專利名稱：用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑的酵母模型及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑的酵母模型及其構建方法，以及利用該酵母模型篩選抑制昆蟲幾丁質合成的活性物質的方法。
背景技術：
傳統殺蟲劑的篩選思路是先篩選對昆蟲有毒性的化合物，然后確定其作用靶點。這種篩選方法的缺陷性是比較盲目，篩選得到的化合物往往對人畜毒性大，容易污染環境，而且研發周期長、成本高。作用于昆蟲特有的代謝途徑(如幾丁質合成酶)的生物農藥被稱為“二十一世紀農藥”，對環境和人畜非常安全，是新型生物農藥的研發熱點。近年來，雖然該領域獲得了一些可喜的研究成果，但由于受到篩選方法落后的制約，沒有取得突破性的進展。因此，篩選新型殺蟲劑的關鍵是建立一套快速有效的篩選方法。
幾丁質是NDP-乙酰氨基葡萄糖(NDP-GlcNAc)的聚合物。幾丁質是昆蟲表皮(外骨骼)的主要成分，也是許多昆蟲腸道表皮的重要成分。任何干擾昆蟲幾丁質合成的物質都會對昆蟲的生長和發育產生劇烈的影響。幾丁質合成酶(NDP-GlcNAc轉移酶，E2.4.1.16)是催化生成幾丁質聚合反應的關鍵酶。近年來，干擾幾丁質合成途徑是新型生物農藥研發的熱點，取得了一些研究成果。苯甲酰基苯基脲類即除蟲脲是最為成功的例子。但是除蟲脲只是偶然發現的，而且沒有直接作用在幾丁質合成酶上，更多是全身性的影響。其他作用于這個位點的化合物如尼可霉素和Polyxin等，普遍藥效比較低且容易產生抗、耐藥性。因此目前迫切需要篩選作用于昆蟲幾丁質合成酶的新化合物。
迄今已克隆了果蠅等少數模式昆蟲的幾丁質合成酶基因，但對昆蟲幾丁質合成酶缺乏系統的研究，酶促反應機理尚不清楚。幾丁質也是真菌細胞壁的主要組成成分。相比昆蟲，真菌的幾丁質合成酶(chitin synthase，CHS)研究得比較深入。已經在真菌中分離到6種幾丁質合成酶的同功酶，其中CHS1、CHS2、CHS3比較普遍。也已經克隆了部分真菌的幾丁質合成酶的基因。在釀酒酵母中有CHS1、CHS2和CHS3三種同功酶，每個酶具有不同的功能和位點，其中CHS1和CHS3同時缺陷會引起酵母細胞的死亡。CHS3催化大部分的幾丁質的合成。研究表明，昆蟲和酵母幾丁質合成酶的不同之處主要是C-端和N-端的氨基酸殘基變化，而催化域的氨基酸殘基同源性非常高。昆蟲和酵母幾丁質合成酶體外酶促反應要求的條件基本一致，且底物與產物相同。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑的酵母模型及其構建方法，以及應用該酵母模型篩選抑制昆蟲幾丁質合成的活性物質。篩選出來的活性物質可以開發為新型高效、高選擇性昆蟲生長調節劑。
本發明的用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑的酵母模型由指示菌酵母A(W303)、酵母B( CHS2)和酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)三種不同基因型的酵母組成。
其中，指示菌酵母A是現有酵母(W303)；指示菌酵母B( CHS2)是阻斷酵母幾丁質合成酶CHS2基因的基因工程菌酵母( CHS2)；指示菌酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1)是整合表達昆蟲幾丁質合成酶催化域和阻斷酵母幾丁質合成酶CHS1基因的基因工程菌酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
本發明的用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑的酵母模型的構建方法包括1.用現有的PCR基因阻斷技術阻斷酵母(W303)的幾丁質合成酶基因CHS2(genebank序列號M23865，網址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，獲得重組子酵母( CHS2)。
具體方法是用PCR方法擴增酵母幾丁質合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段，大小為100到500。通過PCR融合或者用酶切連接，將酵母幾丁質合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段分別與選擇標記基因融合，產生兩段融合DNA。采用PEG轉化法、電轉化法或者CaCl2轉化法等合適的方法，將上述兩個融合片段轉化酵母(W303)感受態細胞。在選擇性平板上篩選目的重組子，即酵母的幾丁質合成酶基因CHS2編碼區大部分被選擇標記基因取代的重組子。這些重組子CHS2被阻斷，不能合成CHS2。通過PCR或者采用其他方法如Northern雜交來鑒定重組子。
2.在酵母( CHS2)中整合表達果蠅幾丁質合成酶基因，得到重組子酵母( CHS2，DmCS-1+)再采用現有的PCR基因阻斷技術阻斷該酵母( CHS2，DmCS-1+)的幾丁質合成酶基因CHS1(genebank序列號M14045，網址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)；獲得重組子酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
昆蟲和酵母幾丁質合成酶的不同之處主要是C-端和N-端的氨基酸殘基變化，而催化域的氨基酸殘基同源性非常高。幾丁質合成酶C-端和N-端的氨基酸序列主要功能是酶的定向運輸。在昆蟲中幾丁質合成酶的表達和運輸中有組織專一性，而酵母只是單細胞無組織。因此用昆蟲的幾丁質合成酶取代酵母的幾丁質合成酶的功能，只需要用昆蟲幾丁質合成酶催化域替換酵母的幾丁質合成酶的催化域。這樣既可以實現催化功能，又能讓雜合的幾丁質合成酶運輸到合適的位置。因此，酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)具體方法可以是(1).果蠅幾丁質合成酶基因的催化域是由其編碼序列的第一個外顯子編碼的。用PCR方法擴增果蠅幾丁質合成酶基因DmCS-1(genebank序列號AF227729，網址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的催化域編碼序列。用PCR方法擴增酵母幾丁質合成酶(CHS1)的催化域上游的編碼序列和催化域下游的編碼序列。通過PCR融合或者用酶切連接等方法，將CHS1催化域上游的編碼序列、果蠅幾丁質合成酶基因的催化域編碼序列、CHS1催化域下游的編碼序列按順序連接起來。連接產物克隆到整合型表達載體，得到果蠅幾丁質合成酶的整合表達載體(含有雜合幾丁質合成酶基因的表達載體)，并在大腸桿菌中增殖。用內切酶(位點在CHS1的催化域上游的序列內，至少離起始堿基100bp)線性化含有雜合幾丁質合成酶基因的表達載體，轉化酵母( CHS2)的感受態細胞。在選擇性平板上篩選目的重組子。通過PCR或者采用其他方法如Northern雜交來鑒定重組子。獲得重組子酵母( CHS2，DmCS-1+)。
(2).采用與上述步驟1阻斷CHS2一樣的方法，用PCR基因阻斷技術，阻斷酵母( CHS2，DmCS-1+)的幾丁質合成酶基因CHS1；不同之處是來自酵母的兩個片段是幾丁質合成酶基因CHS1保守域的5’端和3’端片段。獲得重組子酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
3.由現有野生型酵母(W303)與上述獲得的重組子酵母( CHS2)和酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作為指示菌，構成本發明的用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑的酵母模型。
上述構建的本發明酵母模型可用于篩選抑制昆蟲幾丁質合成酶的活性物質，包括抑制昆蟲幾丁質合成酶的物質(化合物)和能產生抑制昆蟲幾丁質合成酶活性物質的微生物。抑制昆蟲幾丁質合成酶的活性物質可以開發為新型昆蟲生長調節劑，用于害蟲的防治。
應用本發明酵母模型篩選抑制昆蟲幾丁質合成酶的活性物質的具體方法是同時以酵母A(W303)、酵母B( CHS2)、酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作為指示菌，以已知的幾丁質合成酶抑制劑為正對照；分別將正對照抑制劑和供試物質加入培養有指示菌的細胞培養板，繼續培養一段時間；根據指示菌生長狀況，按以下篩選供試物質如果供試物質與正對照抑制劑一樣只抑制酵母C的生長，對酵母A和酵母B沒有抑制作用，說明供試物質能抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性，可以用于開發為昆蟲生長調節劑；如果供試物質同時抑制酵母C和酵母B的生長，對酵母A沒有抑制作用，說明供試物質不但能抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性也能抑制酵母幾丁質合成酶的活性，可以用于開發為殺菌劑或者殺蟲劑。
應用本發明酵母模型篩選產生抑制昆蟲幾丁質合成酶的活性物質的微生物的具體方法是同時以酵母A(W303)、酵母B( CHS2)、酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作為指示菌，以已知的幾丁質合成酶抑制劑為正對照，以供試微生物培養物上清液為供試物質；分別將正對照抑制劑和供試物質加入培養有指示菌的細胞培養板，繼續培養一段時間；根據指示菌生長狀況，按以下篩選供試物質如果供試物質與正對照抑制劑一樣只抑制酵母C的生長，對酵母A和酵母B沒有抑制作用，說明供試微生物能產生抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性物質，可以用于開發生產昆蟲生長調節劑；如果供試物質同時抑制酵母C和酵母B的生長，對酵母A沒有抑制作用，說明供試微生物產生的活性物質不但能抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性也能抑制酵母幾丁質合成酶的活性，可以用于開發生產殺菌劑或者殺蟲劑本發明用昆蟲幾丁質合成酶基因取代酵母的幾丁質合成酶基因，在酵母中表達昆蟲幾丁質合成酶滿足酵母幾丁質合成的需要；構建了以昆蟲幾丁質合成酶為靶標的酵母篩選模型；并應用該模型建立了一種新的昆蟲幾丁質合成酶抑制劑篩選方法；該方法是一種新型生物農藥篩選方法，其所篩選的活性物質靶標非常專一，具有高度選擇性；克服了傳統篩選方法靶標比較盲目，篩選的化合物往往對人畜毒性大和容易污染環境，而且研發周期長、成本高的缺點；同時與傳統的篩選方法相比，本方法對活性物質更為靈敏，能有效的檢測出不同來源的、傳統篩選方法難以檢測到的低濃度的抑制昆蟲幾丁質合成酶活性物質。這些活性物質可以開發為具有高度選擇性的新型生物農藥，用于害蟲防治。
以下通過附圖和實施例對本發明作進一步說明。


圖1是果蠅幾丁質合成酶的整合表達載體的結構示意圖；圖2是用酵母模型篩選產抑制昆蟲幾丁質合成酶活性物質的微生物的流程圖。
具體實施例方式
實施例1構建篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制的酵母模型1.采用PCR基因阻斷技術阻斷酵母(W303)的幾丁質合成酶基因CHS2，構建酵母( CHS2)以酵母(W303)的DNA為模板，用引物1和2擴增出幾丁質合成酶基因CHS2 5’端片段。PCR反應體系包括20ng酵母DNA，5μM引物1、2各1μl，5μl 10倍PCR緩沖液，5μl 2mMdNTPs，1U pfu酶，加雙蒸水至50μl。反應程序為94℃變性4分鐘，接著30個溫度循環(94℃1分鐘，55℃30秒，72℃2分鐘)，再72℃8分鐘，最后保持在4℃。
以酵母(W303)的DNA為模板，用引物3和4擴增出幾丁質合成酶基因CHS2 3’端片段。PCR反應體系和反應程序與擴增幾丁質合成酶基因CHS2 5’端片段一樣。
以質粒Ycp50的DNA為模板用引物5和6擴增出選擇標記基因URA3編碼DNA。PCR反應體系包括20ng Ycp50，5μM引物5、6各1μl，5μl10倍PCR緩沖液，5μl2mMdNTPs，1U pfu酶，加雙蒸水至50μl。反應程序為94℃變性4分鐘，接著30個溫度循環(94℃1分鐘，52℃30秒，72℃2分鐘)，再72度8分鐘，最后保持在4℃。用低熔點瓊脂糖電泳回收PCR產物。
將CHS2 5’端片段和選擇標記基因URA3編碼DNA混合，先在65℃下進行融合，作為模板，用引物1和引物6進行融合擴增。PCR反應體系包括兩個DNA片段各20ng，5μM引物1、6各1μl，5μl10倍PCR緩沖液，5μl2mMdNTPs，1U Taq酶，加雙蒸水至50μl。反應程序與擴增幾丁質合成酶基因CHS2 5’端片段，用低熔點瓊脂糖電泳回收PCR產物。
用CHS2 5’端片段和選擇標記基因URA3編碼DNA PCR融合的方法，將CHS2 3’端片段和選擇標記基因URA3編碼DNA融合。
用PEG轉化法將上述兩個融合PCR產物轉化感受態酵母細胞。用選擇性平板上篩選目的重組子(URA+， CHS2)，即酵母的幾丁質合成酶基因CHS2編碼區大部分被選擇標記基因取代的重組子。這些重組子CHS2被阻斷，不能合成CHS2。
重組子鑒定采用PCR方法。以重組子的DNA為模板，用引物5和6作為特異性引物進行PCR反應。PCR條件和程序和擴增選擇標記基因URA3一樣。用瓊脂糖電泳檢測PCR產物，如果有目的帶，就說明是目的重組子。
選擇標記基因的重組消除。因為選擇標記基因URA3的兩端有添加的100bp的同向重復序列，相對容易發生重組(10-4-10-5)，從而丟失選擇標記基因URA3。這種重組子(URA-， CHS2)用含有5-FOA的培養基篩選到。
最后獲得重組子酵母(URA-， CHS2)。
2.構建酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+
(1).酵母(URA-， CHS2)中整合表達果蠅幾丁質合成酶基因的催化域果蠅幾丁質合成酶基因的催化域是由其編碼序列的第一個外顯子編碼的。設計引物7(5’端有內切酶SacI酶切位點)和引物8(5’端有內切酶NruI酶切位點)用于擴增果蠅幾丁質合成酶基因的催化域。設計引物9和10用于擴增酵母幾丁質合成酶CHS1的催化域上游的序列，包括部分啟動子序列。其中引物10含有與引物7一樣的內切酶位點SacI，引物9含有與載體相連的內切酶位點BglII。設計引物11與12用于擴增酵母幾丁質合成酶CHS1的催化域下游的序列，包括終止子序列。其中引物11含有與引物8一樣的內切酶位點NruI，引物12含有與載體相連的內切酶位點SalI。
以果蠅DNA為模板，用引物7和8擴增果蠅幾丁質合成酶基因的催化域，PCR反應條件如下PCR反應體系包括模板DNA20ng，5μM引物5、4各1μl，5μl10倍PCR緩沖液，5μl2mM dNTPs，IU Taq酶，加雙蒸水至50μl。反應程序為94℃變性4分鐘，接著30個溫度循環(94℃1分鐘，50℃30秒，72℃2分鐘)，再72℃8分鐘，最后保持在4℃。以酵母DNA為模板，用引物9和10擴增CHS1的催化域上游的序列，用引物11和12擴增CHS1的催化域下游的序列。PCR反應條件與擴增果蠅幾丁質合成酶基因的催化域的PCR反應條件一樣。用內切酶消化上述PCR產物，然后用T4連接酶連接。以連接產物為模板，用引物9和12擴增雜合DNA。用瓊脂糖電泳回收PCR產物。
用BglII和NmI雙酶切回收的PCR產物，用T4連接酶連接到酵母質粒pPICaBglII和NruI雙酶切的大片段上，轉化大腸桿菌DH5α。挑選轉化子，培養提取質粒，得到的質粒即為含有雜合幾丁質合成酶基因的表達載體，命名為DmCS-1 Expresion，其結構如圖1所示。用內切酶AvaII線性化該表達載體。采用PEG轉化法轉化感受態酵母細胞( CHS2)。在含有抗生素ZeocinTM的選擇性平板上篩選目的重組子。通過PCR方法鑒定重組子。獲得重組子酵母( URA-， CHS2，DmCS-1+)。
(2).采用PCR基因阻斷技術阻斷酵母( CHS2，DmCS-1+)的幾丁質合成酶基因設計引物13和14擴增酵母幾丁質合成酶基因CHS1保守域5’端。引物13的5’端20個堿基與選擇標記基因URA3的3’端20個堿基互補。設計引物15和16擴增酵母幾丁質合成酶基因CHS1保守域3’端。引物15的5’端與選擇標記基因URA3的5’端20個堿基互補。
以上述(1)所得到的酵母(URA-， CHS2，DmCS-1+)的DNA為模板，用引物13和14擴增出幾丁質合成酶基因CHS1保守域5’端片段。用引物15和16擴增出幾丁質合成酶基因CHS1保守域3’端片段。以酵母穿梭質粒Ycp50或者其他含有選擇標記基因的DNA為模板，用引物5和6擴增出選擇標記基因URA3編碼DNA。用瓊脂糖電泳方法回收PCR產物。
將上述回收的PCR產物中的幾丁質合成酶基因CHS1保守域5’端片段和選擇標記基因編碼DNA混合，先在65℃下進行融合，作為模板，然后加入引物13和引物6以及其他PCR反應需要的試劑，進行融合PCR反應。PCR產物為幾丁質合成酶基因CHS1保守域5’端片段和選擇標記基因編碼DNA的融合DNA片段。用瓊脂糖電泳方法回收PCR產物。采用同樣的方法，PCR融合回收的PCR產物幾丁質合成酶基因CHS1保守域3’端片段和選擇標記基因URA3編碼DNA。
采用PEG轉化法，將上述兩個融合片段轉化感受態酵母細胞(URA3+， CHS2，DmCS-1+)。在選擇性平板上篩選目的重組子(URA+)，即酵母的幾丁質合成酶基因CHS1保守域編碼區大部分被選擇標記基因取代的重組子。這些重組子CHS1保守域被阻斷，不能合成有功能的CHS1。通過PCR方法鑒定重組子。獲得重組子酵母(URA+， CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
本實施例中所用到的各引物如下引物1AGGACTCTCCCTTGGGATG引物2CTGGACCTTGAACGACAAT引物3ATCATTACGACCGAGATTCC引物4GGGTTTCAATTCAATTCATCA引物5TTGTTACTGGGCTGTTGCT引物6GGAATCTCGGTCGTAGTAATGATGCTAACAGCAACTCTCGGT引物7TGATGAATTGAATTGAAACCCGCTGGGGTGATAGATGGTA引物8AGCAACAGCCCAGTAACAATCTCATTGCTCTCCACCTAT引物9AGATCTTCAGTAAGACGCTATTGGAC引物10GGATCCCCATCTTCTGTAGTATTAATCTTA引物11GCTAACAGCAACTCTCGGT引物12TTGTTACTGGGCTGTTGCT引物13ACCGAGAGTTGCTGTTAGCCTTAGTAATGCTAGCGAGCG引物14AGCAACAGCCCAGTAACAAGTCCGTCATATTCCTGTGGC引物15AGATCTCGGGGGAGCGCATACTTTAA引物16GAGCTCCATTGTATAGTTTTTTTGGT本實施例中所用PEG轉化法的具體操作步驟及條件如下接種5ml液體YPAD，30℃下振蕩過夜。計數過夜培養物細胞密度，以最終5×106個/ml的細胞密度接種YPAD培養液。置30℃，200r/min振蕩培養至2×107個細胞/ml。2500r/min離心5min，收獲細胞。棄培養液，把細胞懸浮在25ml無菌水中，同上離心。棄水，把細胞懸浮在1ml的100mmol/L醋酸鋰中，轉懸浮物到一個無菌1.5ml離心管。高速離心沉淀細胞，吸出醋酸鋰。懸浮細胞到最終500μl。將1ml單鏈擔體DNA煮沸5min，快速在冰水中冷卻。振蕩細胞懸浮液，取50μl樣品加到標記的離心管中，離心沉淀細胞，除去醋酸鋰。小心按下列順序加入下列轉化混合液240μl PEG(50％w/v)，36μl 1.0mol/L醋酸鋰，25μl 單鏈載體DNA(2.0mg/ml)，50μl 水和質粒DNA(0.1-10μg)；劇烈振蕩反應管直到細胞完全混勻，置30℃保溫30min。置42℃水浴中熱激20-25min。8000r/min離心15秒，除去轉化混合液。吸0.2-1.0ml無菌水加到每個反應管中，懸浮沉淀，用等份的200μl轉化混合液涂選擇平板。
YPAD培養基酵母粉10g蛋白胨20g
葡萄糖20g硫酸腺嘌呤40mg蒸餾水1000ml121℃滅菌15min。
3.將上述獲得的重組子酵母(URA-， CHS2)和酵母(URA+， CHS2， CHS1，DmCS-1+)與現有野生型酵母(W303)一起作為指示菌，構成酵母模型，用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑。實施例2用酵母模型篩選產抑制昆蟲幾丁質合成酶活性物質的微生物(1).用96孔板微量培養供試微生物，培養基(LP)成分為淀粉1％、蛋白胨1％、牛肉膏0.3％。30℃振蕩培養72小時，8000r/min離心10分鐘。
(2).培養指示菌酵母A(W303)、酵母B(URA-， CHS2)和酵母C(URA+， CHS2， CHS1，DmCS-1+)。培養基(YNP)為1％硫酸銨、1％硫酸鉀、0.5硫酸鎂、0.05硫酸鈣、0.5％磷酸氫二鉀、0.8％磷酸二氫鉀和0.02％YPN溶液。30℃振蕩培養至OD610為2-4時，加入96孔板，每個孔加100μl。
(3).在有指示酵母的96孔板中加微量(每個孔30μl)上述(1)培養的供試微生物上清液(供試物質)，以10uM尼可霉素作正對照，培養12小時，用酶標儀測定OD610。如果供試物質和尼可霉素一樣只抑制酵母C的生長，對酵母A和酵母B沒有抑制作用，說明供試物質能抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性，即供試微生物能產生抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性物質；如果供試物質同時抑制酵母C和酵母B的生長，對酵母A沒有抑制作用，說明供試物質(供試微生物產生的活性物質)可能不但能抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性也能抑制酵母幾丁質合成酶的活性。整個流程如圖2所示。實施例3用酵母模型篩選抑制昆蟲幾丁質合成酶的化合物(1).用培養基(YNP)培養指示菌酵母A、酵母B和酵母C。方法和條件與實施例2步驟(2)相同。
(2).在有指示酵母的96孔板中加50ppm對硫磷、10uM尼可霉素(每個孔30μl)，培養12小時，用酶標儀測定OD610。尼可霉素只抑制酵母C的生長，對酵母A和酵母B沒有抑制作用，說明尼可霉素抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性。酵母C、酵母A和酵母B都不受對硫磷抑制，說明對硫磷殺蟲的活性是作用在其他的靶標。
權利要求
1.用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑的酵母模型，由指示菌酵母A(W303)、酵母B( CHS2)和酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)三種不同基因型的酵母組成。
2.根據權利要求1所述的酵母模型，其特征是其中所說的指示菌酵母A(W303)A是現有酵母(W303)；指示菌酵母B( CHS2)是阻斷酵母幾丁質合成酶CHS2基因的基因工程菌酵母( CHS2)；指示菌酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)是整合表達昆蟲幾丁質合成酶催化域和阻斷酵母幾丁質合成酶CHS1和CHS2基因的基因工程菌酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
3.權利要求1所述酵母模型的構建方法，包括(1).用現有的PCR基因阻斷技術阻斷酵母(W303)的幾丁質合成酶基因CHS2，獲得重組子酵母( CHS2)；(2).在(1)獲得的酵母( CHS2)中整合表達果蠅幾丁質合成酶基因，得到重組子酵母( CHS2，DmCS-1+)；再采用現有的PCR基因阻斷技術阻斷該酵母( CHS2，DmCS-1+)的幾丁質合成酶基因CHS1，獲得重組子酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)(3).將現有酵母(W303)與上述獲得的重組子酵母( CHS2)和酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)一起作為指示菌，構成用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑的酵母模型。
4.按照權利要求3所述的方法，其特征是構建酵母( CHS2)的具體方法是用PCR方法擴增酵母幾丁質合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段，大小為100到500；通過PCR融合或者用酶切連接，將酵母幾丁質合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段分別與選擇標記基因融合，產生兩段融合DNA；將上述兩個融合片段轉化酵母(W303)感受態細胞；在選擇性平板上篩選酵母的幾丁質合成酶基因CHS2編碼區大部分被選擇標記基因取代的重組子；通過PCR或者Northern雜交鑒定重組子，獲得重組子酵母( CHS2)。
5.按照權利要求3所述的方法，其特征是構建酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)的具體方法是(1).用PCR方法擴增果蠅幾丁質合成酶基因DmCS-1的催化域編碼序列；用PCR方法擴增酵母幾丁質合成酶CHS1的催化域上游的編碼序列和催化域下游的編碼序列；通過PCR融合或者用酶切連接方法，將CHS1催化域上游的編碼序列、果蠅幾丁質合成酶基因的催化域編碼序列、CHS1催化域下游的編碼序列按順序連接起來；連接產物克隆到整合型表達載體，得到含有雜合幾丁質合成酶基因的表達載體；用內切酶線性化該含有雜合幾丁質合成酶基因的表達載體，轉化酵母( CHS2)感受態細胞；在選擇性平板上篩選目的重組子；通過PCR或者Northern雜交鑒定重組子，獲得重組子酵母( CHS2，DmCS-1+)(2).用PCR方法擴增酵母幾丁質合成酶基因CHS1保守域的5’端和3’端片段，大小為100到500；通過PCR融合或者用酶切連接，將酵母幾丁質合成酶基因CHS1保守域的5’端和3’端片段分別與選擇標記基因融合，產生兩段融合DNA；將上述兩個融合片段轉化酵母( CHS2，DmCS-1+)感受態細胞；在選擇性平板上篩選酵母的幾丁質合成酶基因CHS1編碼區大部分被選擇標記基因取代的重組子；通過PCR或者Northern雜交鑒定重組子，獲得重組子酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
6.權利要求1或2的酵母模型用于篩選抑制昆蟲幾丁質合成酶的物質。
7.按照權利要求6所述的應用，其特征是同時以酵母A(W303)、酵母B( CHS2)、酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作為指示菌，以已知的昆蟲幾丁質合成酶抑制劑為正對照；分別將正對照抑制劑和供試物質加入培養有指示菌的細胞培養板，繼續培養一段時間；根據指示菌生長狀況，按以下篩選供試物質如果供試物質與正對照抑制劑一樣只抑制酵母C的生長，對酵母A和酵母B沒有抑制作用，說明供試物質能抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性，可以用于開發為昆蟲生長調節劑；如果供試物質同時抑制酵母C和酵母B的生長，對酵母A沒有抑制作用，說明供試物質不但能抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性也能抑制酵母幾丁質合成酶的活性，可以用于開發為殺菌劑或者殺蟲劑。
8.按照權利要求6所述的應用，其特征是用所述的酵母模型篩選產抑制昆蟲幾丁質合成酶活性物質的微生物。
9.按照權利要求8所述的應用，其特征是同時以酵母A(W303)、酵母B( CHS2)、酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作為指示菌，以已知的昆蟲幾丁質合成酶抑制劑為正對照，以供試微生物培養物上清液為供試物質；分別將正對照抑制劑和供試物質加入培養有指示菌的細胞培養板，繼續培養一段時間；根據指示菌生長狀況，按以下篩選供試物質如果供試物質與正對照抑制劑一樣只抑制酵母C的生長，對酵母A和酵母B沒有抑制作用，說明供試微生物能產生抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性物質，可以用于開發生產昆蟲生長調節劑；如果供試物質同時抑制酵母C和酵母B的生長，對酵母A沒有抑制作用，說明供試微生物產生的活性物質不但能抑制昆蟲的幾丁質合成酶的活性，也能抑制酵母幾丁質合成酶的活性，可以用于開發生產殺菌劑或者殺蟲劑。
全文摘要
本發明涉及一種用于篩選昆蟲幾丁質合成酶抑制劑的酵母模型及其構建方法和應用。本發明采用PCR基因阻斷技術阻斷酵母(W303)的幾丁質合成酶基因CHS2，獲得重組酵母(⊿CHS2)；在酵母(⊿CHS2)中整合表達果蠅幾丁質合成酶基因，再阻斷該酵母的幾丁質合成酶基因CHS1，獲得重組酵母(⊿CHS2，⊿CHS1，DmCS－文檔編號C12Q1/00GK1428432SQ0215203
公開日2003年7月9日 申請日期2002年11月25日 優先權日2002年11月25日
發明者陳志仕, 劉陽, 楊杏, 徐濤, 張文慶, 鐘英長 申請人:中山大學