專利名稱：三磷酸脫氧核苷的生產方法
技術領域：
本實用新型涉及三磷酸脫氧核苷的生產方法。
目前世界上只有少數幾家企業能夠生產三磷酸脫氧核苷，所采用的方法主要是利用脫氧核糖核酸水解產物的酶促或化學磷酸化，終產物的獲得要求多步反應，生產工藝繁瑣，產物轉化率低，僅約25％。盡管世界上已有數家研究機構正在研發核苷酸還原酶，但這些正處在研發階段的核苷酸還原酶大都具有要求反應條件復雜和酶穩定性差等缺點，并且只能將一磷酸或二磷酸核苷轉換成相對應的一磷酸或二磷酸脫氧核苷。而一磷酸或二磷酸脫氧核苷不能直接作為DNA聚合酶的底物，應用范圍有限。
本發明所述的三磷酸脫氧核苷的生產方法，是將核苷酸還原酶EC1.17.4.2和要轉化的底物ATP或CTP或GTP或TTP加入到反應系統中，使酶的濃度達0.01-0.16單位/ml，使底物濃度達到1-60mmol/L，并加入以維生素B12為基礎的輔酶形式的輔酶，以及含巰基還原劑或NADH或蛋白質還原劑，以緩沖液控制溶液pH6-9，于25℃-40℃反應。
上述使用的緩沖液在反應溶液中的濃度優選為20-200mM；以維生素B12為基礎的輔酶形式的輔酶優選輔酶B12，其在反應溶液中的優選濃度為0.005-0.045mmol/L；使用的還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)或二硫赤蘚糖(DTE)或二氫硫辛酸或巰基乙醇或還原型谷胱苷肽或其他含巰基還原劑等以及NADH和蛋白質還原劑，其中優選二硫蘇糖醇(DTT)，其在反應溶液中的優選濃度為20-80mmol/L。
本發明是一種將三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP、TTP、UTP)轉化為脫氧三磷酸核苷(dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP)的方法，具體就是利用重組核苷酸還原酶EC1.1 7.4.2催化還原三磷酸核苷使其轉化為三磷酸脫氧核苷，可將四種三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP、TTP)一步直接轉化成相對應的三磷酸脫氧核苷，其轉化率接近100％，大大降低了生產成本，具有明顯的創新優勢和極強的市場競爭力。
權利要求
1.一種三磷酸脫氧核苷的生產方法，其特征在于該方法是將核苷酸還原酶EC1.17.4.2和要轉化的底物ATP或CTP或GTP或TTP加入到反應系統中，使酶的濃度達0.01-0.16單位/ml，使底物濃度達到1-60mmol/L，并加入以維生素B12為基礎的輔酶形式的輔酶，以及含巰基還原劑或NADH或蛋白質還原劑，以緩沖液控制溶液pH6-9，于25℃-40℃反應。
2.按權利要求1所述的一種三磷酸脫氧核苷的生產方法，其特征在于所用的緩沖液在反應溶液中的濃度為20-200mM。
3.按權利要求1所述的一種三磷酸脫氧核苷的生產方法，其特征在于以維生素B12為基礎的輔酶形式的輔酶是輔酶B12。
4.按權利要求3所述的一種三磷酸脫氧核苷的生產方法，其特征在于所述的輔酶B12在反應溶液中的濃度為0.005-0.045mmol/L。
5.按權利要求1所述的一種三磷酸脫氧核苷的生產方法，其特征在于所述的含巰基還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)或二硫赤蘚糖(DTE)或二氫硫辛酸或巰基乙醇。
6.按權利要求5所述的一種三磷酸脫氧核苷的生產方法，其特征在于所述的含巰基還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)，其在反應溶液中的濃度為20-80mmol/L。
全文摘要
本發明公開了一種三磷酸脫氧核苷的生產方法。該方法是將核苷酸還原酶EC1.17.4.2和要轉化的底物ATP或CTP或GTP或TTP加入到反應系統中，使酶的濃度達0.01－0.16單位/ml，使底物濃度達到1－60mmol/L，并加入以維生素B12為基礎的輔酶形式的輔酶，以及含巰基還原劑或NADH或蛋白質還原劑，以緩沖液控制溶液pH6－9，于25℃－40℃反應。本發明所述的三磷酸脫氧核苷的生產方法克服傳統三磷酸脫氧核苷生產工藝的不足，轉化率高、工藝簡單。
文檔編號C12P19/00GK1398977SQ0213461
公開日2003年2月26日 申請日期2002年8月27日 優先權日2002年8月27日
發明者張克勤 申請人:廣州因賽生物科技有限公司