利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，設計引物擴增擴增第九外顯子及內含子部分序列(315bp)和第九外顯子反義序列(155bp)，同時擴增sbe2b啟動子，將含有正反外顯子及內含子的整體DNA片段連同啟動子同時連入pCAMBIA3301載體的多克隆位點中；然后，將ss1啟動子片段及ss1基因cDNA片段替換MCS中含sbe2b?RNAi三片段的pCAMBIA3301載體的35S及GUS片段，因此該表達載體同時含有sbe2b啟動子控制的反義sbe2b?cDNA片段和ss1啟動子控制的ss1全長cDNA片段。本發明提供的表達載體中含有的sbe2b?RNAi片段能夠降低SBEIIb酶的活性，使淀粉合成時分支數降低，從而提高直鏈淀粉的相對含量；同時該載體中含有的ss1基因過表達片段能夠提高玉米胚乳SSI酶的活性，從而提高總淀粉含量。
【專利說明】利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，尤其涉及一種利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法。
【背景技術】
[0002]要進行目的基因介導的遺傳改良，應首先構建相應的表達載體后進行遺傳轉化。Fromm等(1986)最先開展了玉米遺傳轉化工作，利用電擊法誘導玉米原生質體吸收攜帶npt II (neomycin phosphotransferase II，氯霉素乙酰轉移酶基因)的質粒DNA,電擊處理后檢測到了該基因在玉米細胞中的表達，進一步將npt II基因轉入玉米原生質體，獲得了穩定轉化的抗性愈傷組織。Rhodes等(1988)利用電擊法將npt II酶基因轉入玉米原生質體，成功建立玉米原生質體轉化系統，首次獲得了玉米轉基因植株，但轉基因植株全部不育。1988年，Grimsly等將玉米條紋病毒基因構建到農桿菌Ti質粒上，利用農桿菌侵染玉米植株，導致了系統感染癥狀，首次證明了農桿菌可以侵染玉米細胞。1991年Gould等用根癌農桿菌與玉米莖尖共培養獲得了轉基因植株。后來Gordon-Kamm(1990)等利用基因槍介導法分別將bar基因、⑶S基因和LUC基因(luciferase gene，螢光素酶)等轉入玉米，獲得了轉基因植株。Lupotto等(2004)對農桿菌侵染后玉米愈傷組織的培養及誘導條件進了研究，并成功獲得轉化株。Ishida等(1996年)利用農桿菌介導法轉化玉米自交系A188未成熟胚，獲得了大量轉基因植株，建立了農桿菌介導法高效轉化體系，此后這一方法在玉米的遺傳轉化中得到了廣泛的應用。丁群星(1993)等利用微玻璃針注射授粉后10-20h的玉米子房，將蘇云金芽孢桿菌(Bt)殺蟲蛋白基因轉入玉米，獲得可育的轉基因植株。周逢勇王國英等(1998)博士在國內率先建立了玉米的基因槍和農桿菌轉化體系，將Bt殺蟲蛋白基因轉入玉米，獲得抗蟲轉基因玉米植株。綜上所述，雖然在玉米轉化中采用的方法有電擊法、基因槍介導法、超聲波法、微注射法、PEG法和農桿菌介導法等，但基因槍介導法和農桿菌介導法應用的最為成功，技術已相當成熟。授粉后18天左右的幼胚是普遍采用的受體材料，再生能力強，轉化效果好 。對農桿菌介導法而言，適宜轉化的玉米基因型還比較有限，適宜的農桿菌菌系有C58C1和LBA4404，共培養基中加入適量的乙酰丁香酮(AS)、脯氨酸、谷氨酰胺等物質，有利于農桿菌侵染玉米幼胚和提高轉化效率。
[0003]基因工程改變淀粉主要集中于淀粉含量及品質。在淀粉含量方面主要集中對ADPGPPase焦磷酸化酶基因的操作上，Stark等人(1992)利用突變的大腸桿菌菌株618來源的ADPGPPase基因glgC16 (對變構調節不敏感)加上不同的啟動子，構建植物表達載體，轉化到煙草的愈傷組織中，獲得了大量轉基因煙草愈傷組織。淀粉含量分析表明，轉基因煙草淀粉平均值占干重的10.7 %。有些轉基因煙草淀粉干重高達27%，而對照非轉基因煙草卻僅含3.4%的淀粉。用上述表達載體進一步轉化馬鈴薯，成功地獲得了轉化植株，在轉化植株中，淀粉含量平均提高了 35%。在減少淀粉含量方面，Muller-Rober等人(1992)利用含有不同啟動子和反向連接的ADPGPPase大、小亞基cDNA基因構建表達載體，轉化馬鈴薯，在35S加上反向連接的ADPGPPase大亞基cDNA的融合基因轉化植株中，葉片的ADPGPPase活性僅為野生型的5% -30%，塊莖中ADPGPPase活性僅為野生型的2%，分析轉化植株淀粉含量，結果表明轉化植株塊莖淀粉含量僅為野生型的5% -3.5%，伴隨著淀粉含量的下降，轉化植株細胞內可溶性糖顯著升高蔗糖和葡萄糖分別占塊莖干重的30%和8%。Wang等(2007)把來自于大腸桿菌的glgC16基因轉化到玉米中，提高了籽粒中ADPGPPase活性，增加了籽粒重量。在改變淀粉含量的研究之中，多數是針對ADPGPPase的，反映出ADPGPPase在控制淀粉合成速率方面的重要性，但值得指出的是，并非淀粉合成速率僅受AGPPase控制，在玉米中SSS(Soluble starch synthase,可溶性淀粉合成酶)或SBE的作用也相當明顯(Jenner，1993)，對它們的表達進行研究，對于提高淀粉含量也具有重要意義。
[0004]目前通過分子生物學技術進行遺傳改良以提高作物籽粒直鏈淀粉含量的方法主要是利用RNAi技術抑制淀粉分支酶基因的表達，以提高作物籽粒中的直鏈淀粉相對含量。國際專利W09722703A2報道了用玉米的sbe2b轉化玉米的研究，把sbe2b的cDNA基因或部分片斷正向或反向置于玉米zein蛋白啟動子(胚乳特異性啟動子)控制下，組成一系列植物表達載體轉化玉米，成功地獲得了轉基因植株。在轉化sbe2b基因3’部分序列反義結構的轉基因玉米中內源sbe2b基因受到了抑制，轉基因玉米淀粉粒中較長糖鏈增加了近2倍。在5’部分序列反義結構表達載體以及sbe2b基因全長cDNA反義結構表達載體中也獲得了類似的結果。近年來研究表明=RNAi技術是更有效地抑制基因表達的方法之一，抑制效率和抑制效果均高于反義 RNA 技術(Smith et al, 2001 ；ffesley et al.2001 ；Stout jesdi jket.al，2002)。柴曉杰等(2005)克隆玉米淀粉分支酶基因，并構建高效的RNAi表達體系，通過花粉管通道法將其導入玉米自交系，抑制淀粉分支酶基因的表達，提高玉米直鏈淀粉的含量。Li JH等(2007)對玉米淀 粉分支酶突變體研究中發現淀粉分支酶的失活可以顯著增加直鏈淀粉含量。
[0005]玉米籽粒淀粉合成相關酶類往往形成特定的功能復合體，以一個整體結構參與淀粉合成。利用RNA干涉或反義RNA技術降低了淀粉分支酶基因的表達，導致籽粒中直鏈淀粉的相對含量(直支比)升高，但由于功能復合體構象發生了改變，導致其它相關蛋白的活性下降，導致總淀粉含量降低；同時由于RNAi技術使sbe2b基因不能正常表達，減少了淀粉合成過程中葡聚糖非還原末端，也引起SSI等關鍵酶活性的下降，造成糖鏈延長末端不足，引起整個淀粉合成速度的降低，減少了總淀粉含量。

【發明內容】

[0006]針對由于RNAi技術使sbe2b基因不能正常表達，同時也引起SSI等關鍵酶活性的下降，本發明旨在通過構建含有sbe2b啟動子控制的反義sbe2b cDNA片段和ssl啟動子控制的ssl全長cDNA片段的植物表達載體，在提高直鏈淀粉含量的同時使總淀粉含量得到一定的提聞。
[0007]本發明實施例是這樣實現的，一種利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，其特征在于，該構建方法包括:
[0008]sbe2b RNAi載體的構建:玉米sbe2b基因在胚乳中特異表達，因此我們選用sbe2b啟動子驅動干涉片段的表達。通過對sbe2b基因進行在線同源比對，發現其第九外顯子特異性較高，因此我們設計引物擴增第九外顯子及內含子部分序列(315bp)和第九外顯子反義序列(155bp)，同時擴增sbe2b啟動子，將上述三片段同時連入pCAMBIA3301載體的多克隆位點(MCS)中。
[0009]ssl過表達載體的構建:利用ssl基因啟動子驅動玉米ssl基因的表達，將ssl啟動子片段及ssl基因cDNA片段替換MCS中含sbe2b RNAi三片段的pCAMBIA3301載體的35S及⑶S片段，因此該表達載體同時含有sbe2b啟動子控制的反義sbe2b cDNA片段和ssl啟動子控制的ssl全長cDNA片段。
[0010]sbe2b RNAi載體的構建方法包括:
[0011]①sbe2b啟動子擴增；
[0012]②sbe2b第九外顯子正反片段及內含子擴增；
[0013]③質粒提取及酶切；
[0014]進一步，sbe2b啟動子擴增，引物自行設計，結構為:
[0015]Psbe2b-F:aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG
[0016]Psbe2b-R: gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG
[0017]PCR反應體系及程序如下:
[0018]將擴增片段經過電泳膠回收后連接入pMD19-T載體并轉化大腸桿菌DH5a細胞，挑取陽性克隆并測序驗證。
[0019]進一步，sbe2b第九外顯子正反片段及內含子擴增，引物自行設計，結構為:
[0020]正義第九外顯子及內含子部分序列315bp:
[0021]2b315-F: gaattcTTCATGACATCTGATCACCAG
[0022]2b315-R: ggatccGAATTGCTGACACCAACAGCT
[0023]第九外顯子反義序列155bp:
[0024]2bl55-F:ggatccTTATACACCCCAGGCTTTCGAC
[0025]2bl55-R:cccgggTTCATGACATCTGATCACCAG
[0026]PCR及后續T載體克隆實驗見①sbe2b啟動子擴增。
[0027]進一步，質粒提取及酶切，sbe2b啟動子用HindIII及EcoRI雙酶切；正義第九外顯子及內含子部分序列315bp,用EcoRI及BamHI雙酶切；反義序列用BamHI及SmaI雙酶切；經改造MCS中含NOS終止子的pCAMBIA3301載體用HindIII及SmaI雙酶切。
[0028]進一步，ssl過表達載體的構建方法為:
[0029]①ssl基因及啟動子克隆；
[0030]②質粒提取及酶切。
[0031]進一步，ssl基因及啟動子克隆，ssl啟動子引物，:根據課題組首次克引物為:
[0032]Pssl-F:aagcttACGCTGCAGCGAGAGGCGGGATC
[0033]Pssl-R:ggatccTGCGGAGAGGGAGAGCAGACAG
[0034]ssl基因編碼區引物:
[0035]ssl-F:ggatccATGGCGACGCCCTCGGCCGTGG
[0036]ssl-R:cacgtgTTACATGACATAGGGTCGATC。
[0037]進一步，質粒提取及酶切，ssl啟動子用HindIII及BamHI雙酶切，ssl基因用BamHI及PmaCI雙酶切。
[0038]本發明提供的表達載體中含有的sbe2b RNAi片段能夠降低SBEIIb酶的活性，使淀粉合成時分支數降低，從而提高直鏈淀粉的相對含量；同時該載體中含有的ssl基因過表達片段能夠提高玉米胚乳SSI酶的活性，從而提高總淀粉含量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1是本發明實施例提供的RNAi載體構建相關片段的酶切電泳圖；
[0040]圖2是本發明實施例提供的ssl過表達載體相關片段的酶切電泳圖；
[0041]圖3是本發明實施例提供的同時含有sbe2b啟動子控制的反義sbe2b cDNA片段和ssl啟動子控制的ssl全長cDNA片段的完整載體圖(pSSIRNAi)。
【具體實施方式】
[0042]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0043]本發明實施例選用植物表達載體pCAMBIA3301進行目的載體的構建。具體敘述如下:
[0044](I) sbe2b RNAi 載體的構建。
[0045]①sbe2b啟動子擴增
[0046]引物自行設計，由上海英駿公司合成:
[0047]Psbe2b-F:aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG`[0048]Psbe2b-R: gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG
[0049]PCR反應體系及程序見下:
[0050]表1PCR 反應體系(20 μ L)
體系成分體積[_]KOD DNA 襲各每0.4 ML
K0D 而。3 μ?
2 X KOD buffer10 μ L
Psbe2b-F Primer0.6 μ L
[0052]
Psbe2b-R Primer0.6 μ L
基因組DNA模板I μ L
CidH2O4.4 μ L
[0053]表2PCR反應程序
【權利要求】
1.一種利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，其特征在于，該構建方法包括: sbe2b RNAi載體的構建:玉米sbe2b基因在胚乳中特異表達，選用sbe2b啟動子驅動干涉片段的表達，通過對sbe2b基因進行在線同源比對，發現其第九外顯子特異性較高，因此我們設計引物擴增第九外顯子及內含子部分序列315bp和第九外顯子反義序列155bp，同時擴增sbe2b啟動子，將上述三片段同時連入pCAMBIA3301載體的多克隆位點MCS中；ssl過表達載體的構建:利用ssl基因啟動子驅動玉米ssl基因的表達，將ssl啟動子片段及ssl基因cDNA片段替換MCS中含sbe2b RNAi三片段的pCAMBIA3301載體的35S及⑶S片段，因此該表達載體同時含有sbe2b啟動子控制的反義sbe2b cDNA片段和ssl啟動子控制的ssl全長cDNA片段。
2.如權利要求1所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，其特征在于，sbe2b RNAi載體的構建方法包括: ①sbe2b啟動子擴增； ②sbe2b第九外顯子正反片段及內含子擴增； ③質粒提取及酶切。
3.如權利要求2所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，其特征在于，sbe2b啟動子擴增，引物自行設計，結構為:
Psbe2b-F:aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG
Psbe2b-R:gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG
PCR反應體系及程序如下:` 將擴增片段經過電泳膠回收后連接入PMD19-T載體并轉化大腸桿菌DH5a細胞，挑取陽性克隆并測序驗證。
4.如權利要求2所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，其特征在于，sbe2b第九外顯子正反片段及內含子擴增，引物自行設計，結構為: 正義第九外顯子及內含子部分序列315bp:
2b315-F:gaattcTTCATGACATCTGATCACCAG
2b315-R:ggatccGAATTGCTGACACCAACAGCT
第九外顯子反義序列155bp:
2bl55-F:ggatccTTATACACCCCAGGCTTTCGAC
2bl55-R:cccgggTTCATGACATCTGATCACCAG PCR及后續T載體克隆實驗見①sbe2b啟動子擴增。
5.如權利要求2所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，其特征在于，質粒提取及酶切，sbe2b啟動子用HindIII及EcoRI雙酶切；正義第九外顯子及內含子部分序列315bp,用EcoRI及BamHI雙酶切；反義序列用BamHI及SmaI雙酶切；經改造MCS中含NOS終止子的pCAMBIA3301載體用HindIII及SmaI雙酶切。
6.如權利要求1所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，其特征在于，ssl過表達載體的構建方法為: ①ssl基因及啟動子克?。? ②質粒提取及酶切。
7.如權利要求6所述的利用基因工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，其特征在于，ssl基因及啟動子克隆，ssl啟動子引物，:根據課題組首次克引物為:
Pssl-F:aagcttACGCTGCAGCGAGAGGCGGGATC
Pssl-R:ggatccTGCGGAGAGGGAGAGCAGACAG
ssl基因編碼區引物:
ssl-F:ggatccATGGCGACGCCCTCGGCCGTGG
ssl-R:cacgtgTTACATGACATAGGGTCGATC。
8.如權利要求6所述的利用基因 工程提高玉米直鏈淀粉含量的雙元載體構建方法，其特征在于，質粒提取及酶切，ssl啟動子用HindIII及BamHI雙酶切，ssl基因用BamHI及PmaCI雙酶切。
【文檔編號】C12N15/82GK103484494SQ201210334553
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年9月12日 優先權日:2012年9月12日
【發明者】黃玉碧, 李煬平, 張軍杰, 劉漢梅, 胡育峰, 顧勇, 劉應紅 申請人:四川農業大學