專利名稱：生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗的基因工程體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗的基因工程體，屬生物高新技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)品，專用于生產(chǎn)能促進(jìn)家畜、家禽生長(zhǎng)的生長(zhǎng)抑素(SS)基因工程亞單位苗(新型激生系列苗)。
生長(zhǎng)抑素基因工程活載體苗及生長(zhǎng)抑素(SS)基因工程亞單位苗(激生系列苗)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的原理是通過激素的免疫調(diào)控促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。參與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的激素有多種，其中由垂體分泌的生長(zhǎng)激素(GH)和肝臟分泌的生長(zhǎng)介素(SM)，亦稱胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)是調(diào)節(jié)核心，而GH和SM的合成和分泌又受下丘腦分泌的兩種高位激素——生長(zhǎng)激素釋放激素(GRH)和生長(zhǎng)抑素(SS)所調(diào)控。前者促進(jìn)GH的合成和分泌，后者則抑制其合成和分泌。GH又作用于肝臟上的受體，促使SM的合成和分泌，SM則直接作用于多種組織，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞增殖，從而促使肌肉、內(nèi)臟和骨骼的生長(zhǎng)。SS系列苗免疫后，能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生SS抗體，中和SS，解除生長(zhǎng)抑制，使GH和SM等正向調(diào)節(jié)的激素水平提高，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。見

圖1。
自1981年以來，國(guó)外有不少報(bào)道關(guān)于應(yīng)用人工合成的生長(zhǎng)抑素(SS)，連接各種載體蛋白，如牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白等，制備合成肽苗。用于免疫牛、羊、豬等均能促進(jìn)GH釋放增加，從而促進(jìn)家畜生長(zhǎng)，可提高日增重10％左右。也有應(yīng)用SS合成肽苗免疫動(dòng)物，制備SS抗血清，被動(dòng)免疫家畜以促進(jìn)生長(zhǎng)的報(bào)道。但由于合成肽成本太高，上述研究均停留在理論研究水平，未能形成商品在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用。
現(xiàn)有技術(shù)中本課題組發(fā)明人之一——南京農(nóng)業(yè)大學(xué)杜念興教授，于七五期間主持農(nóng)業(yè)部生物技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目——生長(zhǎng)抑素基因工程疫苗研究，先后構(gòu)建了3個(gè)基因工程體。其中以痘苗病毒為載體，將SS基因與乙肝表面抗原(HBsAg)基因連接，構(gòu)建成HBs/SS融合基因，將其插入痘苗病毒載體中，獲得能表達(dá)HBsAg/SS融合蛋白的重組痘苗病毒(vv-HBs/SS)。用該基因工程體制成生長(zhǎng)抑素基因工程活載體苗，簡(jiǎn)稱激生1號(hào)苗。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室小試，增重效果顯著，并已通過農(nóng)業(yè)部鑒定，被認(rèn)為是國(guó)內(nèi)外第一個(gè)有望用于促進(jìn)家畜生長(zhǎng)的基因工程苗，處于國(guó)際領(lǐng)先水平，建議進(jìn)行中試，盡快將本成果推廣應(yīng)用，轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，1997年經(jīng)國(guó)家科委(科技部)列入863中試項(xiàng)目。經(jīng)農(nóng)業(yè)部生物基因工程安全管理委員會(huì)審批為安全等級(jí)I級(jí)，同意進(jìn)行中間試制。經(jīng)中間試制和田間試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，不造成環(huán)境污染，免疫豬、牛、羊等家畜安全有效。該技術(shù)2000年通過科技部驗(yàn)收，經(jīng)農(nóng)業(yè)部生物基因工程安全管理委員會(huì)批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)。同年獲得大北農(nóng)科技成果獎(jiǎng)和香港中華專利博覽會(huì)金獎(jiǎng)，發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?0107295.1。
鑒于激生1號(hào)疫苗只能用于家畜，不能用于家禽，免疫期只有3個(gè)月，再次免疫時(shí)因產(chǎn)生抗痘苗病毒抗體，效果不理想。為彌補(bǔ)以上缺點(diǎn)，又設(shè)計(jì)研制了生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗(激生2號(hào))，發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?0105675.1。
基因工程亞單位苗和基因工程生產(chǎn)多肽類藥物，表達(dá)產(chǎn)物的提取費(fèi)用往往占生產(chǎn)成本的70％，第一個(gè)SS亞單位苗(激生2號(hào)苗)采用pET32c質(zhì)粒中的硫氧還蛋白(TRX)為載體。構(gòu)建時(shí)，將主基因SS插入載體蛋白TRX的長(zhǎng)臂中間，在SS之后，還留有一個(gè)長(zhǎng)長(zhǎng)的尾巴。這樣就使得作為主要免疫原的SS不能充分暴露，影響免疫原性的充分發(fā)揮，并且其表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，不利于提取純化。見圖2。
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中激生2號(hào)苗的基因工程體的缺陷，構(gòu)建新型SS基因工程亞單位苗(激生3號(hào)苗)的基因工程體。該基因工程體表達(dá)產(chǎn)物呈水溶性，易于提取，而作為免疫原的SS又充分暴露，達(dá)到充分發(fā)揮SS基因的免疫原性目的。設(shè)置不同類型達(dá)到互測(cè)SS抗體的目的。
本發(fā)明所提供的生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗的基因工程體(商品名為“激生3號(hào)”)，采用人工合成SS基因，將其插入載體蛋白表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，提取重組質(zhì)粒并經(jīng)酶切鑒定、序列測(cè)定驗(yàn)證而成。生長(zhǎng)抑素基因SS的氨基酸序列如下 其特征在于，SS基因設(shè)計(jì)中含終止子。其設(shè)計(jì)通式為5’-保護(hù)性堿基—內(nèi)切酶—框架保證堿基—單價(jià)SS基因或雙價(jià)SS基因—終止子—內(nèi)切酶—保護(hù)性堿基—3’其中人工合成SS基因?yàn)閱蝺r(jià)SS基因或雙價(jià)SS基因，在其3’端設(shè)有終止子。選用硫氧還蛋白(TRX)pET32表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，SS基因插入位點(diǎn)以后的密碼子不能表達(dá)，其長(zhǎng)長(zhǎng)的尾巴被截去，作為免疫原的SS得以充分暴露。見圖3、4。選用載體蛋白為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)pGEX-6P-1系統(tǒng)時(shí)，因其本身沒有尾巴，SS亦能充分暴露。共構(gòu)建包括用單價(jià)SS基因與截去尾巴的硫氧還蛋白(TRX)pET32表達(dá)系統(tǒng)重組獲得的基因工程體E.coli-SS 1a/TRX、用雙價(jià)SS基因與截去尾巴的硫氧還蛋白(TRX)pET32表達(dá)系統(tǒng)重組獲得的基因工程體E.coli-SS 2b/TRX和用雙價(jià)SS基因與本身沒有尾巴的pGEX-6P-1表達(dá)系統(tǒng)重組獲得的基因工程體E.coli-SS 2c/GST 3株基因工程體。
用單價(jià)SS基因與截去尾巴的硫氧還蛋白(TRX)pET32表達(dá)系統(tǒng)獲得的基因工程體，分類大腸埃希氏桿菌，命名E.coli-SS 1a/TRX，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號(hào)0705用雙價(jià)SS基因與截去尾巴的硫氧還蛋白(TRX)pET32表達(dá)系統(tǒng)獲得的基因工程體，分類大腸埃希氏桿菌，命名E.coli-SS 2b/TRX，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080
保藏號(hào)0707用雙價(jià)SS基因與本身沒有尾巴的pGEX-6P-1表達(dá)系統(tǒng)獲得的基因工程體，分類大腸埃希氏桿菌，命名E.coli-SS 2c/GST，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號(hào)0708本發(fā)明所提供的生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗的基因工程體，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1)本發(fā)明所提供的新型SS基因工程亞單位苗(激生3號(hào)苗)的基因工程體，構(gòu)建過程中采取切去TRX的部分長(zhǎng)尾的辦法，不僅不影響表達(dá)水平，而且表達(dá)水平高、表達(dá)量在20％以上，表達(dá)產(chǎn)物是水溶性，易于提取，提取純度在85％以上；而作為免疫原的SS又充分暴露，可以充分發(fā)揮SS基因的免疫原性。克服了激生2號(hào)苗的基因工程體主要以包涵體形式存在、表達(dá)產(chǎn)物難以提取的困難，并且其主基因SS之后留有一個(gè)長(zhǎng)長(zhǎng)的尾巴，影響免疫原性充分發(fā)揮的缺陷。
2)用本發(fā)明新構(gòu)建的基因工程體E.coli-SS 1a/TRX、E.coli-SS 2b/TRX和E.coli-SS2c/GST(3株)分別用于生產(chǎn)3種生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗，——激生3號(hào)a型、b型和c型。其基因工程體表達(dá)產(chǎn)物為水溶性，提取和純化方便，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。用于免疫動(dòng)物，增重20％以上，效果顯著，安全性高，無激素和藥物殘留，可用以替代促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的化學(xué)添加劑，無任何潛在危險(xiǎn)。
3)用本發(fā)明新構(gòu)建的基因工程體(3株)分別用于生產(chǎn)3種生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗，——激生3號(hào)a型、b型和c型。它們都是以SS為主基因，其基本設(shè)計(jì)相似而又功能互補(bǔ)。激生3號(hào)苗a型和b型是將單價(jià)SS基因或雙價(jià)SS基因分別插入除去長(zhǎng)尾的TRX基因，構(gòu)建成表達(dá)水平高、表達(dá)產(chǎn)物是水溶性、易于提取，而作為免疫原的SS又充分暴露的新型基因工程體。通常，疫苗在做動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)，檢測(cè)抗體是一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。常規(guī)的檢測(cè)SS抗體方法是用純品SS交聯(lián)BSA、OVA等載體蛋白作為包板抗原，用ELISA測(cè)定SS抗體。但SS價(jià)格十分昂貴，為此本發(fā)明設(shè)計(jì)了激生3號(hào)苗c型，將雙價(jià)SS基因插入谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)為載體蛋白的pGEX-6p-1質(zhì)粒中，該系統(tǒng)表達(dá)水平也較高。這樣可用c型苗的表達(dá)產(chǎn)物包板，檢測(cè)a型和b型的SS抗體，反之亦可用a型、b型的表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)c型苗的SS抗體。
4)本疫苗既能用于家畜，也能用于家禽；并可多次接種，加強(qiáng)免疫；可以單獨(dú)應(yīng)用，也可與激生1號(hào)苗聯(lián)合應(yīng)用；既能提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量，還能提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼養(yǎng)成本，其應(yīng)用前景十分廣闊。
圖1 生長(zhǎng)抑素免疫調(diào)控原理圖SSV-1 激生1號(hào)疫苗 SSV-3 激生3號(hào)疫苗SSAbSS抗體 SS生長(zhǎng)抑素GH 生長(zhǎng)激素GHRH 生長(zhǎng)激素釋放激素SM 生長(zhǎng)介素DA神經(jīng)遞質(zhì)圖2 SS-N/X(激生2號(hào)苗)融合蛋白的三維結(jié)構(gòu)1 TRX硫氧還蛋白2 SS生長(zhǎng)抑素3 TRX長(zhǎng)尾圖3 SS 1a/TRX融合蛋白的三維結(jié)構(gòu)1 TRX硫氧還蛋白2 SS生長(zhǎng)抑素圖4 SS 2b/TRX融合蛋白的三維結(jié)構(gòu)1 TRX硫氧還蛋白2 SS生長(zhǎng)抑素 2′ SS生長(zhǎng)抑素圖5 SS的三維結(jié)構(gòu)圖6 SS 1a/pET32c重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖7 SS 1a/pET32c重組質(zhì)粒的酶切鑒定1 Marker2重組質(zhì)粒+NcoI3重組質(zhì)粒+XhoI 4重組質(zhì)粒+EcoRI5重組質(zhì)粒對(duì)照?qǐng)D8 SS 1a/TRX融合蛋白的表達(dá)水平1蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)2-5誘導(dǎo)后的菌體裂解液，加樣量分別為200μl、100μl、80μl和50μl圖9 SS 2b/pET32c重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖10 SS 2c/pGEX-6P-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建實(shí)施例總體設(shè)計(jì)和技術(shù)路線SS是由14個(gè)氨基酸組成的短肽，共遺傳保守性很強(qiáng)，各種鳥類和哺乳動(dòng)物之間無種屬差異。因其分子量較小，必需與載體蛋白連接形成SS-載體融合蛋白才有免疫原性。因此只須構(gòu)建能高效表達(dá)SS融合蛋白的基因工程體，即可用其表達(dá)產(chǎn)物制備SS亞單位苗，用于各種家畜和家禽的免疫。
SS的氨基酸序列如下其三維結(jié)構(gòu)見圖5 選擇表達(dá)系統(tǒng)和最佳插入位點(diǎn)是技術(shù)關(guān)鍵。為保障本研究目標(biāo)的順利完成我們選用了pET32系統(tǒng)，載體蛋白為硫氧還蛋白(TRX)和pGEX-6P-1系統(tǒng)，其載體蛋白為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)。
為使SS基因在大腸桿菌中高產(chǎn)表達(dá)，以天然SS氨基酸序列為標(biāo)準(zhǔn)，將大腸桿菌使用頻率低的4個(gè)密碼子(AAG、ACT、ACA和TGT)分別更換成使用頻率較高的密碼子(AAA、ACC、ACC、和TGC)，設(shè)計(jì)SS基因如下1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser CysGCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTC ACC TCC TGC本發(fā)明SS基因工程亞單位疫苗(激生3號(hào)系列疫苗)的基因工程體構(gòu)建的技術(shù)路線為人工合成單價(jià)SS基因或雙價(jià)SS基因→插入pET32c或pGEX-6P-1→轉(zhuǎn)化感受大腸桿菌→重組質(zhì)粒的酶切鑒定→重組質(zhì)粒的序列測(cè)定→完成基因工程體構(gòu)建。
基因設(shè)計(jì)的通式為5’-保護(hù)性堿基—內(nèi)切酶—框架保證堿基—單價(jià)SS基因或雙價(jià)SS基因—終止子—內(nèi)切酶—保護(hù)性堿基—3’實(shí)施方法1.E.coli-SS 1a/TRX基因工程體構(gòu)建1.1單價(jià)SS基因的人工合成合成兩端有NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)的正負(fù)2條核苷酸鏈正鏈5’CATGGGA GCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTCNcoIAAC TCC TGCTAA TGAAC 3’終止子負(fù)鏈3’CCTCGACCGACGTTTTTGAAGAAGACCTTTTGGAAGTTGAGGACGATT ACTTGA GCT5’終止子XhoI退火后即可直接插入Ncol和XhoI酶解的pET32c質(zhì)粒，構(gòu)建激生3號(hào)苗a型的基因工程體-Ecoli-SS 1a/TRX。見圖6。1.2 SS基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建1.2.1 單價(jià)SS基因的重組和重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.2.1.1 SS基因片段的退火合成的單價(jià)SS基因的正鏈和負(fù)鏈，分別用滅菌超純水溶解成濃度為100pmol/μl的溶液，各取2μl，加入72μl的滅菌超純水中混勻，置沸水浴中2min后，緩緩冷卻至室溫。1.2.1.2 pET32c質(zhì)粒的提取，酶切及回收pET32c質(zhì)粒的提取參照[美]J薩姆布魯克等著，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)》上介紹的方法進(jìn)行。
用NcoI及XhoI對(duì)pET32c質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，具體方法參照TakaRa公司限制酶使用方法說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系如下NcoI 1μlXhoI 1μl10×bufferk 2μl0.1％BSA 10μlpET32c10μl(約10μg)滅菌超純水定容量 20μl上述混合物于37℃水溶中，反應(yīng)1h。取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(含EB)凝膠電泳，在紫外燈下切下酶切大片段，置液氮中5min，然后置37℃水浴中溶化，10000r/min離心10min，吸上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.1.3連接DNA連接反應(yīng)參照TaKaRa公司連接試劑盒使用說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系如下PET32c雙酶回收產(chǎn)物2.5μl人工合成的SS基因 6.5μl10DNA連接緩沖溶液110μl上述混合物16℃反應(yīng)5h后，所獲得的重組質(zhì)粒(SS/pET32c)，即可用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。1.2.1.4轉(zhuǎn)化取上述連接后的重組質(zhì)粒(SS/pET32c)5μl轉(zhuǎn)化100μl大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，具體操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》方法進(jìn)行。取200μl轉(zhuǎn)化物涂布含Amp50ug/μl的LB瓊脂平板。同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞(陽性對(duì)照)和pET32c質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照(陽性對(duì)照)，接種后平板置37℃培養(yǎng)18h。1.2.1.5重組質(zhì)粒的酶切鑒定NcoI和XhoI在pET32c質(zhì)粒多酶切位點(diǎn)的最外側(cè)，其間尚有EcoRI、HandIII等位點(diǎn)。當(dāng)pET32c質(zhì)粒插入SS基因后，EcoRI和HindIII 2個(gè)位點(diǎn)應(yīng)該消失，而NcoI和XhoI酶切位仍然存在。據(jù)此原理，挑取轉(zhuǎn)化后的單個(gè)菌落，接種含Amp的LB肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，取質(zhì)粒分別用HindIII、EcoRI、NcoI和XhoI進(jìn)行單酶切。HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)消失，而NcoI和XhoI仍存在表明克隆成功。見圖7。1.2.1.6重組質(zhì)粒的序列分析挑選經(jīng)酶切鑒定后的重組質(zhì)粒，由上海博采生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，其中第514～580bp即SS基因，與原設(shè)計(jì)完全符合，證明克隆正確。SS/pET32c重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，所轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌(Ecoli-SS1a/TRX)即可用于生產(chǎn)激生3號(hào)疫苗a型。其表達(dá)產(chǎn)物為SS1/TRX融合蛋白。1.3重組大腸桿菌(基因工程體)的表達(dá)1.3.1搖瓶培養(yǎng)表達(dá)挑取重組大腸桿菌(Ecoli-SS 1 a/TRX)單菌落，接種3ml含Amp(70μg/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃震搖過夜。次日按5％比例接種30ml的LB培養(yǎng)基中，于37℃震搖培養(yǎng)3.5～4h，取樣測(cè)OD600至0.5左右，取出1ml至Eppendorf管中，10000r/min離心1min，棄上清，沉淀菌體置-20℃保存?zhèn)溆茫鳛檎T導(dǎo)前對(duì)照。其余培養(yǎng)物加入濃度為1mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3～4h，同上法取1ml誘導(dǎo)后菌液離心收集菌體，供表達(dá)水平的檢測(cè)。
用250L發(fā)酵罐，加200LLB培養(yǎng)基，按2％的量接種種子液，37℃發(fā)酵2h，OD600達(dá)0.9時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h，OD600達(dá)1.2時(shí)，離心收獲菌體，經(jīng)SDS-PAGE和灰度掃描，SS/TRX融合蛋白表達(dá)量達(dá)25％。用滲透休克法提取SS/TRX融合蛋白，一次性地獲得SS/TRX融合蛋白150g，純度在85％以上。1.3.2表達(dá)水平的測(cè)定取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌體，用少量無菌PBS重懸，再加等體積的2×載樣緩沖液，置沸水中煮沸5min，各取10μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)(R250)染色，脫色后用凝膠灰度掃描儀測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)含量。在分子量18.5KD左右出現(xiàn)一條SS/TRX融合蛋白主帶，表達(dá)量達(dá)20％以上。見圖8。1.4疫苗制備和免疫小試收獲的SS/TRX融合蛋白按常規(guī)方法配成油乳苗，使融合蛋白的含量為0.4mg/ml，即激生3號(hào)苗a型。用于免疫架子豬90頭，肌肉注射1ml/頭；40d后加強(qiáng)免疫一次，觀察3個(gè)月，平均提高日增重12％。免疫1kg左右體重幼兔20只，肌注0.1ml/只，間隔40d，加強(qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)免疫2次，觀察至140d時(shí)，試驗(yàn)兔提高日增重20％，效果顯著，并且比激生1號(hào)苗更為安全。2.E.coli-SS 2b/TRX基因工程體構(gòu)建2.1雙價(jià)SS基因的人工合成為保證2個(gè)SS的立體構(gòu)型不互相干擾，在二者之間插入一個(gè)6個(gè)氨基酸的連接肽。2.1.1用于插入pET32c質(zhì)粒的雙價(jià)SS(b型)基因按上述通式設(shè)計(jì)雙價(jià)SS基因如下5’-CATGCCATGGCT ATG GCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACCNcoITTC ACC TCC TGCGCC CTG CTG ATC GCC GTTGCT GCC TGC AAA AAC連 接 肽TTC TTC TGG AAA ACC TTC ACC TCC TGCTAA TGACTC GAGCGG-3，終止子 XhoI
合成正鏈、負(fù)鏈2條中間互補(bǔ)的基因片段如下正鏈5’-CATGCCATGGCT ATG GCT GGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACCNcoITTC ACC TTC TGC GCC CTG CTG ATC GCC GTT GCT GGC TGC AAA-3’負(fù)鏈5’-CCGCTCGAGTCATTAGCA GGA GGT GAA GGT TTT CCA GAA GAAXhoI終止子GTT TTT GCA GCC AGC AAC GGC GAT CAG CAG GGC GCA GGA GGT GAA-3’退火、延伸、補(bǔ)齊后、獲得上述設(shè)計(jì)的雙價(jià)SS基因，經(jīng)Ncol+XhoI雙酶切后插入經(jīng)相同酶切的pET32c質(zhì)粒后轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌即獲得可用于生產(chǎn)激生3號(hào)苗b型的基因工程體Ecoli-SS 2b/TRX。見圖9。2.2雙價(jià)SS2b型基因克隆和重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.2.1雙價(jià)SS2b型基因片段的退火、延伸、補(bǔ)齊人工合成雙價(jià)SS2b型基因的2條核甘酸鏈按2.1.1所述方法退火。先按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南上介紹的方法》配制10×dsDNA合成反應(yīng)緩沖液，然后按下法配制反應(yīng)液退火后的DNA片段 50μl10×dsDNA合成反應(yīng)緩沖液 10μl10mmol/L dNTP10μl滅菌超純水 8.5μlDNA聚合酶1 Klenew片段1.5μl混勻后，置37℃水浴1.5h，將該DNA片段延伸、補(bǔ)齊。然后再加入5mmol/L NaCl6μl，無水乙醇300μl，置冰浴中過夜，12000g離心15min，取沉淀，再加入預(yù)冷的70％乙醇200μl，混勻，同上法離心，取沉淀懸浮于20μl pH8.0的TME緩沖液中。即獲得按設(shè)計(jì)要求的雙價(jià)SS2b型基因。-20℃凍存?zhèn)溆谩?.2.2雙價(jià)SS2b型基因的酶切。
回收的雙價(jià)SS2b型基因用NcoI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后，即可直接用于連接反應(yīng)。2.2.3 pET32c質(zhì)粒的提取，酶切和回收質(zhì)粒的提取按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行，用NcoI和XhoI雙酶切。取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，回收酶切大片段，置液氮中冷凍10min，然后置37℃水浴中融化，10000r/min離心10min，吸取上清，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?.2.4連接按DNA連接試劑盒說明書進(jìn)行，其反應(yīng)體系如下pET32c雙酶切回收產(chǎn)物 2.5μl雙價(jià)SS基因雙酶切回收產(chǎn)物 6μlDNA連接溶液1 1.5μl混勻后，置16℃反應(yīng)5小時(shí)后，立即用于轉(zhuǎn)化。2.2.5感受態(tài)細(xì)胞的制備參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。2.2.6轉(zhuǎn)化取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，具體操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行。
取200μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布含Amp 50μg/ml的LB瓊脂平板，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌作對(duì)照(陰性對(duì)照)，接種后置37℃溫箱，培養(yǎng)18h。2.2.7重組質(zhì)粒的酶切鑒定同2.1.5挑選轉(zhuǎn)化后的單個(gè)菌落接種含Amp的LB肉腸培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒。圖示HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)消失，而NcoI和XhoI仍存在表明克隆成功。用HindIII、EcoRI、NcoI和XhoI單酶切。2.2.8重組質(zhì)粒的序列分析經(jīng)篩選獲得的陽性重組質(zhì)粒，由上海博采生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定。表明雙價(jià)SS2b型基因已正確插入pET32c質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，新轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌(Ecoli-SS 2b/TRX)即可用于生產(chǎn)激生3號(hào)苗b型。其表達(dá)產(chǎn)物為SS2b/TRX，三維結(jié)構(gòu)見圖4。3 E.coli-SS 2c/GST基因工程體構(gòu)建3.1 用于插入pGEX-6P-1質(zhì)粒的雙價(jià)SS(C型)基因的人工合成同上法設(shè)計(jì)雙價(jià)SS基因如下5’-AATGGATCCGCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTC ACCBamHITCC TGC GCC CTG CTG ATC GCC GTT GCT GGC TGC AAA AAC TTC TTCTGG AAA ACC TTC ACC TCC TGCTAATGACTC GAGATC終止子 XhoI同上法合成正鏈、負(fù)鏈2條中間互補(bǔ)的基因如下正鏈5’-AATGGATCCGCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTCBamHIACC TCC TGC GCC CTG CTG ATC GCC GTT GCT GGC TGC-3’ 退火延伸、補(bǔ)齊后，獲得上述設(shè)計(jì)的雙價(jià)SS基因，經(jīng)BamHI+XhoI雙酶切后，插入經(jīng)相同酶切的pGEX-6P-1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌即構(gòu)建成用于生產(chǎn)激生3號(hào)c型苗的基因工程體-Ecoli-SS 2c/GST。見圖10。3.2雙價(jià)SS2c型基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建3.2.1雙價(jià)SS2c型基因的退火、延伸、補(bǔ)齊雙價(jià)SS2c型基因的2條核苷酸鏈，按2.2.1方法退火、延伸、補(bǔ)齊、回收，制備成符合設(shè)計(jì)要求的雙價(jià)SS2c型基因，-20℃凍存?zhèn)溆谩?.2.2雙價(jià)SS2c型基因的酶切回收的雙價(jià)SS2c型基因用BamHI和EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后，即可直接用于連接反應(yīng)。3.2.3 pGEX-6p-1質(zhì)粒的提取，酶切和回收同2.2.3方法進(jìn)行。3.2.4連接同2.2.4方法進(jìn)行。3.2.5感受態(tài)細(xì)胞的制備同2.2.5方法進(jìn)行。3.2.6轉(zhuǎn)化同2.2.6方法進(jìn)行。3.2.7重組質(zhì)粒的酶切鑒定在pGEX-6P-1質(zhì)粒的多酶切位點(diǎn)中，在BamHI和XhoI位點(diǎn)中尚有1個(gè)SmalI位點(diǎn)。據(jù)此，如將雙價(jià)SS2c型基因片段插入該質(zhì)粒后，則SmalI位點(diǎn)消失，仍保留BamHI和XhoI位點(diǎn)。同2.1.5挑選轉(zhuǎn)化后的單個(gè)菌落，接種含Amp的LB肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，分別用BamHI、XhoI和SmalI單酶切。結(jié)果SmalI位點(diǎn)消失，而BamHI和XhoI位點(diǎn)仍保留表明克隆成功。3.2.8重組質(zhì)粒的序列分析經(jīng)篩選獲得的陽性質(zhì)粒，由上海博采生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，表明雙價(jià)SS2c型基因已正確插入pGEX-6P-1質(zhì)粒，新轉(zhuǎn)化的重組桿菌(Ecoli-SS 2c/GST)，即可用于生產(chǎn)激生3號(hào)菌c型。其表達(dá)產(chǎn)物為SS-SS/GST融合蛋白。
上述3株E.coli-1a/TRX、E.coli-SS 2b/TRX和E.coli-SS 2c/GST基因工程體，經(jīng)酶切篩選，嵌合基因的序列測(cè)定和表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析，證明其正確無誤。三者均應(yīng)用發(fā)酵工藝生產(chǎn)。a、b二型可用簡(jiǎn)易的滲透休克法，c型可用底物親和層析法提純表達(dá)產(chǎn)物，大大降低了生產(chǎn)成本。純化的表達(dá)產(chǎn)物加白油佐劑，即可分別配制成激生3號(hào)苗a、b、c 3個(gè)型的油乳苗。生產(chǎn)成本低廉，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。其中激生3號(hào)苗a型經(jīng)用豬和兔作免疫增重試驗(yàn)，效果顯著，且其安全性高，無激素和藥物殘留，可替代用于促進(jìn)家畜生長(zhǎng)的化學(xué)添加劑。本疫苗既能用于家畜，也能用于家禽；并可多次接種，加強(qiáng)免疫；可以單獨(dú)應(yīng)用，也可與激生1號(hào)苗聯(lián)合應(yīng)用；既可提高肉、乳、蛋、毛、絨(鴨絨、我絨、羊絨)等畜產(chǎn)品產(chǎn)量，還能提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。其應(yīng)用面很廣，幾乎覆蓋了整個(gè)畜牧業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域；并隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，疫苗覆蓋率的遞增產(chǎn)生的效益將會(huì)越來越大。
權(quán)利要求
1.生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗的基因工程體，系采用人工合成SS基因，分別插入不同載體蛋白表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌而成，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，序列測(cè)定，證實(shí)完全符合設(shè)計(jì)要求，生長(zhǎng)抑素基因SS的氨基酸序列如下 其特征在于，基因設(shè)計(jì)中含終止子，使SS多肽充分暴露，其設(shè)計(jì)通式為5’-保護(hù)性堿基—內(nèi)切酶—框架保證堿基—單價(jià)SS基因或雙價(jià)SS基因—終止子—內(nèi)切酶—保護(hù)性堿基—3’其中人工合成SS基因?yàn)閱蝺r(jià)SS基因或雙價(jià)SS基因，選用表達(dá)系統(tǒng)為可使SS多肽暴露的載體蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗的基因工程體，其特征在于，構(gòu)建中使用的SS多肽充分暴露的表達(dá)系統(tǒng)是以截去尾巴的硫氧還蛋白(TRX)為載體蛋白的pET32表達(dá)系統(tǒng)或其本身沒有尾巴的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)為載體蛋白的pGEX-6P-1表達(dá)系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗的基因工程體，包括用單價(jià)SS基因與截去尾巴的硫氧還蛋白(TRX)pET32表達(dá)系統(tǒng)獲得的基因工程體，分類大腸埃希氏桿菌，命名E.coli-SS 1a/TRX，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號(hào)0705用雙價(jià)SS基因與截去尾巴的硫氧還蛋白(TRX)pET32表達(dá)系統(tǒng)獲得的基因工程體，分類大腸埃希氏桿菌，命名E.coli-SS 2b/TRX，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號(hào)0707用雙價(jià)SS基因與本身沒有尾巴的pGEX-6P-1表達(dá)系統(tǒng)獲得的基因工程體，分類大腸埃希氏桿菌，命名E.coli-SS 2c/GST，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó).北京.中關(guān)村.2714信箱 郵政編碼100080保藏號(hào)0708
全文摘要
生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗的基因工程體,屬生物高新技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)品。系采用人工合成單價(jià)或雙價(jià)SS基因,分別插入pET32表達(dá)系統(tǒng)和pGEX－6P－1表達(dá)系統(tǒng)適當(dāng)位點(diǎn),轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。從而獲得E.coli－SS 1a/TRX、E.coli－SS 2b/TRX和E.coli－SS 2c/GST3株基因工程體。該基因工程體經(jīng)發(fā)酵,提取純化表達(dá)產(chǎn)物,即可配制成激生3號(hào)苗a、b、c3個(gè)型的油乳苗。本疫苗生產(chǎn)成本低廉,適于工業(yè)化生產(chǎn)。本基因工程體表達(dá)產(chǎn)物免疫原性良好,用于家畜和家禽,免疫增重效果顯著,且其安全性高,無殘留。圖為:SS 1a/pET32c重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1372000SQ0210421
公開日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2002年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月9日
發(fā)明者杜念興, 李光富 申請(qǐng)人:南京南農(nóng)高科技股份有限公司