芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(pldxs)基因及其編碼產物和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因及其編碼蛋白與用途，該基因為首次利用構建cDNA文庫從芍藥中克隆而得，填補了從我國傳統中藥材芍藥中分離克隆出脫氧木酮糖-5-磷酸合酶基因的空白。本發明所提供的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。本發明提供的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因可以通過生物技術提高芍藥中脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑代謝產物的含量，在藥材芍藥的品質改良、活性成分合成生物學等方面，具有很好的應用前景。
【專利說明】芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因及其編碼產物
和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，主要涉及利用芍藥cDNA文庫克隆脫氧木酮糖-5-磷酸合酶基因及其編碼產物與應用，尤其涉及生物合成有藥理活性成分的有機酸、萜類酶基因及其編碼產物與應用，屬于藥用植物基因工程領域。
【背景技術】
[0002]藥用植物活性成分的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成相關功能基因的研究逐漸成為研究的熱點，這些基因的克隆將為解析藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調控機制和解釋藥材品質的形成提供理論基礎，同時為利用生物技術提高目標成分含量或直接生產有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。藥用植物的化學成分復雜、種類繁多，其中主要含有有機酸類、黃酮類、揮發油、萜類、二萜類、微量元素等多種成分，芍藥Paeonia lactif 1ra不僅是名花,還是一味常用中藥,其根可供藥用。其中白茍具有鎮痙、鎮痛、通經等作用。芍藥根中含有芍藥苷、安息香酸等活性成分，其中芍藥苷屬于單萜類化合物，具有顯著的鎮痛、鎮靜、抗驚厥、，解痙、解熱、抗炎、抗潰瘍、抗過敏、降血糖、調節免疫、保護肝臟等作用(楊俊，方紅編。芍藥[M]。北京:中國中醫藥出版社，2001，113)。
[0003]脫氧木酮糖-5-憐酸合酶(l-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase, DXS)是位于質體中的萜類化合物生物合成途徑脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑的起始酶，能將丙酮酸和甘油醛-3-磷酸轉化生成DXP，現在普遍認為DXS是DXP途徑的關鍵酶和限速酶，其表達量可能 與芍藥苷等萜類成分的含量密切相關。芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因的克隆，為利用基因工程提高芍藥活性成分含量提供重要物質基礎，在藥材芍藥的品質改良、活性成分合成生物學等方面，具有很好的應用前景。在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利中請中所提及的芍藥中脫氧木酮糖-5-磷酸合酶基因及其氨基酸序列。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因。
[0005]本發明第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質。
[0006]本發明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細胞。
[0007]本發明的另一個目的在于提供該基因的應用。
[0008]本發明所提供的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因，為以下核苷酸序列之一:
[0009](I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0010](2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。[0011]該基因所編碼的蛋白質為芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因，是以下氨基酸序列之一:
[0012](I)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。
[0014]本發明所提供的脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因是首次從芍藥中克隆制備的，體外實驗表明，PLDXS具有催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生成DXP的活性。利用本發明可以通過基因工程技術來提高芍藥等植物中萜類物質含量。
【專利附圖】

【附圖說明】:[0015]圖1:PLDXS功能域預測分析(來源于NCBI數據庫)；
[0016]圖2 =PLDXS系統進化樹(鄰接法)；
[0017]圖3:表達載體pET32-PLDXS構建；
【具體實施方式】
[0018]實施例1、芍藥cDNA文庫的構建
[0019]1、芍藥總RNA的分離和檢測
[0020]取茍藥(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末,快速轉移至 65°C預熱的 IOmL 提取緩沖液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol.l-1，EDTA25mmol.?Λ NaCl 2.0mol.?Λ PVP402%，亞精胺 0.5g/L，巰基乙醇 2% )，充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提兩次，7500g離心15分鐘。上清液加入1/4體積的IOM LiCl，混勻后放置 4°C沉淀過夜；7500g 離心 20 分鐘，沉淀用 500yL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol.?ΛTris-HCl (ρΗ8.0) IOmmol.?Λ EDTA lmmol.?Λ 在 65°C溶解 5 分鐘。用等體積氯仿抽提，13000g離心5分鐘；上清液加入2倍體積無水乙醇，_70°C放置2小時；4°C 13000g離心20分鐘，沉淀室溫干燥10分鐘后溶于IOOy L DEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用GenQuant核酸定量儀測定Α260、Α280比值和濃度。置于_80°C冰箱備用。
[0021]2、cDNA文庫的構建
[0022]米用mRNA 純化試劑盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分離 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Cat.N0.634903)進行建庫，原理為 SMART (switch mechanism at 5 ' end of mRNAtemplate)。
[0023]實施例2:芍藥相關基因的克隆
[0024]隨機挑取5000個單克隆進行菌落PCR鑒定。取適量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的滅菌水。用滅過菌的IOul小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。依次加入:Taq buffer 2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.8μ L, dNTP (2.5mM) I μ L, M13+ 引物(IOpmol) I μ L，M13-引物(IOpmol) I μ L，Taq SI 0.4 μ L0 PCR 反應條件為 94°C預變性 5 分鐘后，94°C 40秒，54°C 40秒，72°C 4分鐘，35個循環后72°C延伸10分鐘，4°C保存。待PCR反應進入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR產物加入3ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，半小時后照相，觀察膠圖，根據膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。選擇條帶單一擴增產物送至華大基因公司進行測序，獲得芍藥相關基因序列。[0025]實施例3、PLDXS基因的生物信息學分析
[0026]本發明涉及的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶基因全長cDNA的長度為2160bp，詳細序列見序列表中的序列1，其中開放讀碼框位于l_2160bp。將芍藥全長cDNA序列用 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBankCDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR 數據庫中進行核苷酸同源性檢索。該基因在氨基酸水平上與其它物種中的DXS有較高的同源性，同時具有典型的l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 結構域。如圖1。
[0027]實施例4、PLDXS基因功能的研究
[0028]1.重組質粒的構建
[0029]以PLDXS cDNA 為模板，利用引物 Pl:5' -GGATCCATGGGTACTGCTTCTGCTCATTAC-3',P2:5/ -GGTACCCTAGCACATCAAAAGGAGAGCTTCA-3'進行 PCR 反應，反應體系同實驗例 2。取5ul擴增產物加入3ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，半小時后照相，觀察膠圖，擴增片段為2172bp。用BamH I和Kpn I在37°C下雙酶切擴增產物2小時，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產物。同時利用BamH I和Kpn I在37°C下酶切pMD19_T載體2小時，加入5ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，并利用回收試劑盒回收片段。
[0030]回收片段經T4連接酶在8°C連接過夜。電擊轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選重組子。含PLDXS克隆的pMD19質粒經PCR和限制性內切酶酶切鑒定和DNA序列分析，保存具有正確目標序列的重組質粒pMD 19-PLDXS。
[0031]2.原核表達及載體構建
[0032]BamH I和Kpn I雙酶切pMD 19-PLDXS質粒和pET 32a質粒，分別回收目標片段PLDXS和開環的pET32a片段。回收片段PLDXS和pET 32a于16°C連接過夜，獲得重組質粒，經PCR和限制性內切酶酶切鑒定和DNA序列分析，證明含有正確序列的PLDXS，該表達載體命名為 pET32-PLDXS(圖 3)。
[0033]用目標質粒pET32-PLDXS利用CaCl2方法轉入E.coli BL21感受態細胞，培養篩選含有pET32-PLDXS質粒的陽性菌株。挑取單菌落的工程菌于3ml含100 μ g/ml氨芐青霉素LB培養基中振搖培養過夜，按1: 100的濃度吸取培養液于新的LB培養基(含100 μ g/ml氨芐青霉素)中培養約3小時，至0D600達0.5后，取Iml菌液作為誘導前對照，然后加入終濃度為lmmol/L的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，在37°C振蕩培養中誘導工程菌表達，于誘導3h后取樣1ml，以含有pET32a空載體的E.coli BL21培養物為陰性對照。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明，在分子量約為78.89kD處，出現一條明顯的特異蛋白質表達條帶，與理論值一致。
[0034]3.PLDXS基因功能分析
[0035]BamH I和Kpn I雙酶切pMD 19-PLDXS質粒和pTrc-AtlPI質粒，分別回收目標片段PLDXS和大片段pTrc骨架，于16°C連接回收片段，獲得重組質粒，經PCR和限制性內切酶酶切鑒定和DNA序列分析，證明含有正確序列的PLDXS，
[0036]將pTrc-PLDXS轉化攜帶pAC_LYC質粒的大腸桿菌XLl-Blue，并在含有Amp (100 μ g/ml)和Cm(50 μ g/ml)的LB培養基上篩選陽性克隆。
[0037]將攜帶番茄紅素生物合成途徑上香葉基香葉基焦磷酸合成酶(crtE)、八氫番茄紅素合成酶(crtB)、八氫番茄紅素脫飽和酶(crtl)3個關鍵酶基因的原核表達載體pAC-LYC導入大腸桿菌菌株XLl-Blue后，可以在本底水平上表達番茄紅素。當把pTrc-PLDXS導入上述重組菌后，由于突破了上游途徑的代謝瓶頸，推動代謝流向番茄紅素合成的方向流動，使該菌能大量積聚番茄紅素。
[0038]本發明挑取分別含有Ll-Blue+pTrc-PLDXS、XLl-Blue+pTrc-PLDXS+pAC-LYC 的大腸桿菌單克隆，在含有Απιρ(100μ g/ml)和Cm(50yg/ml)的LB培養基上，于28 °C倒置暗培養，2~3天后觀察菌落顏色變化情況。以含有XLl-Blue、XLl-Blue-+pAC-LYC、XLl-BIue+pTrc+pAC-LYC大腸桿菌單克隆為對照。
[0039]實驗結果表明，72h培養后，XLl-Blue 空菌、XLl-Blue+pTrc-PLDXS、XLl-Blue+pAC-LYC都不能生長；XLl-Blue+pTrc+pAC_LYC未攜帶PLDXS，不能過量表達番茄紅素，所以菌落仍呈現XL1-Blue本身的淡黃色；只有XLl-Blue+pTrc-PLDXS+pAC-LYC由于能大量表達番茄紅素，經培養后，菌落呈現番茄紅素特有的紅色。從而證明了 PLDXS可以推動代謝流向番茄紅素合成的方向流動，使該菌能大量積聚番茄紅素。
[0040]4.突變DXS活性測定
[0041]以PLDXS cDNA 為模板，利用突變引物 P3:5' -GGATCCATGGGTACCGCTTCTGCTCATTAC-3/ , P4:5/ -GGTACCCTAGCACATCAAAAGGAGAGCTTCA-3'進行 PCR 反應，重組質粒的構建、原核表達及載體構建、PLDXS功能分析方法同上，結果表明突變PLDXS轉基因工程菌株與正常PLDXS沒有顯著差異。
【權利要求】
1.一種芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列； (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.—種芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一: (1)具有SEQID N0.2所不的氣基酸序列； (2)SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。
3.重組載體，其特征在于:含有權利要求1所述的芍藥脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因全序列或部分序列。
【文檔編號】C12N9/10GK103627717SQ201210296844
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月21日 優先權日:2012年8月21日
【發明者】黃璐琦, 袁媛, 汪周勇 申請人:中國中醫科學院中藥研究所