專利名稱：固定化脂肪酶催化合成脂肪酸低碳醇酯的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物化工，具體地說是一種用固定化微生物脂肪酶在非水相體系催化脂肪酸和醇反應合成酯的方法。
背景技術：
脂肪酸酯是日用化工許多行業如食品、紡織、塑料、化妝品等常用的化學物質。脂肪酸低碳醇酯是是其中一類重要的工業添加劑和表面活性劑。短鏈脂肪酸芳香酯是合成香料的重要組成部分和白酒調香的主要原料。而棕櫚酸異辛酯、異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯以及硬脂酸辛酯等長鏈脂肪酸的低碳醇酯則是高檔化妝品的重要油性原料。此類長鏈脂肪酸酯與皮膚相容性好，具有良好的滋潤與軟化作用，廣泛用于浴用制品，發用制品，美容品，剃須品，護膚品，抑汗祛臭劑，防曬制品等個人護理用品中。其中棕櫚酸異辛酯還可用作塑料行業中的增塑劑、潤滑劑等。脂肪酸甲酯，脂肪酸乙酯則是可生物降解、空氣污染物排放低的可再生的“生物柴油”等等。但長期以來，工業上脂肪酸酯均是通過化學法來生產。即用無機催化劑如濃硫酸、苯磺酸等在高溫高壓下催化酸醇的酯化反應來完成。雖然產率較高，但也存在許多難以克服的缺點。如高溫高壓反應能耗高、副反應多，產物色澤深、分離和精制困難等，而且酸對設備腐蝕嚴重，不利于生產。隨著生物技術的發展，特別是酶工程的研究，為生物催化劑合成脂肪酸酯提供了新的方法。與傳統的化學法相比，酶法合成具有反應條件溫和，特異性強，副反應少，產物品質高等特點。特別是非水相中脂肪酶促反應，拓寬了酶的應用范圍和領域，成為年來酶學研究的熱點。
眾多的研究報道和綜合評述都展示了非水相中的酶優于水中的酶。有機溶劑能保持一個較低的水分活度，可以降低酯化和水解反應的熱動力學和動力學障礙。而且有機底物在有機溶劑中較高的溶解度可以提高反應速度。因此，在非水體系中的酯化反應可實現高轉化率，從而簡化分離工藝。
根據國內外脂肪酶催化脂肪酸酯合成的技術報道，“微生物脂肪酶催化酯的合成”CN 1223300A(1999)報道了以脂肪醇、脂肪酸為底物，游離的的脂肪酶為催化劑，在15℃～40℃條件下，于有機溶劑中催化脂肪酸脂的合成。該方法所用脂肪酶是用華根霉生產，反應為分批操作，在攪拌罐中進行。10～36hr底物轉化率可達95％。反應結束后，過濾分離脂肪酶和反應液，減壓蒸餾得到產物酯。與使用固定化酶相比較，游離酶在有機溶劑中易聚集結塊，重復利用率低，酶活損失大的缺點。同時該方法使用庚烷作有機溶劑提高了生產成本。另外，CN 1308129報道了在無溶劑體系中，用固定化根霉脂肪酶、假絲酵母脂肪酶催化失水山梨醇單油酸酯的合成，但無溶劑體系對于不溶性底物如互不相溶的酸和醇，則會影響傳質而降低反應的效率。
EP 0383405A1(1990)，報道了用商品化脂肪酶如用顆粒狀樹脂固定化的假絲酵母脂肪酶NOVO CP382，固定化米黑毛霉脂肪酶NOVO SP392，催化脂肪酸酯合成的方法。該方法的特點是在無溶劑條件進行，利用酯化反應中生成的水與反應底物之一的醇形成共沸物的性質，在5000～50000Pa壓力、溫度低于80℃條件下，將反應中生成的水移出，24hr底物轉化率可達97％以上。但是也存在不足之處，如由于反應過程中醇也不斷被移出，導致反應體系中底物減少，必須向反應體系中補加醇。而且對于形成較高共沸點的醇-水共沸物，溫度的升高會導致酶活性和穩定性的降低，該方法將酶反應柱與蒸餾設備分離，在不同的溫度下操作，增加了能耗和設備及操作的復雜性。
劉俊康等人(2000)研究了以AOT(二(2-乙基己基))/琥珀酸酯磺酸鈉/正庚烷/水/明膠組成的反膠團體系固定化脂肪酶，將固定化酶填充在內徑1.8cm的層析柱中催化長鏈脂肪酸酯的合成，所用有機溶劑為庚烷。25℃下，反應酯化率可達90％。反膠團固定化酶活性保持時間長，但對于親水性較強乙醇、丙醇等能和水混溶，并進入凝膠的微乳液滴中，對酶分子的結構和活性產生影響，導致反應速度慢，轉化率低。而且管式反應器也存在底物流速低，處理量小的不足。
Leite等人(1998)研究了固定化米黑毛霉脂肪酶催化的酯化反應。以異辛烷為溶劑通過滲透蒸發膜移走反應中生成的水。Bufeiend等人(1999)研究了中空纖維膜反應器，以辛烷為溶劑，通過將底物循環反應合成長鏈脂肪酸酯。膜反應器催化效率高，能選擇性移走反應中生成的水，但膜反應器也存在造價高，操作復雜、膜易堵塞等問題。

發明內容本發明的目的是提供了一種利用固定化脂肪酶合成脂肪酸低碳醇酯的方法。
本發明的技術方案包括將脂肪酶和共固定劑共同固定在惰性載體膜或紡織品膜上制成固定化酶，再將固定化酶固定于不銹鋼絲網中并置于酶反應器內催化脂肪酸酯的合成。
本發明的效果是(1)固定化膜載體的存在防止了酶分子在有機溶劑中的聚集作用，提高了酶分子的擴散效果，增大了催化面積。(2)共固定劑有效地改善了固定化載體的親水和疏水特性，為酶和底物之間的作用提供了良好的微環境，從了大大提高了酶的催化活性。(3)通過將固定化酶固定在金屬絲網中，金屬絲網卷曲成螺旋板狀增大了酶反應器中的催化面積，在反應過程中可及時加入吸水劑除去反應生成的水。(4)反應結束后，固定化酶也易于與反應液和吸水劑分離，有利于回收復用和連續化生產。(5)對于固體底物本發明采用價廉的石油餾份作溶劑，降低了生產成本。
由本發明得到的產品色澤淺，品質高，低成本，從而為脂肪酸酯的工業化生產提供了一種新方法。
主要技術內容如下1.脂肪酶的固定化固定化載體先用共固定劑活化。將固定化載體和共固定劑按質量體積比1∶1～1∶3的比例混合(W∶V)，室溫晾干。脂肪酶溶液按1000～30000單位/克載體的比例與活化后的固定化載體混合，晾干待用。
2.脂肪酸脂的合成將底物脂肪酸和醇按摩爾比1∶1～1∶3的比例加入含有有機溶劑的酶反應器中。加入固定化酶開始反應。在20-60℃的條件下，振蕩或攪拌反應14-24小時，轉化率可達90-97％，在反應4-10hr時加入分子篩或變色硅膠除去反應中生成的水，可加快反應到達平衡的時間。反應結束后，固定化酶可以直接與反應液分離，用少量的有機溶劑洗滌后可再次使用。反應液經5％NaCO3稀溶液洗滌、過濾后在真空度0.05-0.08MPa條件下減壓蒸餾，蒸發出反應媒體有機溶劑，得到產物酯。蒸發出的溶劑經過冷凝后可回收復用。
3.載體活化時所用的共固定物包括高分子化合物、油脂、表面活性劑、蛋白質和無機離子等物質。其組成包括聚乙二醇、Tween和span系列、明膠、卵磷脂等。
4.本發明所用的脂肪酶為固定化假絲酵母脂肪酶、固定化青霉脂肪酶、和酯酶。選用的固定化載體為紡織品，如膜等。固定化酶膜具有表面積大、吸附性強、價格便宜、穩定性好以及以重復利用的特點。
5.在酶反應器中，固定化膜載體被固定在不繡鋼絲網中。不銹鋼絲網置于反應器內或卷曲成螺旋板狀置于反應器中，反應結束后可直接與反應液分離，經有機溶劑洗滌后，可再次用于催化反應。
本發明在有機溶劑中完成的酯化反應方程式為 酶活的定義為40℃條件下，pH8.0的磷酸緩沖溶液中水解橄欖油，每分鐘釋放出1μmol脂肪酸的酶量為一個酶活單位。
與傳統的化學合成法相比，本發明反應條件溫和、能耗低，大大降低了生產成本。同時本發明使用生物催化劑，反應特異性強、副產物少。產品具有色澤淺、品質高的特點。
與同類的生物合成方法相比，本發明的先進性在于(見表1)1.選用了新型的固定化載體，如固定化酶膜，增大了酶的作用面積從而減少了酶用量。通過高分子化合物、蛋白、表面活性劑及油脂和無機離子等物質與酶共固定，共固定劑能很好的改善載體的親水和疏水特性，增強了底物與酶的接觸和擴散效果，為酶提供良好的與底物作用的微環境，從而大大提高了酶的催化活性和熱力學穩定性。以上因素度降低了酶的使用成本。
2.固定化酶固定于不銹鋼絲網中，增大了催化面積。與游離酶或顆粒狀的固定化酶相比，更易于與反應液分離，并且有利于連續化生產和酶的回收復用。其相應的酶反應器與其他反應器如管式、膜反應器相比，結構和操作簡單，設備通用性強。而且在反應器中，酶催化面積大、催化效率高。
3.對于固態底物使用廉價的石油餾出物為反應溶劑，降低了生產成本。
由本發明得到的產品各項指標均達到企業標準，優于市售化學產品。可應用于能源、農業、以及食品、化妝品、紡織行業等領域中。
表1.本發明與同類方法的比較
權利要求
1.固定化脂肪酶催化合成脂肪酸低碳醇酯的步驟(1)脂肪酶的固定化其特征是固定化載體先用共固定劑活化。將固定化載體和共固定劑按質量體積比1∶1～1∶3的比例混合(W∶V)，室溫晾干。脂肪酶溶液按1000～30000單位/克載體的比例與活化后的固定化載體混合，晾干待用。(2)脂肪酸酯的合成其特征是將底物脂肪酸和醇按摩爾比1∶1～1∶5的比例加入含有有機溶劑的酶反應器中，加入固定化酶開始反應。在20-60℃的條件下，振蕩或攪拌反應14-24小時，轉化率可達90-97％。在反應過程中加入吸水劑可縮短反應到達平衡的時間。反應結束后，固定化酶可以直接分離，用少量的有機溶劑洗滌后可再次使用。反應液經堿液洗滌、過濾后減壓蒸餾，蒸發出反應媒體有機溶劑，得到產物酯。蒸發出的溶劑經過冷凝后可回收復用。
2.根據權利1.(1)中所述方法，其特征是所用的脂肪酶為固定化青霉脂肪酶、固定化假絲酵母脂肪酶、和酯酶。所用固定化載體為紡織物如膜和布等。
3.根據權利1.(1)所述方法，其特征是固定化載體的共固定劑組成包括高分子化合物、油脂、蛋白質、表面活性劑和無機鹽等物質，包括聚乙二醇、Tween和span系列、明膠、卵磷脂。
4.根據權利1.(2)所述方法，其特征是在攪拌反應器中，固定化載體膜被固定在不繡鋼絲網中，不銹鋼絲網置于反應器內或卷曲成螺旋板狀置于反應器中，反應結束后可直接與反應液分離。
5.根據權利1.(2)所述方法，其特征是反應所用的有機溶劑為廉價的石油餾出物，沸程為40℃-150℃，對于液態的底物可直接采用無溶劑體系。
6.根據權利1.(2)所述方法，其特征是所用的吸水劑為硅膠和分子篩。
7.根據權利1.(2)所述方法，其特征是所用的洗滌堿液為NaCO3或NaOH溶液，濃度為5-10％。
8.根據權利1.(2)所述方法，其特征是脂肪酸為C10～C18的脂肪酸，如葵酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸等。醇為C1～C8的伯醇，如甲醇、己醇、丙醇、丁醇、己醇、異辛醇等，C3～C5的仲醇，如異丙醇、異丁醇等。
全文摘要
本發明采用固定化微生物脂肪酶在非水相體系催化合成脂肪酸低碳醇酯。將脂肪酶固定化在惰性載體膜或紡織物上，固定化載體可與金屬絲網復合，形成新型反應器，在20～60℃范圍內與有機相中催化脂肪酸和醇的酯化反應，14－24hr酯化率可達90－97％。與目前工業中使用化學催化劑在高溫高壓下酯化的工藝方法相比，此方法具有反應條件溫和、能耗低，反應專一性強、副產物少的優點。與同類的酶法合成工藝相比較，該方法具有產物易與固定化酶分離，有利于連續化生產以及固定化酶易回收和重復使用的特點。同時在反應過程中加入吸水劑可縮短反應時間并提高酯化率。由該方法轉化得到的產品色澤淺、品質高，在能源、農業及紡織、塑料、食品、化妝品行業等領域中均有重要的應用。
文檔編號C12P7/64GK1456674SQ0211761
公開日2003年11月19日 申請日期2002年5月10日 優先權日2002年5月10日
發明者譚天偉, 陳必強, 葉華, 鄧利 申請人:北京化工大學