在蛋白啟動子和Nos終止子的pAHC27，以及pLAU6(來自ILTAB，它具有CvMV啟動子和NOS終止子))，而選擇標記在另一種質粒上。
實施例收集植物材料Basmathi370和swarna的種子是由水稻研究董事會(DRR，Hyderabad，印度)提供的。
培養基MS培養基(Murashige&skoog，1962)含有MS鹽(MS-主要成分，MS微量成分)，FeEDTA，0.5毫克/升Pyrodoxine，1.0毫克/升硫胺素，0.5毫克/升煙酸鎳，30克/升蔗糖，2.6克/升植物凝膠。
MSO培養基是補充了30克/升甘露糖醇和30克/升山梨醇的MS培養基。
用于第一次選擇的RC培養基補充了30毫克/升潮霉素。
用于第二次選擇的CC培養基含有50毫克/升潮霉素，300毫克/升酪蛋白水解物，500毫克/升脯氨酸。
預再生培養基含有30克/升麥芽糖，50毫克/升潮霉素，2毫克/升細胞分裂素，1毫克/升萘乙酸，5毫克/升脫落酸。
再生培養基含有30克/升麥芽糖，50毫克/升潮霉素，2.5毫克/升細胞分裂素，0.1毫克/升萘乙酸。
用于長根的1/2MS培養基含有1/2MS鹽，1/2維生素B5，10毫克/升蔗糖。
愈傷組織誘導和可再生愈傷組織的選擇在70％的乙醇中對去殼的成熟種子進行表面消毒2分鐘，然后用50％的商用漂白劑漂白30分鐘。然后用無菌水漂洗所述種子。然后，將所述種子放在含有MS培養基的培養皿上，并在25℃下遮光培養14天。去掉由小盾片區誘導的原始愈傷組織，并且在新的MS培養基上，在相同條件下繼代培養一周時間。在繼代培養之后，在每一個緊湊的原始愈傷組織上部，出現很多疏松結合的小的球形愈傷組織。輕輕取下這些愈傷組織，并且放到新的MS培養基上。將直徑為1-3毫米的愈傷組織用于轉化。
制備用于轟擊的繼代培養的愈傷組織將大約60個直徑為2-3毫米的胚胎發生愈傷組織放在裝有滲透培養基的培養皿中央。在該培養基上培養4小時之后，馬上用粒子加速器PDS-1000/He對這些愈傷組織進行微粒轟擊。
微粒轟擊介導的轉化所用的biolistic槍是PDS-1000/He槍(Bio-Rad實驗室，美國)。所使用的金顆粒的大小為1.5-3.0μ。破裂碟片壓力為1100psi，而氦氣壓力必須為1200psi。在所述槍膛中形成25mg/Hg的真空度。所使用的DNA濃度為5微克/微升。
制備金懸浮液稱出6毫克金顆粒，向其中加入100微升100％的乙醇，然后渦旋攪拌1分鐘。以10000rpm的速度離心10秒。用移液管將上清液吸出，并向沉淀中加入100微升無菌蒸餾水。進行渦旋攪拌并離心，并重復相同的過程。將50微升最終的金懸浮液用于轟擊。
粒子包衣方法向50微升金懸浮液中添加5微克DNA，并充分混合。添加20微升0.1M亞精胺(Sigma，Aldrich)，并在渦旋攪拌器上低速混合。添加50微升2.5M氯化鈣，并充分混合。將該混合物在室溫下放置10分鐘。以10000rpm的速度離心10秒，并用移液管將上清液移出，將50微升100％的乙醇添加到沉淀中。將10微升樣品用于對大型載體進行包衣，使膜干燥，然后用于轉化。在轉化之后，將愈傷組織保持在相同的培養皿上，并遮光培養16小時。
轟擊過的細胞的生長和選擇在16小時之后，將所述愈傷組織轉移到RC30培養基上進行選擇，并且在25℃下遮光培養21天。將抗性愈傷組織轉移到CC50培養基上，并遮光培養18天。只將抗性愈傷組織轉移到預再生培養基上培養1周。將增殖的愈傷組織保持在再生培養基上，在25℃下，用16小時光照和8小時黑暗的光周期進行培養。在再生出幼苗之后，將其轉移到裝有1/2 MS培養基的試管中。
可以用多種方法分析轉化體1.用合適的探針(cDNA克隆，寡核苷酸)通過Southern雜交檢測轉基因的存在。通過Northern印跡分析所述基因向RNA的表達，然后通過RT-PCR獲得mRNA的序列。
2.用單一專一性的抗nad9的抗血清檢測所述蛋白的輸出。
3.通過免疫親合的新技術評估所述蛋白在復合體I中的整合，并且估計由推測的錯誤組裝所導致的損害。
4.用甲苯胺蘭通過超結構分析對花粉進行組織學分析。
5對分蘗、種子數量、植物長度進行基礎育種研究，以便評估產量。
6.在編輯過的和未編輯過的nad9轉化過的水稻植物之間進行雜交，以便評估育性恢復情況。
7.根據花粉在特定培養基上萌發的能力評估花粉的生活力。
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權利要求
1.一種通過RNA編輯制備的細胞質雄性不育(CMS)轉基因植物，用于表達未編輯過的nad9基因，使得該植物的線粒體不能產生ATP。
2.如權利要求1的細胞質雄性不育性(CMS)轉基因植物，其中，所述植物是從水稻、小麥、玉米、大豆等中選擇的。
3.如權利要求1的細胞質雄性不育性(CMS)轉基因植物，其中，所述植物是水稻。
4.一種通過RNA編輯制備細胞質雄性不育性(CMS)轉基因植物的方法，用于表達未編輯過的nad9基因，使得該植物的線粒體不能產生ATP，該方法包括以下步驟-將來自擬南芥cDNA(At-mRBP1a)的線粒體導向肽克隆到pBSK載體上，以便獲得被稱為pNG1的結構，-通過消化所述從線粒體DNA中獲得的PCR產物，克隆未編輯過的nad9基因，以便獲得pNG3，-用具有未編輯過的nad9基因和受遍在蛋白啟動子和NOS終止子控制的導向序列克隆作物，以便獲得pNG11，-按照本文所披露的方法，用pNG11和潮霉素基因(pLAU6hph結構)一起共同轟擊，以便產生含未編輯過的nad9基因的植物，-用具有編輯過的nad9基因pNG10的對照植物分析未編輯過的nad9(pNG11)結構，以便確定nad9基因的存在。
5.如權利要求4的方法，包括以下步驟-將來自擬南芥cDNA(At-mRBPla)的線粒體導向肽克隆到pBSK載體上，以便獲得被稱為pNG1的結構，-通過消化所述從線粒體DNA中獲得的PCR產物，克隆未編輯過的nad9基因，以便獲得pNG3，-用具有未編輯過的nad9基因和受遍在蛋白啟動子和NOS終止子控制的導向序列克隆水稻，以便獲得pNG11，-按照本文所披露的方法，用pNG11和潮霉素基因(pLAU6hph結構)一起共同轟擊，以便產生含未編輯過的nad9基因的水稻植物，-用具有編輯過的nad9基因pNG10的對照水稻分析未編輯過的nad9(pNG11)結構，以便確定nad9基因的存在。
全文摘要
本發明涉及通過RNA編輯制備的細胞質雄性不育(CMS)轉基因植物，以便表達未編輯過的nad9基因，使得植物的線粒體中不能生產ATP，并且涉及一種制備所述植物的方法。該方法包括通過消化由線粒體DNA獲得的PCR產物克隆未編輯過的nad9基因，以便獲得具有未編輯過的nad9基因的pNG3克隆作物，使導向序列受遍在蛋白啟動子和NOS終止子的控制，以便獲得pNG11共轟擊pNG11結構，采用本文所披露的具有潮霉素基因的形式(pLAU6hph結構)，以便產生含有未編輯過的nad9基因的植物；分析未編輯過的nad9(pNG11)結構和具有編輯過的nad9基因的植物pNG10，以便確定nad9基因的存在。
文檔編號C12N15/09GK1429272SQ01808547
公開日2003年7月9日 申請日期2001年2月26日 優先權日2000年2月25日
發明者維爾盧·摩拉瓦拉·帕特爾, N·拉亞普拉姆, M·文卡塔拉米亞, J·喬伊, S·K·戈斯瓦米 申請人:瓊－米歇爾·格林倫伯格, 阿維斯塔金格蘭技術有限公司