專利名稱：一種新式核酸聚合酶反應方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術，更具體地說涉及一種生物化學反應的方法。
核酸是生物物種的遺傳物質，它包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。核酸的基本組成是四種核苷酸(或堿基)，在DNA中它們分別由A、C、G、T代表，在RNA中它們分別由A、C、G、U代表。核苷酸(堿基)在核酸中以串聯的方式組成鏈狀結構，DNA一般為雙鏈結構，RNA為單鏈結構；DNA的雙鏈結構可以在適當的條件下分解成單鏈，單鏈的DNA也可以與單鏈的RNA形成雙鏈結構。在一核酸結構中，一部分可以是單鏈另一部分可以是雙鏈。在雙鏈的核酸結構中堿基A與另一鏈的T(U)通過氫鍵形成堿基對，同理G與另一鏈的C形成堿基對，能形成堿基對的堿基為互補堿基。如一核酸鏈與另一核酸鏈有完全互補的堿基序列，則這兩條核酸鏈稱為互補核酸鏈，互補的核酸鏈可形成穩定的雙鏈結構，由互補的兩單鏈分子結構形成雙鏈分子結構的過程稱為分子雜交。非完全互補的核酸鏈(部分互補)在特定條件下也會形成雙鏈分子結構。在生物體及試管中，單鏈的核酸鏈可在酶的作用下復制出互補的核酸鏈，在復制過程中，被復制的核酸鏈稱為模板分子，所需的酶為聚合酶，聚合酶可分為DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶等。DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA互補鏈，RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA互補鏈，逆轉錄酶以RNA為模板合成DNA互補鏈。引物為核酸片段，它與模板分子互補并雜交形成雙鏈結構。核酸聚合酶反應的始點決定于引物的位置，DNA的聚合反應從引物的3’末端開始(DDNA及cDNA聚合反應)。RNA聚合酶反應需要有雙鏈的被RNA聚合酶識別的結構，稱為驅動子。引物核酸片段可以由幾個或幾十個堿基(核苷酸)組成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通過降解自然核酸而取得的片段，也可以通過人工化學合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的組成單位(結構)，非自然的組成單位(結構)包括在自然界中不是核酸組分的結構，也包括不存在于自然界的化學結構。通過引物與模板分子的雜交，可以控制模板分子的復制以技模板分子的擴增。聚合酶鏈反應(PCR)是利用兩個引物分別與DNA的兩條互補鏈雜交，在聚合酶的作用下復制出相應的互補鏈，用同樣的引物對同樣序列的核酸模板反復進行如上反應，即可得到數量巨大的核酸分子。這一被復制或被擴增的模板序列稱為靶序列。由引物引發的聚合反應或擴增反應常用于分子生物學的基礎研究，基因工程，以及遺傳診斷和與分子生物學相關的檢測。在這些應用中，反應中所需要的試劑(反應試劑)要進行混合然后在試管或其他反應器中進行反應。反應試劑根據反應性質可分為通用試劑如水、緩沖液等；和專一試劑，專一試劑包括引物、酶等。一種反應試劑在某個反應中可能是專一試劑，在另一反應中可能是通用試劑。一般來說通用試劑指的是同一批的多個反應中的共同試劑，專一試劑是多個反應中，個別反應所需的試劑。另外反應中可以加入添加劑，添加劑在反應中不參與反應。常用的添加劑包括蛋白質(如牛血清蛋白、明膠)、多糖類化合物(如淀粉、藻膠)等，另外有些人工合成的化合物也可以用作添加劑(如線形聚丙烯酰胺)。添加劑一般為水溶性的，在低溶度下(＜10％)不會影響酶反應。添加劑的特性包括溶于水后會膨脹并可形成膠狀物態，可起到膠合劑作用；去水后會收縮、結塊，也可以固化，形成固化物。反應器一般由塑料制成，有管狀、槽狀、盤狀等，反應器可以是單獨的反應空間也可以是多個反應空間反應器組。條件化反應器是指預先置有專一試劑的反應器(即置有專一試劑的反應器稱為條件化反應器)。當對一個樣品中核酸的多個靶片段進行聚合酶反應時，要有多個專一的反應引物或其他相應的專一試劑。已有的常用的反應方法是在反應前把相應的專一試劑和通用試劑混合，然后分配到指定的容器中，這種方法是要將多個(種)專一試劑與通用試劑分別進行混合，這需要大量的工作量，很容易出現差錯。另外還有一種方法是將專一試劑預先放入到反應器中，但專一試劑干后成散粉狀態，影響專一試劑的可靠性、穩定性，并容易造成污染，不利于保存、運輸。
本發明的目的是提供一種新式聚合酶反應方法，它能克服現有技術的上述不足。
一種新式核酸聚合酶反應方法，包括預先制備條件化反應器，把液相試劑分配到多個條件化反應器中，然后對多個不同的核酸靶分子進行復制或擴增，其特征是一種液相試劑與多個條件化反應器中置有的固化試劑進行聚合酶反應，反應時液相試劑與多個固化試劑接觸，并使固化試劑溶解釋放出各自的反應試劑共同參與反應。
實施一種新式核酸聚合酶反應方法的裝置，包括條件化反應器2，其特征是條件化反應器2內裝置有固化試劑3。
本發明的優點是在進行重復性多的聚合酶反應時，只須在條件化反應器中加入通用試劑，反應后可得到專一的反應結果。這一方法可以大量減少聚合酶反應(包括PCR)的操作，因而能降低成本，在醫療診斷中減少差錯，并可防止產物污染。
下面通過實施例和


本發明。
附圖為本發明裝置的結構示意圖。
本發明的裝置有反應容器1，其內側底面有條件化反應器2，條件化反應器2內裝置有固化試劑3。
對病人的血樣品進行甲、乙、丙肝炎病毒的檢驗，首先按已知的病毒核酸序列設計出擴增核酸所需的6個引物(PCR引物)共3對(專一試劑)，它們分別與相應的病毒核酸序列有專一性。用化學方法合成這些引物并測定其濃度，用水配制10％的淀粉液添加劑加熱溶解后分成三份，每份1毫升，這三份淀粉液分別與三對引物混合形成復合物，使引物的濃度為5微摩爾濃度(5μM)，淀粉濃度為5％，然后把10微升與甲型肝炎相對應的混合物分配到標有“甲”的條件化反應器2中，用同樣方法分別把10微升與乙型和丙型肝炎相關的復合物分別分配到標有“乙”和“丙”的條件化反應器2中，復合物在條件化反應器2中固化形成固化試劑，最后得到標有甲、乙、丙的三種含有固化試劑的條件化反應器2。對病人進行檢測時，從病人體中抽取血樣，分別提取核酸(RNA和DNA)，提取的核酸(核酸樣品)與一液相試劑混合，液相試劑的成分包括聚合酶(具有逆轉錄酶活性和DNA聚合酶活性)、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)、緩沖液等。把病人的核酸樣品、液相試劑分配到各條件化反應器2中，條件化反應器2中的固化試劑溶解并釋放出專一試劑(專一引物)，專一引物與核酸樣品的核酸雜交，在聚合酶的作用下，對病毒RNA進行逆轉錄反應，然后對DNA、cDNA進行PCR擴增。所有聚合酶反應在定量PCR儀中進行，擴增的結果可直接從儀器中取得。根據反應結果可以對病人的病情做出判斷。
根據本發明方法所生產的固化試劑可以制成小顆粒狀，可具不同形狀(如圓、矩形等)。小顆粒狀的固化試劑是在一個較大的反應器中混合制成后，然后壓(拉)長再分割成許多微小的顆粒，顆粒的形狀與大小可用機械加工；小顆粒狀的固化試劑外表包裹著一層添加劑制成的保護膜。在使用時可將多種(個)不同的小顆粒狀的固化試劑固定在反應器內，然后再加入液相試劑進行反應。小顆粒狀的固化試劑的體積≤8mm3。
本發明方法所述的液相試劑是溶于水和緩沖液的通用試劑；或者是溶于水和緩沖液的專一試劑；或者是溶于水和緩沖液的通用試劑和專一試劑的復合物。
本發明方法所述的固化試劑是專一試劑和添加劑的復合物，其中添加劑的含量≤99.996；或者是通用試劑和添加劑的復合物，其中添加劑的含量≤99.9％。固化試劑基本不含水分。
本發明方法所述的固化試劑是在條件化反應器2內混合合成；也可以先混合合成再加入到條件化反應器2內。
本發明方法所述的條件化反應器，是含有一反應空間的反應器；可以是含有多個反應空間的反應器組；也可以是一形狀各異的反應器；也可以是一平面反應器；也可以是生物芯片，即將生物芯片做為一反應器。
根據本發明方法可以生產一種新型的生物芯片，一種方法是在生物芯片基板上制作多個小孔(不透孔)每個小孔都是一個反應器，在小孔內加入專一試劑的復合物并使之固化形成固化試劑；二是將已制作好的多種(個)小顆粒狀的固化試劑固定在生物芯片上。
根據本發明方法可以生產試劑盒，試劑盒內包括含有條件化反應器2或者小顆粒狀的固化試劑，包括反應所需的酶、溶液、沖洗液以及用于信號檢測的熒光材料。
用此方法進行的聚合酶反應是在定量PCR進行，定量PCR儀能在PCR反應過程中通過光學系統觀測反應的進行程度。
此方法可用于RNA靶分子，進行逆轉錄反應然后進行聚合酶鏈反應。用反應結果判斷基因表達或測定RNA病毒(微生物)的種類和數量。
此方法可用于DNA靶分子進行聚合酶鏈反應，或由逆轉錄反應、DNA聚合反應、RNA聚合反應等組成的恒溫擴增反應。通過擴增的結果判定靶片段的存在或判斷靶片段的基因型，以及判斷相關物種的數量。
此方法可對病毒和微生物進行檢測，用于商檢、環保、醫療、食品衛生等。
此方法可對人類、動物、植物進行檢測，用于防病治病、藥物開發、遺傳育種、物種鑒定、刑偵等。
權利要求
1.一種新式核酸聚合酶反應方法，包括預先制備條件化反應器，把液相試劑分配到多個條件化反應器中，然后對多個不同的核酸靶分子進行復制或擴增，其特征是一種液相試劑與多個條件化反應器中置有的固化試劑進行聚合酶反應，反應時液相試劑與多個固化試劑接觸，并使固化試劑溶解釋放出各自的反應試劑共同參與反應。
2.實施一種新式核酸聚合酶反應方法的裝置，包括條件化反應器2，其特征是條件化反應器2內裝置有固化試劑3。
3.如權利要求1所述的方法，其特征是固化試劑是專一試劑和添加劑的復合物，其中添加劑的含量≤99.9％。
4.如權利要求1所述的方法，其特征是固化試劑是通用試劑和添加劑的復合物，其中添加劑的含量≤99.9％。
5.如權利要求1所述的方法，其特征是固化試劑是在條件化反應器2內混合合成。
6.如權利要求1所述的方法，其特征是固化試劑是先混合合成再加入到條件化反應器2內。
7.如權利要求1所述的方法，其特征是一種成小顆粒狀的固化試劑，小顆粒狀的固化試劑的體積≤8mm3。
8.如權利要求1所述的方法，其特征是固定多個小顆粒狀的固化試劑在反應容器內，然后再加入液相試劑進行反應。
9.如權利要求2所述的裝置，其特征是所述的條件化反應器是具有多孔結構的生物芯片。
10.如權利要求2所述的裝置，其特征是所述的條件化反應器是一生物芯片，在生物芯片基板上固定多個小顆粒狀的固化試劑。
全文摘要
一種新式核酸聚合酶反應方法，其特征是一種液相試劑與多個條件化反應器中置有的固化試劑進行聚合酶反應，反應時液相試劑與多個固化試劑接觸，并使固化試劑溶解釋放出各自的反應試劑共同參與反應。所用的裝置包括條件化反應器內裝置有固化試劑。本發明的優點是在進行重復性多的聚合酶反應時，只須在條件化反應器中加入通用試劑，反應后可得到專一的反應結果。這一方法可以大量減少聚合酶反應(包括PCR)的操作，因而能降低成本，在醫療診斷中減少差錯，并可防止產物污染。
文檔編號C12Q1/68GK1490412SQ0311205
公開日2004年4月21日 申請日期2003年3月28日 優先權日2003年3月28日
發明者吳昌, 吳 昌 申請人:吳昌, 吳 昌