專利名稱：一種高效增殖丙肝病毒體的方法及其組份的制作方法
發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種高效增殖丙肝病毒體的方法及其系統(tǒng)組份。具體地說，本發(fā)明涉及一種利用重組痘病毒在體外細(xì)胞中高效培養(yǎng)增殖丙肝病毒體的方法，該方法克服了傳統(tǒng)的丙肝病毒不能在培養(yǎng)的細(xì)胞上擴(kuò)增和難擴(kuò)增的限制，可大量生產(chǎn)用于體外研究和疫苗防治等目的丙肝病毒體，本發(fā)明還涉及一種體外增殖丙肝病毒體所需的系統(tǒng)組份。
從感染病人分離出的丙肝病毒能夠感染人類的原始肝細(xì)胞，外周血單核細(xì)胞，以及某些細(xì)胞系如人類T淋巴細(xì)胞系HPBMa10-2，B淋巴細(xì)胞系Daudi和肝細(xì)胞系。然而在這些細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，丙肝病毒的復(fù)制通常是瞬時(shí)和低效的。這些缺點(diǎn)使得這些細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)不適合于擴(kuò)增丙肝病毒。另一種擴(kuò)增丙肝病毒的方法是用體外轉(zhuǎn)錄丙肝病毒的正鏈RNA轉(zhuǎn)染人類肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系Huh-7或使丙肝病毒突變體在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖。許多研究小組報(bào)道用這種方法未能制備出可檢測(cè)到的丙肝病毒或檢測(cè)到的丙肝病毒滴度小于107。盡管中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1124001.6報(bào)道說從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中制得了感染性的病毒顆粒，但這種方法由于轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)丙肝病毒RNA到Huh-7細(xì)胞的效率低，丙肝病毒RNA易在細(xì)胞中降解，以及在丙肝病毒全長(zhǎng)RNA上加入IRES-EGFP序列后，序列延長(zhǎng)，降低其RNA復(fù)制效率，同時(shí)即使有少量的全長(zhǎng)RNA復(fù)制，因其長(zhǎng)度超過了病毒顆粒包裝長(zhǎng)度的范圍，難有高滴度的病毒產(chǎn)生出來(≤105-7)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性低.
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在培養(yǎng)細(xì)胞中高效增殖丙肝病毒體所需的系統(tǒng)組份。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種在離體細(xì)胞中擴(kuò)增的丙肝病毒體。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種高效增殖丙肝病毒體的方法，它包括的步驟是A制備下列組份為a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；c能啟動(dòng)和促進(jìn)上述載體表達(dá)的痘病毒；d宿主細(xì)胞；或?yàn)閍能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；b能表達(dá)丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的載體；c能同時(shí)啟動(dòng)和促進(jìn)上述載體表達(dá)的痘病毒；d宿主細(xì)胞；其中，載體a由下列步驟制備①擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到載體上；②在載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的NS3和NS5A進(jìn)行3個(gè)氨基酸突變，得到載體a，
載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體上；B將步驟A中的載體a或者載體a和b先轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞d，再用痘病毒c感染已轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，獲得重組宿主細(xì)胞；C培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，并收集細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，能啟動(dòng)a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體的啟動(dòng)子選自T7，或SP6或T3等啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子能被含有T7噬菌體RNA聚合酶基因或其他啟動(dòng)子基因的重組痘病毒啟動(dòng)，并有效地表達(dá)所攜帶的基因。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，提供了一種高效增殖丙肝病毒體的方法，它包括的步驟是A制備下列組份為a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體，且丙肝病毒全長(zhǎng)基因組cDNA位于T7啟動(dòng)子和T7終止子之間，序列長(zhǎng)度小于9660核苷酸；c含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞；或?yàn)閍能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；且丙肝病毒全長(zhǎng)基因組cDNA位于T7啟動(dòng)子和T7終止子之間，序列長(zhǎng)度小于9660核苷酸；b能表達(dá)丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的載體；且丙肝結(jié)構(gòu)蛋白基因組cDNA位于痘病毒早期或后期啟動(dòng)子和終止子之間；c含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞；其中，載體a由下列步驟制備①擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到pFK-1載體上；②在載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的進(jìn)行E1202G，T1208I，S2197P的三次點(diǎn)突變，得到載體a，載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體pSC59上，得到載體b；B將步驟A中的載體a或者載體a和b先轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞d，再用痘病毒c感染已轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，獲得重組宿主細(xì)胞；C培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，并收集細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞選用HeLa，或BSC-1，或CV-1，或MRC-5等哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選HeLa細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒選用vTF7-3病毒，ATCC NO.VR-2153，更優(yōu)選采用D13L基因缺陷型且含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒，或在感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入利福平阻止痘病毒裝配或復(fù)制，但利福平的加入不影響痘病毒基本功能的體現(xiàn)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液的丙肝病毒純化可通過0.2μm的濾器和蔗糖梯度離心。
在本發(fā)明中，a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因的重組載體由下列方法制備根據(jù)Aizak等報(bào)道的HCV基因組序列，通過偶聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從丙肝病人肝臟病毒基因組RNA中產(chǎn)生含有HCV全長(zhǎng)基因的cDNA，并根據(jù)丙肝病毒1a或丙肝病毒1b的保守序列設(shè)計(jì)6個(gè)PCR引物，根據(jù)病人的來源如在美國(guó)或其他西方國(guó)家可選用1b株引物，在中國(guó)或日本選用1a引物，首先用SEQ ID NO1，3’UTR末端序列引物和SEQ ID NO5，NS3的序列合成2組cDNA.用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2合成1a的3’UTR核苷酸序列或SEQ ID NO1和SEQ ID NO3合成1b株的3’UTR核苷酸序列，然后純化得DNA。用此小片段和SEQ ID NO4作引物合成丙肝病毒從NS3到3’UTR的片斷，同時(shí)用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6合成丙肝病毒5’UTR到NS3的片斷，此兩個(gè)DNA片斷有部分重疊，再用于合成全長(zhǎng)HCV DNA的模板用SEQ ID NO1和SEQ ID NO6做Long-PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)HCV DNA，獲得丙肝病毒全長(zhǎng)核苷酸序列。由于在SEQ ID NO6上加有HindIII和SEQ ID NO1上加有SpeI位點(diǎn)，全長(zhǎng)HCVDNA可克隆到pFK-1載體上的HindIII和SpeI的酶切位點(diǎn)上。以此HCV DNA為模板做3次定點(diǎn)突變成E1202G，T1280I，及S2197P。改造后的載體DNA為pHCV-2.pHCV-2經(jīng)ScaI酶切后可直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞提供HCV RNA基因組.
在本發(fā)明中，b能表達(dá)丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組載體由下列方法制備在上述制備pHCV-2基礎(chǔ)上獲得的，獲得丙肝病毒全長(zhǎng)核苷酸序列經(jīng)SpeI酶切后克隆到pSC59載體上，命名為pHCV-1.此載體帶來痘病毒的啟動(dòng)子和終止子，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，大量提供高效表達(dá)HCV結(jié)構(gòu)的酶蛋白。
在本發(fā)明中，將載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞可采用多種常用的方法，如基因槍注射法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，采用Lipofect Amine脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，用等量的pHCV-2，CCTCCM201013和pHCV-1，CCTCC M201012共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞系，培養(yǎng)液是含2.5％胎牛血清的DMEM。經(jīng)過4個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)染后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培養(yǎng)基中含有107pfu vTF7-1，ATCC No.VR-2153。病毒感染2小時(shí)后，除去病毒上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)72小時(shí)的溫育后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液即為含有丙肝病毒體的液體。在另一個(gè)具體的實(shí)施例中采用Lipofect Amine轉(zhuǎn)染法，將pHCV-1，CCTCC M201013表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CV-1細(xì)胞，培養(yǎng)液是含1.0％胎牛血清的OPTI-MEM。經(jīng)過6個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)染后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)，并用含1.0％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培養(yǎng)基中含有105pfu vTF7-3，并加入利福平，病毒感染2小時(shí)后，除去病毒上清液，加入含有利福平的細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞在含1.5％胎牛血清的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)48小時(shí)的溫育后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液即為含有丙肝病毒體的液體。在本發(fā)明還提供了一種擴(kuò)增丙肝病毒的最佳方法，該方法包括的步驟是A制備下列組份為a CCTCC M201013c ATCC NO VR-2153d HeLa或?yàn)閍 CC TCC M201013b CCTCC M201012c ATCC NO VR-2153d HeLa其中，載體a由下列步驟制備①從病人血清中用6個(gè)引物擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到pFK-1載體上，形成pFK-1 HCV DNA；②在pFK-1 HCV DNA載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的NS3和NS5A進(jìn)行3個(gè)氨基酸突變，依次為NS3區(qū)的第1202位點(diǎn)Glu變?yōu)镚ly，第1280位點(diǎn)的Thr變?yōu)镮le，NS5A區(qū)的第2197位點(diǎn)Ser變?yōu)镻ro，得到pHCV-2，CCTCC M201013；載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體pSC59載體上，形成pHCV-1，CCTCC M201012；B將步驟A中的載體a或者載體a和b先轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞d，再用痘病毒c感染已轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，獲得重組宿主細(xì)胞；C培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，并收集細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。
在本發(fā)明中還提出了根據(jù)本發(fā)明的方法制備而獲得的丙肝病毒體.
采用本方法獲得的病毒體是高濃度的，從實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的數(shù)據(jù)與中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1124001.6報(bào)道的數(shù)據(jù)相比高10-1000倍，而且不通過信號(hào)放大，在電鏡下可見病毒粒子存在。
在本發(fā)明的另外一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種高效表達(dá)丙肝病毒體的系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)含有下列組份a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；c能啟動(dòng)和促進(jìn)上述載體表達(dá)的痘病毒；d宿主細(xì)胞；或?yàn)閍能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；b能表達(dá)丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的載體；c能同時(shí)啟動(dòng)和促進(jìn)上述載體表達(dá)的痘病毒；d宿主細(xì)胞；其中，載體a由下列步驟制備①擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到載體上；②在載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的NS3和NS5A進(jìn)行3個(gè)氨基酸突變，得到載體a，載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體上；在本發(fā)明中，能啟動(dòng)a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體的啟動(dòng)子選自T7，或SP6或T3等啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子能被含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒啟動(dòng)，并有效地表達(dá)所攜帶基因。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供了一種更佳高效的增殖丙肝病毒體的表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)包括的組份為a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體，且丙肝病毒全長(zhǎng)基因組cDNA位于T7啟動(dòng)子和T7終止子之間，序列長(zhǎng)度小于9660核苷酸；c含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞；或?yàn)閍能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；且丙肝病毒全長(zhǎng)基因組cDNA位于T7啟動(dòng)子和T7終止子之間，序列長(zhǎng)度小于9660核苷酸；b能表達(dá)丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的載體；且丙肝結(jié)構(gòu)蛋白基因組cDNA位于痘病毒早期或后期啟動(dòng)子和終止子之間；c含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞；其中，載體a由下列步驟制備①擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到pFK-1載體上；②在載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的進(jìn)行E1202G，T1208I，S2197P的三次點(diǎn)突變，得到載體a，載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體pSC59上，得到載體b；在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞選用HeLa，或BSC-1，或CV-1，或MRC-5等哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選HeLa細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒選用VTF7-3病毒，ATCC NO.VR-2153，更優(yōu)選采用D13L基因缺陷型且含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒，或在感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入利福平阻止痘病毒裝配或復(fù)制，但利福平的加入并不影響其基本的功能發(fā)揮。”基本的功能”是指能啟動(dòng)和促進(jìn)上述轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的載體的表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選方案中，體外表達(dá)丙肝病毒體的系統(tǒng)組份為a CCTCC M201013c ATCC NO VR-2153d HeLa或?yàn)閍 CCTCC M201013b CCTCC M201012c ATCC NO VR-2153d HeLa其中，載體a由下列步驟制備①從病人血清中用6個(gè)引物擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到pFK-1載體上，形成pFK-1 HCV DNA；②在pFK-1 HCV DNA載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的NS3和NS5A進(jìn)行3個(gè)氨基酸突變，依次為NS3區(qū)的第1202位點(diǎn)Glu變?yōu)镚ly，第1280位點(diǎn)的Thr變?yōu)镮le，NS5A區(qū)的第2197位點(diǎn)Ser變?yōu)镻ro，得到pHCV-2，CCTCC M201013；
載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體pSC59載體上，形成pHCV-1，CCTCC M201012；本發(fā)明所指的丙肝病毒體包括丙肝病毒，丙肝病毒突變體，和丙肝病毒減毒株。
本發(fā)明所指的丙肝病毒全長(zhǎng)基因組是指含有組裝丙肝病毒所必需的核酸序列的多聚核苷酸序列，包括DNA，和/或RNA，和/或cDNA形式。基因組中可以有一個(gè)或多個(gè)基因序列的缺失，但不影響其免疫原性或其感染性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明對(duì)丙肝病毒NS3和NS5A基因區(qū)進(jìn)行了缺失和/或突變，獲得了多個(gè)丙肝病毒全長(zhǎng)基因的缺失或突變的表達(dá)載體，這樣可提高病毒復(fù)制效率，克服丙肝病毒不能在細(xì)胞中擴(kuò)增和擴(kuò)增效率低的問題。
含有T7噬菌體RNA聚合酶的重組痘病毒可通過常規(guī)分子生物學(xué)方法制備，或向保藏機(jī)夠買，如向ATCC夠買，ATCC NO VR-2153。或參照Fuerst等描述的一種制備含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的痘病毒重組體的方法制備。在這種重組體中，同源重組將擁有痘病毒啟動(dòng)子的T7 RNA聚合酶插在胸腺嘧啶脫氧核苷激酶編碼區(qū)。即可獲得vTF7-3。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，提出了一種產(chǎn)生D13L基因缺陷型重組痘病毒vT7D13L。第一步是構(gòu)建一種質(zhì)粒pGPT-D13L，該質(zhì)粒可以在同源重組中用于以細(xì)菌的gpt基因替代痘病毒必需基因例如D13L的編碼區(qū)。病毒必需基因是指可以對(duì)維持痘病毒生命力所必需的病毒蛋白進(jìn)行編碼的基因。質(zhì)粒含有在痘病毒前/后啟動(dòng)子和痘病毒終止子之間克隆的細(xì)菌gpt基因所得的gpt轉(zhuǎn)錄單元的末端有500bp-1kbp兩個(gè)序列，這兩個(gè)序列與痘病毒必需基因的ORF上游旁側(cè)序列和下游末端序列同源。在痘病毒vTF7-3感染之后，質(zhì)粒可以用于感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞如非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1。在感染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，進(jìn)行裂解，釋放出痘病毒體。為了選擇重組體，用細(xì)胞裂解產(chǎn)物和野生型痘病毒共同感染CV-1細(xì)胞、在MPA、黃嘌呤和次黃嘌呤的存在下，gpt-陽性的重組體將形成空斑，因?yàn)樵谳^高的MOI下，幾乎所有的細(xì)胞都會(huì)庇護(hù)野生型痘病毒，而這些野生型痘病毒為缺陷病毒提供了反式的基本蛋白，在痘病毒啟動(dòng)子的控制下，用含有必需基因的質(zhì)粒pD13L感染那些被vTF7-3瞬間轉(zhuǎn)染了的非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1，可以得純的缺陷型痘病毒的漿液。該啟動(dòng)子與前/后啟動(dòng)子不應(yīng)同源，前/后啟動(dòng)子是用gpt表達(dá)，以降低在缺陷病毒基因組和含有必需基因的質(zhì)粒之間的重組可能性。
檢測(cè)重組丙肝病毒體的存在和測(cè)定丙肝病毒制品的感染滴度使用現(xiàn)在通行的方法。其中的方法之一是采用PCR方法。在本發(fā)明中提供了一種具體的RT-PCR方法用含1％胎牛血清的Opti-DMEM將收集的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液10倍稀釋。然后在一個(gè)24孔板中每孔加入1ml的稀釋后的上清液。24孔板每孔在前一天接種上106個(gè)Huh7細(xì)胞。經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)，除去接種物，并用10％胎牛血清的1ml新鮮DMEM取代之。培養(yǎng)6天之后，收集細(xì)胞，并從細(xì)胞中提取全部的RNA。用RT-PCR放大丙肝病毒5’UTR，檢測(cè)丙肝病毒的負(fù)鏈RNA。PCR所用的引物為SEQ ID NO87，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，通過PCR擴(kuò)增，DNA電泳，紫外光下檢測(cè)電泳帶的存在。
在本發(fā)明的另一個(gè)測(cè)定丙肝病毒制品的感染滴度的方法中，采用現(xiàn)在臨床常用的檢測(cè)病人血液的熒光檢測(cè)試劑盒，根據(jù)試劑盒中的方法進(jìn)行操作，并根據(jù)陽性/陰性標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，結(jié)果表明重組丙肝病毒的基因考貝數(shù)為每毫升8.0×108-4×109。
本發(fā)明提供了另一個(gè)檢測(cè)丙肝病毒的常用方法。對(duì)收集的上清液低速離心去沉淀，再用PEG6000沉淀，固定染色，電鏡觀察；或收集細(xì)胞，固定染色，電鏡觀察。
本發(fā)明利用了痘病毒的獨(dú)特性。這種病毒利用自身的酶在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行DNA的復(fù)制和mRNA的合成時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中存在的質(zhì)粒也將被復(fù)制，而且編碼區(qū)如果與痘病毒啟動(dòng)子相連，也將被轉(zhuǎn)錄成mRNA。由于這些性質(zhì)，痘病毒被廣泛地用來表達(dá)外源蛋白。本發(fā)明所提供的方法利用了痘病毒的復(fù)制機(jī)制來生產(chǎn)丙肝病毒體。在制備丙肝病毒體時(shí)，為了清除痘病毒顆粒，本發(fā)明還提供一種缺陷型重組體痘病毒，并用于擴(kuò)增丙肝病毒體，該重組體中刪除了痘病毒基因組中的D13L基因。D13L是編碼65kDa蛋白的基因，而該蛋白是痘病毒的組份，對(duì)于形成病毒是必不可少的。盡管Falkner等最近公開了一種利用細(xì)胞系，穩(wěn)定地表達(dá)一種痘病毒基本蛋白，生成有缺陷的重組痘病毒的方法。但它不能用于制備D13L缺陷型重組痘病毒。不能利用完整細(xì)胞系選擇和制備D13L缺陷型痘病毒重組體其中的一個(gè)主要問題是，痘病毒所感染的細(xì)胞會(huì)穩(wěn)定地表達(dá)D13L蛋白，而這將抑制宿主細(xì)胞蛋白的合成，從而切斷D13L蛋白的供應(yīng)。由于D13L蛋白是痘病毒顆粒的基本成份，缺少D13L將會(huì)阻止痘病毒的形成。
本發(fā)明提供了一種在體外細(xì)胞中增殖丙肝病毒的系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用痘病毒表達(dá)機(jī)制來制備丙肝病毒體。在被含有T7 RNA聚合酶重組痘病毒感染的細(xì)胞中，痘病毒DNA聚合酶可以復(fù)制細(xì)胞質(zhì)中的載體a和b/或a，痘病毒RNA聚合酶能轉(zhuǎn)錄與痘病毒啟動(dòng)子相連的病毒DNA。產(chǎn)生的mRNA能被宿主細(xì)胞翻譯系統(tǒng)所翻譯而合成病毒蛋白。病毒基因組RNA則由T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒DNA而獲得。因而，如果細(xì)胞被含有編碼RNA病毒蛋白的正鏈RNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)域和在合適啟動(dòng)子下游的正鏈RNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，那么當(dāng)用重組痘病毒再進(jìn)行感染時(shí)，就會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中大量地合成病毒蛋白和病毒基因組RNA。然后所得的病毒蛋白和基因組RNA將組裝成病毒體。這些病毒體在生物學(xué)上和形態(tài)學(xué)上都與原始毒種類似。
丙肝病毒的基因組RNA含有一個(gè)內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)，對(duì)于丙肝病毒，用一個(gè)含有在噬菌體啟動(dòng)子和終止子之間的全長(zhǎng)基因組RNA的cDNA拷貝的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)制備病毒就足夠了。在這個(gè)例子里，病毒蛋白將從基因組RNA中被翻譯出來，接著包裝病毒RNA形成病毒粒子。然而，和另一個(gè)含有在痘病毒后啟動(dòng)子或前后啟動(dòng)子下游的編碼病毒蛋白cDNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞來提供更多的病毒蛋白將會(huì)把病毒粒子的產(chǎn)量提高到原來的10到100倍。
使用痘病毒復(fù)制機(jī)制制備丙肝病病毒的優(yōu)點(diǎn)之一是它可以繞過限制病毒繁殖的障礙，當(dāng)用丙肝病毒自身的復(fù)制機(jī)制進(jìn)行病毒復(fù)制時(shí)存在這種障礙。利用痘病毒高效復(fù)制的機(jī)制，幾天后就可以得到高滴度的丙肝病毒。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這種系統(tǒng)可用廣泛用于制備一系列的RNA病毒，如流感病毒和慢病毒載體的制備。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)系統(tǒng)用于制備RNA病毒載體時(shí)，它可以避免產(chǎn)生復(fù)制型活病毒。第四個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，本系統(tǒng)是高效的，與傳統(tǒng)方法相比提高病毒滴度10-1000倍。
引物是根據(jù)1a和1b的保守序列中設(shè)計(jì)而獲得，由美國(guó)genebase公司合成從急性丙肝病人肝組織(100mg)或100μl血清中用TrL20L System(GIBCO/BRL)提取RNA，用100μl的10mM DDT加上5％RNasin(Promega)懸浮。10μl的樣品保存在-80℃用于每次RT-PCR。
cDNA制備RNA在65℃中變性2分鐘，在20μl的反應(yīng)液中用Superscr pt II reversetranscriptase(GIBCO/BRL)，通過SEQ ID NO1或SEQ ID NO5合成cDNA。反應(yīng)在42℃進(jìn)行1小時(shí)，然后用RNase H和RNase T1(GIBCO/BRL)消化20分鐘，1/10的cDNA產(chǎn)物直接用于以下的PCR擴(kuò)增。
PCR擴(kuò)增HCV 3’UTR1a株的3’UTR是通過兩對(duì)引物而擴(kuò)增的。1a株用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。在50μl反應(yīng)液中(含有1倍的PCR buffer，250μm dNTP(Pharmacia)，20pmol引物，1μl(5unit)Taqman多聚酶(Stategene)，2μl cDNA產(chǎn)物，擴(kuò)增條件是94℃，2分鐘，變性，然后是35個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增，每次循環(huán)包括94℃ 1分鐘，60℃退火30秒鐘，68℃30秒鐘合成，最后68℃7分鐘擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離相應(yīng)產(chǎn)物然后用gel purification Kit(膠純化試劑盒)(Qiagene)純化DNA。
用Long-PCR擴(kuò)增HCV cDNA片斷及全長(zhǎng)HCV DNA1)復(fù)蓋NS3到3’UTR區(qū)域的HCV DNA的合成及擴(kuò)增是用相應(yīng)的cDNA產(chǎn)物及通過3’UTRDNA小片段及SEQ ID NO4而合成的。3’UTR cDNA經(jīng)94℃ 5分鐘變性后直接置入4℃，用于以下PCR反應(yīng)，PCR合成是通過長(zhǎng)模板延長(zhǎng)系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)合成的。緩沖液和相應(yīng)的試劑及反應(yīng)條件均由生產(chǎn)廠提供，其中包括2μl cDNA模板，PCR產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離然后用gel purification Kit(膠純化試劑盒)(Qiagene)純化。
2)復(fù)蓋5’UTR到NS3區(qū)域的DNA片斷的合成和擴(kuò)增是以相應(yīng)的cDNA產(chǎn)物做模板通過SEQ ID NO6和SEQ ID NO5作物用長(zhǎng)模板延長(zhǎng)系統(tǒng)合成，擴(kuò)增條件及DNA純化和上述相同。
3)合成全長(zhǎng)HCV DNA用純化過的5’UTR-NS3及NS3-3’UTR為模板通過SEQ ID NO5和SEQ ID NO6作引物合成和擴(kuò)增HCV全長(zhǎng)DNA，試劑，條件均按長(zhǎng)模板延長(zhǎng)系統(tǒng)(Boehinger Mannheim)提供，因SEQ ID NO6含有T7啟動(dòng)子序列，由此所獲全長(zhǎng)HCV基因的5’端帶有T7 RNA酶啟動(dòng)子。
克隆HCV全長(zhǎng)DNA經(jīng)HindIII和Spe I酶切后克隆到pFK-1載體HindIII和SpeI位點(diǎn)上。pFK-1由pBR322衍生而來，經(jīng)StyI-EcoRI切除后，pBR322的StyI-EcoRI片斷，被多克隆片斷HindIII-Not I-Spe I位點(diǎn)所代替而得到pFK-1 HCV DNA。
點(diǎn)突變?yōu)楸ＷCHCV能夠在敏感Huh-7細(xì)胞中高效復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，表達(dá)，我們應(yīng)用點(diǎn)突變技術(shù)在NS3和NS5A基因上進(jìn)行3個(gè)特異氨基酸突變。所有突變點(diǎn)的編號(hào)均按EmBL databaseaccession number AJ238799為參考。特異突變點(diǎn)為NS3基因的1202位點(diǎn)的Glu變?yōu)镚ly，NS3基因的1280位點(diǎn)的Thr變?yōu)镮le，以及NS5A的2197位點(diǎn)的Ser變?yōu)镻roline。具體操作如下，分別設(shè)計(jì)合成3對(duì)24核苷酸的寡鏈(突變點(diǎn)在寡鏈中間)，每對(duì)寡鏈為互補(bǔ)序列。點(diǎn)突變通過mutagenesis kit(突變?cè)噭┖?(Stategene)來完成。實(shí)驗(yàn)條件和試劑均由廠家提供，得到克隆后經(jīng)檢測(cè)序列證實(shí)點(diǎn)突變后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行第二次點(diǎn)突變，依次進(jìn)行，順序如下pFK HCV→pFK HCV E1202G→pFK HCV E1202G T1280I→pFK HCV E1202G T1280IS2197P(名稱為pHCV-2a)。將pHCV-2a重組載體轉(zhuǎn)染HB101細(xì)菌，用含氨芐的LB培養(yǎng)基選擇細(xì)菌克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲取大量載體。含有丙肝病毒全長(zhǎng)基因的pHCV-2a重組載體于2001年4月19日保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC M201013a。pHCV-2用于復(fù)制HCV全長(zhǎng)RNA。實(shí)施例②能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組另一載體的制備引物是根據(jù)1a和1b的保守序列中設(shè)計(jì)而獲得，由美國(guó)genebase公司合成從急性丙肝病人肝組織(100mg)或100μl血清中用TrL20L System(GIBCO/BRL)提取RNA，用100μl的10mM DDT加上5％RNasin(Promega)懸浮。10μl的樣品保存在-80℃用于每次RT-PCR。
cDNA制備RNA在65℃中變性2分鐘，在20μl的反應(yīng)液中用Superscr ptII reversetranscriptase(GIBCO/BRL)，通過SEQ ID NO1或SEQ ID NO5合成cDNA。反應(yīng)在42℃進(jìn)行1小時(shí)，然后用RNase H和RNase T1(GIBCO/BRL)消化20分鐘，1/10的cDNA產(chǎn)物直接用于以下的PCR擴(kuò)增。
PCR擴(kuò)增HCV 3’UTR1a株的3’UTR是通過兩對(duì)引物而擴(kuò)增的。1b株用SEQ ID NO1和SEQ ID NO3。在50μl反應(yīng)液中(含有1倍的PCR buffer，250μm dNTP(Pharmacia)，20 pmol引物，1μl(5 unit)Taqman多聚酶(Stategene)，2μl cDNA產(chǎn)物，擴(kuò)增條件是94℃，2分鐘，變性，然后是35個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增，每次循環(huán)包括94℃ 1分鐘，60℃退火30秒鐘，68℃30秒鐘合成，最后68℃7分鐘擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離相應(yīng)產(chǎn)物然后用gel purification Kit(膠純化試劑盒)(Qiagene)純化DNA。
用Long-PCR擴(kuò)增HCV cDNA片斷及全長(zhǎng)HCV DNA4)復(fù)蓋NS3到3’UTR區(qū)域的HCV DNA的合成及擴(kuò)增是用相應(yīng)的cDNA產(chǎn)物及通過3’UTRDNA小片段及SEQ ID NO4而合成的。3’UTR cDNA經(jīng)94℃ 5分鐘變性后直接置入4℃，用于以下PCR反應(yīng)，PCR合成是通過長(zhǎng)模板延長(zhǎng)系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)合成的。緩沖液和相應(yīng)的試劑及反應(yīng)條件均由生產(chǎn)廠提供，其中包括2μl cDNA模板，PCR產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離然后用gel purification Kit(膠純化試劑盒)(Qiagene)純化。
5)復(fù)蓋5’UTR到NS3區(qū)域的DNA片斷的合成和擴(kuò)增是以相應(yīng)的cDNA產(chǎn)物做模板通過SEQ ID NO6和SEQ ID NO5作物用長(zhǎng)模板延長(zhǎng)系統(tǒng)合成，擴(kuò)增條件及DNA純化和上述相同。
6)合成全長(zhǎng)HCV DNA用純化過的5’UTR-NS3及NS3-3’UTR為模板通過SEQ ID NO5和SEQ ID NO6作引物合成和擴(kuò)增HCV全長(zhǎng)DNA，試劑，條件均按長(zhǎng)模板延長(zhǎng)系統(tǒng)(Boehinger Mannheim)提供，因SEQ ID NO6含有T7啟動(dòng)子序列，由此所獲全長(zhǎng)HCV基因的5’端帶有T7 RNA酶啟動(dòng)子。
克隆HCV全長(zhǎng)DNA經(jīng)HindIII和SpeI酶切后克隆到pFK-1載體HindIII和SpeI位點(diǎn)上。pFK-1由pBR322衍生而來，經(jīng)StyI-EcoRI切除后，pBR322的StyI-EcoRI片斷，被多克隆片斷HindIII-NotI-SpeI位點(diǎn)所代替而得到pFK-1 HCV DNA。
點(diǎn)突變?yōu)楸ＷCHCV能夠在敏感Huh-7細(xì)胞中高效復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，表達(dá)，我們應(yīng)用點(diǎn)突變技術(shù)在NS3和NSSA基因上進(jìn)行3個(gè)特異氨基酸突變。所有突變點(diǎn)的編號(hào)均按EmBL databaseaccession number AJ238799為參考。特異突變點(diǎn)為NS3基因的1202位點(diǎn)的Glu變?yōu)镚ly，NS3基因的1280位點(diǎn)的Thr變?yōu)镮le，以及NS5A的2197位點(diǎn)的Ser變?yōu)镻roline。具體操作如下，分別設(shè)計(jì)合成3對(duì)24核苷酸的寡鏈(突變點(diǎn)在寡鏈中間)，每對(duì)寡鏈為互補(bǔ)序列。點(diǎn)突變通過mutagenesis kit(突變?cè)噭┖?(Stategene)來完成。實(shí)驗(yàn)條件和試劑均由廠家提供，得到克隆后經(jīng)檢測(cè)序列證實(shí)點(diǎn)突變后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行第二次點(diǎn)突變，依次進(jìn)行，順序如下pFK HCV→pFK HCV E1202G→pFK HCV E1202G T1280I→pFK HCV E1202G T1280IS2197P(名稱為pHCV-2b)。將pHCV-2b重組載體轉(zhuǎn)染HB101細(xì)菌，用含氨芐的LB培養(yǎng)基選擇細(xì)菌克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲取大量載體。含有丙肝病毒全長(zhǎng)基因的pHCV-2b重組載體于2001年4月19日保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC M201013b。pHCV-2用于復(fù)制HCV全長(zhǎng)RNA。實(shí)施例③能表達(dá)丙肝病毒蛋白酶和結(jié)構(gòu)酶的載體。
通過SEQ ID NO1和SEQ ID NO6作引物以pHCV-2作模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的HCV全長(zhǎng)DNA。凝膠純化后經(jīng)SpeI酶切后克隆到pSC59的SpeI和StuI位點(diǎn)下，而獲得pHCV-1。將pHCV-1重組載體轉(zhuǎn)染HB101細(xì)菌，用含氨芐的LB培養(yǎng)基選擇細(xì)菌克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲取大量載體。含有丙肝病毒全長(zhǎng)基因的pHCV-1重組載體于2001年4月19日保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC M201012.pHCV-2的HCV結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白基因可通過PCR擴(kuò)增，可以克隆到pSC59載體上，此載體帶來痘病毒的啟動(dòng)子和終止子，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，大量提供HCV蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。實(shí)施例④構(gòu)建表達(dá)T7 RNA聚合酶重組痘病毒vT7D13LvTFD13L痘病毒重組體是由同源重組所產(chǎn)生的，采用的是Moss和Earl所提出的方法。含有T7 RNA聚合酶痘病毒重組體的第一步獲得vTF7-3痘病毒重組體，該病毒可從美國(guó)ATCC中獲得，該重組體具有插入在胸腺嘧啶編碼區(qū)域的T7 RNA基因是利用下列引物從痘病毒基因組DNA中PCR放大痘病毒D13L編碼區(qū)域以及兩側(cè)的500bp側(cè)鏈序列以SEQ ID NO10和SEQID NO11作引物，2.7kb PCR產(chǎn)物含平整末端，然后將其克隆在pUC19的PvuII位中。所得的質(zhì)粒用BstxI和HindIII進(jìn)行消化，以除去D13L編碼區(qū)域，隨后與一DNA片斷相連，該片斷在痘病毒前/后啟動(dòng)子7.5的控制下，對(duì)細(xì)菌gpt基因進(jìn)行編碼。所得質(zhì)粒為pGPT-D13L。在T25搖瓶中的非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1 106個(gè)細(xì)胞在MOI為0.05下用vTF7-3痘病毒重組體(ATCC可購得)進(jìn)行感染。初始感染兩小時(shí)后，采用LipofectAmine法用10μg的pGPT-D13L質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，四小時(shí)轉(zhuǎn)染之后，細(xì)胞置于具有2.5％胎牛血清的新鮮DMEM中。經(jīng)過48小時(shí)的保溫，可以收集細(xì)胞，并反復(fù)凍融使細(xì)胞裂解，所得的0.5ml細(xì)胞裂解液中含有vT7D13L痘病毒重組體和vTF7-3篩選vT7D13L重組體。是由DMEM中含有2.5％胎牛血清、2.5μg/ml MPA、250μg/ml黃嘌呤和15μg/ml次黃嘌呤的xGPT選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行。細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行10倍稀釋，然后感染已經(jīng)用xGPT選擇培養(yǎng)基預(yù)保溫12小時(shí)的非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1，每孔中用1ml的稀釋的細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行感染。2小時(shí)后將一小部分野生型痘病毒W(wǎng)R加入到培養(yǎng)基中，至MOI為10。細(xì)胞再保溫2小時(shí)。除掉病毒接種物后，用3ml 1％的低熔瓊脂糖進(jìn)行重疊。挑選出來的vT7D13L空斑可用于感染，96孔板中用5μg/孔的pD13L質(zhì)粒轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1，該質(zhì)粒含有痘病毒前/后啟動(dòng)子相連的D13L。轉(zhuǎn)染是采用LipofectAmine法。保溫72小時(shí)后收集空斑，并用pD13L瞬間轉(zhuǎn)染的非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1進(jìn)行數(shù)次連續(xù)重復(fù)選擇，進(jìn)一步提純。構(gòu)建pD13L質(zhì)粒。使用下列兩個(gè)引物從痘病毒W(wǎng)R基因組DNA放大D13L；以SEQ IDNO12和SEQ ID NO13作引物，得到的片斷克隆在pSC59的克隆位點(diǎn)上，質(zhì)粒pSC59是在pUC19基礎(chǔ)上構(gòu)建的。它含有痘病毒前/后啟動(dòng)子，多個(gè)克隆位點(diǎn)以及痘病毒終止子。
由于痘病毒重組體基因組中含有g(shù)pt基因，以及重組體不含D13L基因。vT7D13L在未被pD13L轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不能繁殖，用此種方法可證實(shí)vTFD13L痘病毒重組體的純度。在pD13L質(zhì)粒瞬間感染CV-1細(xì)胞中，vT7D13L可以進(jìn)行繁殖和滴度測(cè)定。vT7D13L可用蔗糖梯度離心法可以進(jìn)一步提純。實(shí)施例④ 轉(zhuǎn)染細(xì)胞及丙肝病毒的獲得。
將實(shí)施例①獲得的載體pHCV-2(CCTCC M201013)經(jīng)ScaI酶切及純化后與實(shí)施例③獲得的載體pHCV-1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。取1μg pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，置室溫15分鐘，另取1μg pHCV-1加入100微升OPTI-MEM中，置室溫15分鐘混勻；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室溫15分鐘混勻，將載體與LF2000混勻，轉(zhuǎn)染106個(gè)Hela細(xì)胞，并設(shè)無載體和無LF2000兩個(gè)對(duì)照組，經(jīng)過4個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)染后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)，并用含2.5％胎牛血清和DMEM取代，DMEM培養(yǎng)基中含有107pfu vTF7-3(ATCC NO VR-2153)重組痘病毒。經(jīng)2小時(shí)的接種后，除去接種物，細(xì)胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)48-72小時(shí)的溫育后，收集含有丙肝病毒體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
實(shí)施例⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞及丙肝病毒的獲得將實(shí)施例①獲得的載體pHCV-2(CCTCC M201013)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。取1μg ScaI酶切過pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，取1μg pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中置室溫15分鐘；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室溫15分鐘混勻，將載體與LF2000混勻，轉(zhuǎn)染105個(gè)Hela細(xì)胞，并設(shè)無載體和無LF2000兩個(gè)對(duì)照組，經(jīng)過6個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)染后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培養(yǎng)基中含有107pfu vTF7-3(ATCC N0VR-2153)重組痘病毒，并加入利福平10毫克/每毫升。經(jīng)2小時(shí)的接種后，除去接種物，細(xì)胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)48-72小時(shí)的溫育后，收集含有丙肝病毒體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
實(shí)施例⑦轉(zhuǎn)染細(xì)胞及丙肝病毒的獲得將實(shí)施例①獲得的載體pHCV-2(CCTCC M201013)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。取1μg ScaI酶切過pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，取1μg pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，置室溫15分鐘；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室溫15分鐘混勻，將載體與LF2000混勻，轉(zhuǎn)染106個(gè)Hela細(xì)胞，并設(shè)無載體和無LF2000兩個(gè)對(duì)照組，經(jīng)過4個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)染后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培養(yǎng)基中含有107pfu vT7D13L(實(shí)施例④構(gòu)建的D13L缺陷型重組痘病毒)。經(jīng)2小時(shí)的接種后，除去接種物，細(xì)胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)72小時(shí)的溫育后，收集含有丙肝病毒體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。實(shí)施例⑧ 用RT-PCR測(cè)定擴(kuò)增病毒的滴度在24孔板中加入Huh 7細(xì)胞，每孔106個(gè)細(xì)胞，24小時(shí)后，去上清，加入實(shí)施例⑤獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物上清夜，此上清液10倍稀釋，每孔加入1ml的稀釋后的上清液。24小時(shí)后，除去接種物，并用含10％胎牛血清的1ml新鮮DDMEM取代之。培養(yǎng)2天之后，收集細(xì)胞，并從細(xì)胞中提取全部的RNA。用RT-PCR檢測(cè)丙肝病毒的電泳帶，PCR引物序列為RT-PCR引物為SEQ ID NO14，PCR引物為SEQ ID NO15和SEQ ID NO116。每孔加800微升TrizolReagent，反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解，并于室溫放置5分鐘；加160微升氯仿，搖動(dòng)EP管15秒，室溫放置2-3分鐘；于4℃，12000轉(zhuǎn)離心15分鐘，棄上清；加入400微升異丙醇，室溫放置10分鐘，于4℃12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清；加入75％乙醇800微升沉淀RNA，并于4℃，7500轉(zhuǎn)離心5分鐘；棄上清，沉集的RNA空氣干燥，加20-40μl無菌水溶解RNA備用。RNA逆轉(zhuǎn)錄總體積30μl，反應(yīng)體系如下RNA 15微升，引物1微升，75℃變性分鐘，置-3℃，3分鐘；加入5x buffer 6微升，dNTP 6微升，Rnasin 1微升，總體積29微升，在42℃停留2分鐘，加入MMLVRTase，1微升，37℃停留50分鐘，70℃ 15分鐘滅活得到丙肝病毒cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為Buffer 5微升，cDNA 2微升，MgCl24微升，dNTP 4微升，上下游引物各1微升，Taq酶0.5微升，雙蒸水36.5微升；PCR反應(yīng)條件為95℃1分鐘，95℃30秒-56℃30秒-72℃40秒-72℃5分鐘，Tn32個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物于-20℃貯存。電泳條件2％瓊脂糖，18V/厘米電壓，電泳10-15分鐘，可見300bp帶，即為丙肝病毒電泳帶。實(shí)施例⑨ 用RT-PCRR熒光定量檢測(cè)擴(kuò)增病毒的滴度根據(jù)深圳達(dá)爾安生物工程有限公司產(chǎn)品丙肝病毒核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果判定計(jì)算Ax＝A1-A0(A0為反應(yīng)前值，A1為反應(yīng)后值)；實(shí)驗(yàn)有效性判別將陰性對(duì)照管的Ax稱為N，監(jiān)界陽性標(biāo)準(zhǔn)品的Ax值稱為P1，強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)值A(chǔ)x稱為P2，若此3值滿足P2＞P1＞N，則本次實(shí)驗(yàn)有效。否則，實(shí)驗(yàn)無效，應(yīng)檢查試劑、儀器、反應(yīng)條件等方面的誤差。結(jié)果判定，在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，樣品Ax＞N+0.6×(P1-N)判定陽性；如果N+0.6×(P1-N)＞Ax＞N+0.4×(P1-N)則屬于實(shí)驗(yàn)灰度區(qū)，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次，若重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ax值＞N+0.4×(P1-N)判為陽性，否則判為陽性；如果Ax值＜N+0.4×(P1-N)判為陰性。
RT-PCR熒光定量檢測(cè)結(jié)果
實(shí)施例⑩丙肝病毒的電鏡檢測(cè)。
將實(shí)施例⑥中的已轉(zhuǎn)染載體并感染痘病毒的HeLa不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行收集。方法采用常用的方法。用2.5％的戊二醛固定，包埋切片，電鏡觀察，可見20-30納米的丙肝病毒粒子。
序列表<110>李衛(wèi)云，于紅潮，李一君；<120>一種高效增殖丙肝病毒體的方法及其組份<160>16<210>1<211>74<212>DNA<213>丙肝病毒<400>CAA AAA ACC CCT CAAGAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG GGG TTA TGC 45CT ACTAGTACT TGA TCT GCA GAG AGG CCA74<210>2<211>19<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
AAGGTTGGGTAAACACTCC 19<210>3<211>22<212>DNA<21 3>丙肝病毒<400>
AACGGGGAGCTAAACACTCCTG 22<210>4<211>30<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CGA CTC CTC GCG CCT ATT ACG GCC TAC TCC 30<210>5<211>30<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
GGA GTA GGC CGT AAT AGG CGC GAG GAG TCG30<210>6<211>48<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CGTAAG CTT AAT ACG ACT CACT ATA GCC AGC CCC CTG ATG GGG GCG AC 48<210>7<211>25<212>DNA<213>丙肝病毒<400>CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGC25<210>8<211>23<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CCTATCAGGCAGTAGTACCACAA23<210>9<211>23<212>DNA<213>HCV<400>
CTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTG 24<210>10<211>25<212>DNA<213>痘病毒<400>
CATAGTATCGATTACACCTCTACCG25<210>11<211>28<212>DNA<213>痘病毒<400>
GAGAGGTTTTCTACTACTTGCTCATTAG28<210>12<211>39<212>DNA<213>痘病毒<400>
TTAATTGTTGTCGCCCATAATCTTGGTAATACTTACCCC<210>13<211>27<212>DNA<213>痘病毒<400>
ATGAATAATACTATCATTAATTCTTTG27<210>14<211>25<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGC25<210>15<211>23<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CCTATCAGGCAGTAGTACCACAA23<210>16<211>24<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTG2權(quán)利要求
1.一種高效增殖丙肝病毒體的方法，它包括的步驟是A制備下列組份為a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；c能啟動(dòng)和促進(jìn)上述載體表達(dá)的痘病毒；d宿主細(xì)胞；或?yàn)閍能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；b能表達(dá)丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的載體；c能同時(shí)啟動(dòng)和促進(jìn)上述載體表達(dá)的痘病毒；d宿主細(xì)胞；其中，載體a由下列步驟制備①擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到載體上；②在載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的NS3和NS5A進(jìn)行3個(gè)氨基酸突變，得到載體a，載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體上；B將步驟A中的載體a或者載體a和b先轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞d，再用痘病毒c感染已轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，獲得重組宿主細(xì)胞；C培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，并收集細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，該方法包括的步驟是A制備下列組份為a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體，且丙肝病毒全長(zhǎng)基因組cDNA位于T7啟動(dòng)子和T7終止子之間，序列長(zhǎng)度小于9660核苷酸；c含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞；或?yàn)閍能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；且丙肝病毒全長(zhǎng)基因組cDNA位于T7啟動(dòng)子和T7終止子之間，序列長(zhǎng)度小于9660核苷酸；b能表達(dá)丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的載體；且丙肝結(jié)構(gòu)蛋白基因組cDNA位于痘病毒早期或后期啟動(dòng)子和終止子之間；c含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞；其中，載體a由下列步驟制備①擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到pFK-1載體上；②在載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的進(jìn)行E1202G，T1208I，S2197P的三次點(diǎn)突變，得到載體a，載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體pSC59上，得到載體b；B將步驟A中的載體a或者載體a和b先轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞d，再用痘病毒c感染已轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，獲得重組宿主細(xì)胞；C培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，并收集細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是痘病毒敏感型宿主細(xì)胞為HeLa，或BSC-1，或CV-1，或MRC-5等哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是痘病毒敏感型宿主細(xì)胞為HeLa細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是載體a為CCTCC M201013。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是載體b為CCTCC M201012。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是痘病毒c為含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒vTF7-3，ATCC NO.VR-2153。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征是痘病毒c為含有T7噬菌體RNA聚合酶基因且D13L基因缺陷型痘病毒；
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，該方法包括的步驟是A制備下列組份為a CCTCC M201013c ATCC NO VR-2153d HeLa或?yàn)閍 CCTCC M201013b CCTCC M201012c ATCC NO VR-2153d HeLa其中，載體a由下列步驟制備①從病人血清中用6個(gè)引物擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到pFK-1載體上，形成pFK-1 HCV DNA；②在pFK-1 HCV DNA載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的NS3和NS5A進(jìn)行3個(gè)氨基酸突變，依次為NS3區(qū)的第1202位點(diǎn)Glu變?yōu)镚ly，第1280位點(diǎn)的Thr變?yōu)镮le，NS5A區(qū)的第2197位點(diǎn)Ser變?yōu)镻ro，得到pHCV-2，CCTCC M201013；載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體pSC59載體上，形成pHCV-1，CCTCC M201012；B將步驟A中的載體a或者載體a和b先轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞d，再用痘病毒c感染已轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，獲得重組宿主細(xì)胞；C培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，并收集細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。
11.一種權(quán)利要求1-10所述方法得到的丙肝病毒體.
12.一種高效增殖丙肝病毒體的組分，其特征是該組份為a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；c能啟動(dòng)和促進(jìn)上述載體表達(dá)的痘病毒；d宿主細(xì)胞；或?yàn)閍能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；b能表達(dá)丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的載體；c能同時(shí)啟動(dòng)和促進(jìn)上述載體表達(dá)的痘病毒；d宿主細(xì)胞；其中，載體a由下列步驟制備③擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到載體上；④在載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的NS3和NS5A進(jìn)行3個(gè)氨基酸突變，得到載體a，載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體上；
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組份，其特征是該組份為a能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體，且丙肝病毒全長(zhǎng)基因組cDNA位于T7啟動(dòng)子和T7終止子之間，序列長(zhǎng)度小于9660核苷酸；c含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞；或?yàn)閍能表達(dá)丙肝病毒全長(zhǎng)基因組RNA的載體；且丙肝病毒全長(zhǎng)基因組cDNA位于T7啟動(dòng)子和T7終止子之間，序列長(zhǎng)度小于9660核苷酸；b能表達(dá)丙肝病毒結(jié)構(gòu)蛋白的載體；且丙肝結(jié)構(gòu)蛋白基因組cDNA位于痘病毒早期或后期啟動(dòng)子和終止子之間；c含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主細(xì)胞；其中，載體a由下列步驟制備①擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到pFK-1載體上；②在載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的進(jìn)行E1202G，T1208I，S2197P的三次點(diǎn)突變，得到載體a，載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體pSC59上，得到載體b；
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的組份，其特征是痘病毒敏感型宿主細(xì)胞為HeLa，或BSC-1，或CV-1，或MRC-5等哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征是痘病毒敏感型宿主細(xì)胞為HeLa細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組份，其特征是載體a為CCTCC M201013。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組份，其特征是載體b為CCTCC M201012。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組份，其特征是痘病毒c為含有T7噬菌體RNA聚合酶基因的重組痘病毒vTF7-3，ATCC NO.VR-2153。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組份，其特征是c痘病毒為含有T7噬菌體RNA聚合酶基因且D13L基因缺陷型痘病毒；
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組份，其特征是a CCTCC M201013c ATCC NO VR-2153d HeLa或?yàn)閍 CCTCC M201013b CCTCC M201012c ATCC NO VR-2153d HeLa其中，載體a由下列步驟制備①從病人血清中用6個(gè)引物擴(kuò)增丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，并克隆到pFK-1載體上，形成pFK-1 HCV DNA；②在pFK-1 HCV DNA載體上對(duì)丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列的NS3和NSSA進(jìn)行3個(gè)氨基酸突變，依次為NS3區(qū)的第1202位點(diǎn)Glu變?yōu)镚ly，第1280位點(diǎn)的Thr變?yōu)镮le，NS5A區(qū)的第2197位點(diǎn)Ser變?yōu)镻ro，得到pHCV-2，CCTCC M201013；載體b通過引物以載體a為模板，擴(kuò)增帶有三個(gè)點(diǎn)突變的丙肝病毒的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，克隆到表達(dá)載體pSC59載體上，形成pHCV-1，CCTCC M201012；
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效擴(kuò)增丙肝病毒體的方法,該方法包括的步驟是制備a能表達(dá)丙肝病毒基因組RNA的載體和/或b能表達(dá)丙肝病毒多聚蛋白的載體,以及c啟動(dòng)上述載體表達(dá)的痘病毒和d宿主細(xì)胞的組分,依次加入各種組分,在離體細(xì)胞中增殖丙肝病毒體,此方法克服了傳統(tǒng)的丙肝病毒不能在培養(yǎng)的細(xì)胞上擴(kuò)增限制和擴(kuò)增效率低的問題,可大量生產(chǎn)用于體外研究和疫苗防治等目的的丙肝病毒體。本發(fā)明還公開了一種增殖丙肝病毒體的系統(tǒng)組分。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1377959SQ0211766
公開日2002年11月6日 申請(qǐng)日期2002年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月10日
發(fā)明者李信墻, 李研 申請(qǐng)人:李衛(wèi)云, 于紅潮, 李一君