專利名稱：兔單克隆抗體的人源化方法
技術領域：
本發明的領域屬于抗體，特別是對兔單克隆抗體進行人源化的方法。
背景技術：
由于單克隆抗體能靶向實質上任何具有某種特異性的分子，因此，單克隆抗體及其綴合物和衍生物都將可能成為未來的一種主要的治療劑。盡管人們早已認識到這種可能性，但是為了實現這種可能性進行的第一次嘗試卻以失敗而告終，其主要原因是，即使是治療中使用的單克隆抗體僅以單一低劑量注射一次(Dillman，Cancer Biother 1994917-28)，單克隆抗體也會在患者體內產生強烈的免疫反應(Schroff，1985 Cancer Res 45879-85，Shawler.J Immunol 1985 1351530-5)。科學家們預言，人抗體不會產生這種不良的免疫反應，但目前的雜交瘤技術還無法產生人單克隆抗體。此后，其它一些可替代性的制備人抗體的技術已經陸續面世，例如使用噬菌體展示(Phage display)和轉基因動物。然而，嚙齒類動物抗體已經具備了良好的實用性和充分表征的抗原特異性，因此，我們仍然有必要設計出能夠克服嚙齒類動物抗體免疫原性的手段。此外，某些有用的抗原結合特性可能極為罕見，而且很難或是根本不可能在嚙齒類動物免疫系統之外重現。
抗體的免疫原性取決于多種因素，其中包括施用方法、注射的次數、劑量、結合反應性能、所采用的特異性片段、抗原的聚集狀態以及抗原的性質(例如，Kuus-Reichel，Clin Diagn Lab Immunol 19941365-72)。在這些因素中，很多或者絕大多數都是可以控制的，從而達到降低免疫反應的目的，但是，如果最初的抗體序列屬于“危險性”或是“異質性”的，那么，遲早都會出現強烈的免疫反應，進而制約了抗體在治療中的應用。
嵌合抗體的工程化使嚙齒類動物的FV片段與人的FC片段結合在一起(例如，Boulianne Nature 1984312643-6)，使得在治療中利用人類效應器結構域(Clark，Immunol Today 2000 21397-402)成為可能的同時，大幅度地降低了免疫原性問題(例如，LoBuglio，ProcNatl Acad Sci 1989864220-4)。此外，在構建人源化抗體的時候，FV本身的嚙齒類動物序列在至少保持其親本互補決定區(CDRs)的同時，結構盡可能地接近于人類序列(例如，Riechmann，Nature 1988332323-7)。人源化嚙齒類動物抗體在人類患者中也顯示出免疫原性的大為減少(Moreland，Arthritis Rheum 199336307-18)，盡管某些人源化抗體對絕大多數患者仍然是免疫原性的，但這更可能是嚙齒類動物互補決定區(CDRs)自身所固有的免疫原性造成的(Ritter，Cancer Res 2001 616851-9；Welt，Clin Cancer Res 200391338-46)。
目前(2003)，全世界臨床使用的單克隆抗體產品多達十幾種，已經創造了20億美元的收入，還有幾十種單克隆抗體產品處于臨床試驗階段。進入臨床使用的許多抗體屬于嵌合的、人源化或人類抗體，其中的絕大多數最初是鼠的單克隆抗體。
鼠抗體之所以得到廣泛的應用，不是由于它們具有其它物種的抗體所不具備的優勢，而是由于至今在非嚙齒類動物雜交瘤技術方面的欠缺。目前，這種狀況已經所有改變。兔子由于其自身所固有的強烈的免疫反應特性，及其生成對眾多表位具有高親合力抗體的能力，使之成為高質量抗體的最佳來源之一。最近，利用傳統的融合方法制備兔的單克隆抗體已經成為可能(Spieker-Polet，Proc Natl Acad Sci1995 929348-52)。因此，能生產非常高質量的單克隆兔抗體。
但是如果用于治療的話，和鼠抗體一樣，兔抗體同樣也會引起強烈的免疫反應，其將阻礙延長的重復施用。因此，在臨床使用之前，同樣需要制備嵌合的與人源化的兔抗體。然而，制備嵌合的與人源化的嚙齒類動物抗體的方法卻由于如下的原因而無法用于許多兔抗體
首先，很多兔抗體的κ鏈在可變區和恒定區之間具有二硫鍵。這種結構上的特征在制備嵌合與人源化抗體時帶來一個問題，據我們所知，這個問題尚未在研究中得到解決。同型κ-1(K-1)鏈是目前使用最多的兔抗體輕鏈。常見的五種K-1異型抗體中的三種(b4，b5和b6)在可變區(VK)骨架3的80位點處有一個半胱氨酸。該殘基的側鏈為裸露的，并可與恒定區κ鏈上的另一個半胱氨酸殘基形成二硫鍵。盡管兔的第四種常見K-1異型抗體--b9，也有多余的二硫化物，但是在這種情況下，可變區的半胱氨酸殘基占據了骨架4中VK的最后一個位置，殘基108。人抗體和嚙齒動物抗體的κ鏈中沒有這種多余的二硫鍵。因此，如果要想利用許多已知方法中的一種，通過連接兔的可變區κ鏈與人的恒定區κ鏈構建嵌合或人源化的抗體，可變區κ鏈的半胱氨酸殘基就會保持不成對狀態。這極可能會導致出現蛋白質的折疊和表達問題，并且即使獲得了高產量的折疊正確的抗體，不成對的半胱氨酸殘基也極有可能會導致抗體的一部分通過其VK半胱氨酸殘基形成二聚物，這通常是我們不希望看到的結果。
其次，相對于人類和鼠類的氨基酸殘基，很多兔類重鏈可變區在β鏈D和E之間的環上缺少一或兩個氨基酸殘基。此外，與人和鼠類的鏈相比，很多重鏈和輕鏈在氨基端上也缺少一個殘基。盡管在人和鼠類抗體中，這兩個區域一般不與抗原相接觸，但它們卻都非常接近于互補決定區(CDRs)，并且經常和互補決定區殘基相接觸。顯然，對于這些兔類的抗體鏈來說，由于不存在這些殘基的位置，因此，我們不能在所述位置上找到相應的同源的人類殘基。
第三，與人和鼠類的對應物相比，很多兔類的VH鏈有額外成對的半胱氨酸。例如，在某些兔類的VH鏈中，除了Cys22-Cys92“正常”的二硫鍵之外，不僅還有一個Cys21-Cys79的二硫鍵，而且在CDR H1的最后一個半胱氨酸殘基和CDR H2的第一個半胱氨酸殘基之間還有另一個二硫鍵。人們還經常在VK L3互補決定區中發現成對的半胱氨酸殘基。通過根據同源性把兔類抗體結構與已知結構進行的模型分析，我們可以看到，半胱氨酸對呈現出空間布置狀態，其允許二硫鍵的形成。
最后，很多兔類抗體CDR并不屬于前面已知的規范結構。尤其是VK CDR L3常常比已知的人或鼠類抗體L3 CDR長得多。由于以前缺少對兔類CDR結構的認識，使得人們很難精確地進行模型分析。
因此，由于兔類單克隆抗體的獨特性，目前對嚙齒類動物抗體進行人源化的方法并不能輕易用于對兔類單克隆抗體進行人源化。所以說，目前迫切需要一種對兔類抗體進行人源化的方法。本發明就是為了解決這一問題及其它相關要求。
參考文獻相關的參考文獻包括美國專利6,331,415 B1、5,225,539、6,342,587、4,816,567、5,639,641、6,180,370、5,693,762、4,816,397、5,693,761、5,530,101、5,585,089、6,329,551以及相關出版物，Morea等人，Methods 20267-279(2000)，Ann.AllergyAsthma Immunol.81105-119(1998)；Rader等人，J.Biol.Chem.27613668-13676(2000)；Steinberger等人，J.Bio.Chem.27536073-36078(2000)；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.91969-973(1994)；Delagrave等人，Prot.Eng.12357-362(1999)；Rogusca等人，Prot.Eng.9895-904(1996)；Knight和Becker，Cell 60963-970(1990)；Becker and Knight，Cell 63987-997(1990)以及Popkov，J Mol Biol 325325-35(2003)。

發明內容
本發明提供了一種對兔單克隆抗體進行人源化的方法。總體上看，這種方法包括對兔親本抗體的氨基酸序列與類似人抗體的氨基酸序列進行比較，改變兔親本抗體的氨基酸序列，以便使兔親本抗體的構架(FW)區與類似人抗體的相應構架區在序列上更為接近。在某些實施方案中，可以將來自兔抗體重鏈和輕鏈的FW1區替換為類似人抗體的對應的FW1區，在大多數實施方案中，其添加了至少一個氨基酸(也就是說，增加1、2、3或更多個氨基酸)到人源化的抗體序列，與親本抗體序列相比。在其它實施方案中，兔抗體重鏈可變區的整個D-E環可以被類似的人抗體的對應的環替代，在許多實施方案中，其添加了至少一個氨基酸(也即，1，2或3或更多個氨基酸)。在某些實施方案中，例如在抗體的輕鏈中存在一個半胱氨酸80的話，這個氨基酸被對應的氨基酸所替代，或被人抗體中對應的E-F環所替代。最后，被認為相互接近的半胱氨酸對也有可能會改變。在很多實施方案中，如果兔親本抗體中的氨基酸是互補決定區的接觸殘基、鏈間接觸殘基或隱蔽殘基，則這些氨基酸不加以修飾。
本發明還進一步提供了編碼目標抗體的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞和制備目標抗體的方法。目標抗體、核酸組合物以及試劑盒具有多種用途，包括診斷、治療及疾病和不適的研究。
在很多實施方案中，互補決定區(CDR)接觸所涉及的氨基酸選自重鏈可變區中的1，2，4，24，27，28，29，30，36，38，40，46，48，49，66，67，68，69，71，73，78，80，82，86，92，93和94位置上的氨基酸以及κ輕鏈可變區中的1，2，3，4，5，7，22，23，35，45，48，49，58，60，62，66，67，69，70，71和88位置上的氨基酸。
在很多實施方案中，鏈間接觸所涉及的氨基酸選自重鏈可變區中的37，39，43，44，45，47，91，103和105位置上的氨基酸以及κ輕鏈可變區中的36，38，43，44，46，85，87，98和100位置上的氨基酸。
在很多實施方案中，隱蔽殘基選自重鏈可變區中的6，9，12，18，20，22，76，82c，88，90，107，109和111位置上的氨基酸以及κ輕鏈可變區中的6，11，13，19，21，37，47，61，73，75，78，82，83，84，86，102，104和106位置上的氨基酸。
對于本領域技術人員來說，在詳細閱讀如下充分描述的本發明細節之后，必將會認識到本發明的這些和其它優點和特征。


圖1是一個說明了本發明的某些實施方案的圖例。
圖2克隆自不同兔雜交瘤的可變κ鏈(上部)和可變重鏈(下部)的多重序列比對。標準編號、β鏈(A，A′，B，C，C′，D，E，F，G)的位置見各隊列的上部。這些位置是以相關文獻為基礎的(Chothia JMol Biol 1998 278457-79)。UP4_31SEQ ID NO1；UP4_29SEQID NO2；UP4_23SEQ ID NO3；CALK_VKSEQ ID NO4；CD79_ASEQID NO5；UP3_4_VSEQ ID NO6；CS1_108SEQ ID NO7；CS1_115SEQ ID NO8；PLAP_VKSEQ ID NO9；B1_VKSEQ ID NO10；DEW76SEQ ID NO11；DEW148SEQ ID NO12；B1_VHSEQ ID NO13；DEW73SEQID NO14；DEW70SEQ ID NO15以及KabXSEQ ID NO16。
圖3是抗整聯蛋白β-6兔單克隆抗體B1人源化的多重序列比對。圖中所示的原始B1 VK和VH序列與它們各自最近的人類目的基因胚系序列和最終的人源化鏈序列進行了比對。為方便閱讀，比對在互補決定區(CDRs)和構架(FRs)的末端中斷。標準編號位于上部的基線位置。編碼上的陰影區說明了互補決定區的位置。其它陰影區域代表著不同于原始兔序列的構架位置。黑色單元部分為相對于人對應物而在兔序列中缺失的部分。由于部分人VK CDR3和全部VH CDR3沒有在人的胚系中被準確地編碼，因而在圖中沒有顯示出來。B1VKSEQ ID NO17；Hu_L12_JK4SEQ ID NO17；B1_VK_HZ1SEQ ID NO20；B1VHSEQ IDNO21；B1VH_HZ1SEQ ID NO22。
圖4顯示了VK和CK之間“額外”二硫鍵的Fab抗體片段，它存在于某些兔類κ鏈中，但不存在于人或鼠類的κ鏈中。
圖5顯示了三個互補決定區和D-E環位置的兔類VH區的結構。
定義在進一步敘述本發明之前，我們有必要認識到，本發明并不局限于描述的特定的實施方案，也就是說，在具體形式上可能存在著變化。還有一點需要提醒的是，由于本發明的范圍僅受附加的權利要求書的限制，因此，本文所使用的術語只是為了描述特定實施方案的目的，而不是為了限制本發明的目的。
除另有其它定義，否則，本文所使用的所有科學技術術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的意義相同。盡管與本文所述類似或等同的任何方法和材料都可用于實施本發明或是對本發明進行檢驗，但優選的方法和材料是現在描述的。對于本文所提及的所有出版物都引入這里作為參考，以結合所引用的出版物用于公開和描述本發明方法和/或材料。
必須注意的是，在正文及附加權利要求書中所用，除非上下文中另外清楚地指明，單數形式“a”，“an”和“the”包括復數形式。例如，“一種抗體”也包括這種抗體的復數形式，“一個構架區”即可以指一個構架區，也可以指多個構架區，以及本領域技術人員已知的其等價物，等等。
本文所提到的出版物僅為在本申請的申請日之前公開的內容。但此處公開的內容不得理解為承認本發明不具備因在先發明而早于所述出版物的資格。此外，所提供的出版物的日期可能會與實際出版日期有所不同，這一點可能需要單獨予以核實。
術語“宿主生物”是指所有能產生與兔具有相似可變區結構抗體的動物。示例的宿主生物包括人類、小鼠、大鼠等。
與另一個氨基酸殘基“緊密接觸”、“緊密接近”或“親近”的氨基酸殘基是其側鏈靠近另一個氨基酸的側鏈——即與另一個氨基酸側鏈的距離在7、6、5或4埃的氨基酸。例如，一個接近于互補決定區的氨基酸就是一個非互補決定區氨基酸，它的側鏈接近于互補決定區中的氨基酸的側鏈。
抗體重鏈或輕鏈的“可變區”是該鏈的N-末端成熟區域。所有區域、互補決定區和殘基的編號都是基于序列比對和結構知識指定的。構架殘基的識別和編號見Chothia等人的文章(Chothia免疫球蛋白可變區序列中的結構決定簇，J Mol Biol 1998；278；457-79)。
VH是抗體重鏈的可變區。VL是抗體輕鏈的可變區，它可能是κ(K)或λ的同型。K-2抗體具有κ-1同型，而K-2抗體則具有κ-1同型。VL是可變區的λ輕鏈。
“隱蔽殘基”是其側鏈相對可溶性低于50％的氨基酸殘基，可溶性是指在延伸的GGXGG(SEQ ID NO23)肽中相對于相同殘基X可溶性的百分比。可溶性的計算方法是本領域已知的，(Connolly 1983J.appl.Crystallogr，16，548-558)。
術語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可以互換使用。這些術語均為本領域技術人員所熟知的術語，具體是指由能特異結合抗原的一種或多種多肽構成的蛋白質。抗體的一種形式構成了抗體的基本結構單元。這種形式是四聚物，它由兩對完全相同的抗體鏈構成，每一對都有一個輕鏈和一個重鏈。在每對抗體鏈中，輕鏈和重鏈的可變區聯合在一起共同負責結合抗原，而恒定區則負責抗體的效應器功能。
目前已知的免疫球蛋白多肽包括κ和λ輕鏈，以及α、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、ε和μ重鏈，或它們的其它類型等價物。全長的免疫球蛋白“輕鏈”(大約25kDa或大約214個氨基酸)包含一個由NH2-末端上大約110個氨基酸形成的可變區，以及一個COOH-末端上的κ或λ恒定區。全長的免疫球蛋白“重鏈”(大約50kDa或大約446個氨基酸)，同樣包含一個可變區(大約116個氨基酸)，以及前面所述的重鏈恒定區之一，例如γ(大約330個氨基酸)。
術語“抗體”和“免疫球蛋白”包括任何同型體的抗體或免疫球蛋白，或保持與抗原特異結合的抗體片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及包含抗體的抗原結合部分和非抗體蛋白質的融合蛋白質。抗體可以進行可檢測標記的，例如，可以通過放射性同位素、能產生可檢測產物的酶、熒光蛋白質等等。抗體也可以與其它成分綴合，如特異性結合對的成員，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結合對)等等。抗體還可以結合于固態支持物上，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。該術語還包括Fab’，Fv，F(ab’)2和/或其它保持與抗原特異性結合的抗體片段。
抗體還可以以多種其它形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab′)2，以及雙功能(即雙特異性)雜合抗體(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17，105(1987))以及以單鏈形式(例如，Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird etal.，Science，242，423-426(1988)，在此引用作為參考)。(一般知識請參見Hood et al.，″Immunology″，Benjamin，N.Y.，2nd ed.(1984)，和Hunkapiller and Hood，Nature，323，15-16(1986)，)。
免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變區由一個“構架”區(FR)構成，這個“構架”區被三個高變區分開，也被人們稱為“互補決定區”或CDR。有關學者已經對構架區和互補決定區的范圍進行了精確的定義(見″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″E.Kabat etal.，U.S. Department of Health and Human Services，(1991))。不同重鏈或輕鏈構架區的序列在同物種之內保持相對保守性。抗體構架區——也就是由重鏈或輕鏈組成的組合構架區——其作用是確定互補決定區的定位和排列。互補決定區(CDRs)主要負責與抗原表位結合。
在嵌合抗體中，其重鏈和輕鏈基因一般是通過基因工程，由屬于不同物種的抗體可變區和恒定區構建的。例如，來自兔單克隆抗體基因可變區段可以連接于人的恒定區段，例如γ1和γ3。治療用嵌合抗體的一個例子是由兔抗體可變區或抗原結合區與人抗體恒定區或效應器區構成的雜合蛋白質(例如，由A.T.C.C.保藏登記號CRL 9688的細胞制備的抗-Tac嵌合抗體)，當然，也可以使用其它哺乳動物物種。
在本文中，術語“人源化抗體”或“人源化免疫球蛋白”指一種抗體，它包含兔抗體的一個或多個互補決定區；以及一個在人抗體序列上含有氨基酸替代和/或缺失和/或插入的兔構架區。提供互補決定區的兔免疫球蛋白被稱為“母體”或“受體”，提供構架改變的人抗體被稱為“供體”。人源化免疫球蛋白不需要存在恒定區，但如果存在的話，它們一般與人抗體的恒定區基本相同，即至少有約85-90％一致性，優選大約95％或更高的一致性。因此，在某些實施方案中，全長的人源化兔重鏈或輕鏈免疫球蛋白含有人的恒定區、兔的互補決定區以及具有許多“人源化”氨基酸變異的基本的兔構架區，這將在下面詳細描述。在很多實施方案中，“人源化抗體”是一種由人源化可變輕鏈和/或人源化可變重鏈構成的抗體。例如，人源化抗體可能不包括上述定義的典型嵌合抗體，例如因為嵌合抗體的全部可變區都不是人類的。通過“人源化”過程而進行了“人源化”的修飾抗體結合與提供互補決定區的親本抗體相同的抗原，這種抗體與親本抗體相比，其在人類中的免疫原性一般較低。
我們應該認識到，按本方法設計和制備的人源化抗體可能會具有其它的保守性氨基酸置換，而這些置換對于與抗原的結合或其它抗體功能基本上沒有影響。保守性置換是指預期的組合，如來自以下群組的組合gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg和phe，tyr。不存在于同一組中的氨基酸為“實質上不同的”氨基酸。
在本文中，術語“確定”、“測量”以及“評價”和“測定”可以互換使用，它們都包括定量和定性的測定方法。
術語“多肽”和“蛋白質”在本文中可以互換使用，它們都是指任何長度的聚合形式的氨基酸，可以包括編碼和非編碼的氨基酸、通過化學或生物化學修飾或衍生的氨基酸以及具有修飾肽骨架的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限于具有異源氨基酸序列的融合蛋白；具有異源和同源前導序列，帶有或不帶有N-末端甲硫氨酸殘基的融合蛋白；帶有免疫標記的蛋白；帶有可檢測融合伴侶的融合蛋白，例如包括熒光蛋白質、β-半乳糖苷酶、熒光素酶等等作為融合伴侶的融合蛋白，等等。
本文中所使用的術語“分離的”，即文中的分離抗體，指的是在純化之前感興趣的抗體至少60％、至少75％、至少90％、至少95％或至少98％，甚至是至少99％沒有抗體結合的其它成分。
術語“治療”及其它類似術語是指對哺乳動物的任何疾病或不適進行的任何治療，尤其是人或鼠類，包括a)預防疾病、不適或疾病或不適的癥狀出現在懷疑患有某種疾病但是還沒有診斷為患有該疾病的個體中；b)抑制疾病，不適，或疾病或不適的癥狀，例如抑制它的發展，和/或推遲它在患者身上的惡化或顯露；和/或c)緩解疾病，不適或疾病或不適的癥狀，例如使這種不適或疾病和/或其癥狀衰退。
術語“對象”、“宿主”、“患者”以及“個體”在本文中可以交替使用，具體是指接受診斷或治療的任何哺乳動物，尤其是指人類。其它對象可能包括牛、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠和馬等。
優選實施方案的祥述本發明提供了一種對兔單克隆抗體進行人源化的方法。總體上看，這種方法涉及到對兔親本抗體的氨基酸序列與類似人抗體的氨基酸序列進行比較，改變兔親本抗體的氨基酸序列，使其構架區與類似人抗體的相應構架區在序列上更為接近。在很多實施方案中，對于不屬于互補決定區接觸殘基、鏈間接觸殘基或隱蔽殘基的兔親本抗體中的氨基酸不加以修飾。本發明還進一步提供了編碼目標抗體的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞和制備目標抗體的方法。目標抗體、核酸和組合物以及試劑盒具有多種用途，包括診斷、治療以及疾病和不適的研究。
在進一步對本發明進行描述的過程中，首先將討論對兔單克隆抗體進行人源化的方法，然后，闡述按本文所介紹方法對人源化抗體進行編碼的核酸，最后，綜述各種相關方法以及它們在本文所討論系統中的典型應用。
對兔單克隆抗體進行人源化的方法本發明提供了一種兔單克隆抗體進行人源化的方法。這種方法一般包括改變抗體重鏈和輕鏈可變結構構架區的某些氨基酸，使人源化兔抗體的構架區與人抗體的構架區在序列上更為接近。與未經修飾的兔親本抗體相比，這些人源化的兔抗體在人宿主中一般具有較弱的免疫原性，同時保持以高親和力與抗原、一般是預先確定的抗原特異性結合。換句話說，本方法可以用于生產人源化的兔抗體，與兔親本抗體相比，人源化兔抗體在人宿主內具有較弱的免疫原性，從而與未經修飾的親本抗體結合的抗原的結合親和力為至少約107M-1的親和力，優選108M-1到1010M-1，或更高。在很多實施方案中，改變僅針對結構上不重要的氨基酸進行，這些結構上重要的氨基酸可能是互補決定區接觸殘基、鏈間接觸殘基或是隱蔽殘基，具體見本文詳細論述。在某些實施方案中，兔抗體重鏈和輕鏈的FW1區可能被類似人抗體的對應FW1區所替代，也就是說，與親本抗體序列相比，大多數實施方案中在人源化抗體序列上增加至少一個氨基酸(即1個、2個、3個或更多個氨基酸)。在其它實施方案中，兔抗體重鏈可變區的全部D-E環可能被類似人抗體的對應環所替代，在許多實施方案中，其增加至少一個氨基酸(即1個、2個、3個或更多個氨基酸)。在其它某些實施方案中，如果抗體輕鏈中存在cys80的話，該氨基酸被相應氨基酸所替代，或是E-F環被類似人抗體的對應E-F環所替代。最后，相互接近的半胱氨酸對也可能被改變。
本方法可以用于對所有兔抗體進行人源化。但是，在特定的實施方案中，本方法只能用于對具有輕鏈互補決定區3的兔抗體進行人源化，互補決定區3是一個“長的”互補決定區3，與長度一般為6個殘基的人和鼠輕鏈互補決定區3相比，它的長度通常為10、11、12、13、14或15個殘基。
人源化兔抗體在經濟上可以進行大批量生產和使用，例如，利用各種技術診斷和治療各種人類和鼠類疾病。
圖1是說明該方法某些實施方案的總體流程圖。按照圖1，在這些方法中，首先需要選擇兔子2進行免疫和產生單克隆抗體。也許可以選擇任何一只兔子4，或是在某些實施方案中，可以使用基因確定的兔子6。也可以根據抗體是否帶有VK-CK二硫鍵S-S，或是否需要具備VH的D-E環，選擇某些類型基因確定的兔子8。例如，可以使用bas兔子10制備沒有VK-CK二硫鍵的抗體，可以使用b9/b9兔子12制備有cys108但沒有cys80的抗體，或是可以用A2/A2兔子14制備一般不具有VH的D-E環缺失的抗體。在很多實施方案中，一旦確鑒定并制備了一種適當的單克隆抗體，編碼該抗體可變區的核酸就被克隆16并測序20，并確定抗體可變區的氨基酸序列。識別互補決定區CDR，通常按Chothia(見上文)或Kabat(見上文)的方案對氨基酸進行編號20。然后，類似的人抗體被識別出，并按照如下步驟改變兔抗體的序列a)將兔抗體重鏈和/或輕鏈可變區的N-末端替代為類似人抗體的對應部分24；b)將兔抗體的全部VH D-E環替換為類似人抗體的對應環26；c)將兔抗體輕鏈的cys80替換為類似人抗體的對應氨基酸，或是在其它實施方案中，將兔抗體的全部E-F環替換為類似人抗體的對應E-F環28；d)如果認為抗體中的半胱氨酸對緊密接近的話，去除抗體的半胱氨酸對30，以及e)不改變涉及互補決定區接觸32、鏈間接觸34，或是隱蔽殘基36的任何殘基。在人源化兔抗體的可變區序列進行設計之后22，通過兩種替代性示例方法40制備編碼可變區的核酸，這些方法對可變區的核酸進行重新合成42，或是改變兔親本單克隆抗體可變區的核酸，從而對人源化可變區進行編碼44。在制備過程之后，可以將可變區核酸克隆到適當的載體中，進行抗體的制備，在細胞中進行表達，對編碼的抗體進行表征46。
兔免疫球蛋白VH和VL鏈序列本方法的第一個步驟是取得兔單克隆抗體(“親本”抗體)的氨基酸序列。在很多實施方案中，單克隆抗體的特異性是已知的，但是在某些實施方案中，其特異性是未知的。
兔抗體是通過以一種抗原或是抗原的混合物對兔子進行免疫處理產生的，對編碼它們的核酸(尤其是cDNAs)進行測序，確定兔免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區序列。在上面的討論中，根據兔親本抗體的預期序列特征，可以在本方法中使用多種兔的基因型。一般而言，可以采用任何兔，包括具有basilea(bas)和b9/b9基因型和A2/A2的兔。這些核酸可分離自任何產生抗體的細胞或細胞的混合物，例如來自免疫處理的兔的骨髓和脾臟等部位的細胞，或是產生兔抗體的雜交瘤細胞。在大多數實施方案中，采用標準分子生物學技術，從這些細胞分離編碼抗體的核酸，這些技術包括聚合酶鏈反應(PCR)或逆轉錄PCR(RT-PCR)(Ausubel，et al，Short Protocols in MolecularBiology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995；Sambrook，et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。
在很多實施方案中，對兔親本抗體VH和VL區編碼的核酸分離自產生兔抗體的雜交瘤細胞。為了制備產生兔抗體的雜交瘤細胞系，需要用一種抗原對兔子進行免疫處理，一旦兔子產生某種特異性免疫反應，便將免疫兔子脾臟的細胞與漿細胞瘤細胞系，例如240E融合在一起(Spieker-Polet et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.929348-9352，1995)。在融合之后，將細胞在含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT)的培養基中培養，選擇用于雜交瘤生長，在經過2到3個星期之后，開始出現雜交瘤細胞集落。采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)對這些雜交瘤細胞培養上清液進行篩選，篩選抗體分泌，按照標準程序，選擇并繼續培養能分泌對某種抗原具有特異性的單克隆抗體的陽性克隆(Harlow et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，First Edition(1988)Cold spring Harbor，N.Y.；andSpieker-Polet et al.，見上文)。
在其它實施方案中，編碼兔親本抗體的核酸通過任何已知方法從細胞分離。典型的方法包括1)對從兔脾臟、骨髓、淋巴結或其它淋巴器官采集的細胞群體實施流式細胞計量術，之后進行單細胞選擇性平皿培養，例如，通過用帶標記的抗兔IgG對細胞進行溫育，用FACSVantage SE細胞分類器(Becton-Dickinson，San Jose，CA)對標記的細胞進行分類；以及2)在多孔板上按有限稀釋法對血漿細胞進行選擇性平皿培養。細胞可以直接分類進入包含RT-PCR緩沖液的96孔或384孔平皿，然后采用對IgG重鏈和輕鏈具有特異性的嵌套引物進行RT-PCR。作為對細胞進行分類的另一種方法，為了獲得單個B細胞，也可以采用有限稀釋細胞平皿培養法。
盡管本發明的方法適用于修飾任何兔類抗體，但一般還是用于修飾“天然”抗體，在這種情況下，抗體的輕免疫球蛋白和重免疫球蛋白是通過兔子的免疫系統自然選擇的，這與例如通過噬菌體展示制備的“非天然”成對的抗體是相反的。此處所述的抗體一般不與病毒外殼蛋白序列等病毒序列連接，也即可操作連接。
序列比較一旦確定兔親本抗體VH和VL區的氨基酸序列之后，一般應采用適當的編號系統對氨基酸進行編號，例如Chothia于1998年(見上文)或Kabat(見上文)提出的編號系統，同時通常鑒別互補決定區和/或構架殘基。然后，序列與人類免疫球蛋白序列數據庫，一般是種系序列進行比較，從而鑒別類似的人抗體。這個類似的人抗體可以稱為“供體”抗體，因為氨基酸一般是從人抗體轉移到兔子的親本抗體。一般情況下，利用適當的比較程序對兔的親本抗體VH或VL序列與數據庫，例如BLASTP和FASTP，以默認設置進行比較，類似的人抗體被確定為在氨基酸序列同一性方面(通過同一性百分比或P值)具有與親本抗體可變區序列最相近的10個(或者，在某些實施方案中3個之一或最高的一個)類似可變區(VL或VH)之一。被選擇的供體抗體可變區一般在構架區內至少約55％，至少約65％，至少約75％，至少約80％，至少約85％，至少約90％或至少約95％的氨基酸序列與親本構架區一致。在某些實施方案中，將序列與未保存在數據庫中的氨基酸序列，例如與新測序抗體的序列進行比較。
在大多數實施方案中，可以采用同一個人抗體的重鏈和輕鏈作為供體。
可以對各抗體數據庫進行調查，以鑒別針對給定兔免疫球蛋白序列的類似人抗體免疫球蛋白(一般是種系抗體序列)。除了國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫之外，其它幾個常用的數據庫如下V BASE_人類抗體基因數據庫該數據庫由英國劍橋的醫療研究理事會(MRC)維護，并通過醫療研究理事會的全球互聯網公布，網址為mrc-cpe.cam.ac.uk。該數據庫是綜合性目錄，全部為依靠一千多個已公開序列編譯得到的人類種系可變區序列，其中包括美國國家生物技術情報中心(Genbank)和歐洲分子生物學實驗室(EMBL)數據文庫目前公布的基因序列。
具有免疫學重要性的蛋白質序列的Kabat數據庫(Johnson，G和Wu，TT(2001)，Kabat數據庫及其應用未來的方向。核酸研究，29205-206)，見芝加哥西北大學網址(immuno.bme.nwu.edu)。kabat數據庫還可以獲自國家健康協會/美國國家生物技術信息中心(nih/ncbi)的網址。
Immunogenetics數據庫由歐洲生物信息學會維護，并刊載于該學會的網址www.ebi.ac.uk。該數據庫是一個專業數據庫，它包括了在免疫系統的功能中重要基因的核苷酸序列信息。該數據庫收集并解釋了屬于免疫球蛋白超家族、與免疫識別有關的序列。
ABG鼠類種系基因的目錄——鼠類VH和VK種系區段的目錄，墨西哥國立大學生物技術學會抗體組的部分網頁。
可以通過內置搜索引擎搜尋在氨基酸序列同源性方面類似的基因序列。在本發明的方法中，采用缺省參數運行BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215403-10，1990)，包括BLOSUM62矩陣的選擇，預期臨界值為10，低復雜性過濾器設置為關閉，允許間隙，字號為3。
兔單克隆抗體的人源化本發明提供了一種可以對兔抗體進行人源化的方法。在這種方法中，可以修飾兔抗體VH和VL域的構架區，使之與上述確定的類似人抗體更為接近。總之，這些方法在總體上與其它對兔抗體進行人源化的方法(例如互補決定區嫁接、抗體再涂層等方法)相互兼容(即在實施其它方法的時候可以同時采用)。
一般情況下，這種方法包括將親本抗體的VH和VL區的序列與供體抗體的VH和VL區進行排列比對，改變親本抗體VH和VL構架區的序列，使之與供體抗體的序列更為接近。總體上看，它涉及將兔抗體序列的特定氨基酸氨基酸替換為供體抗體對應的氨基酸(即按照上述的編號方案，在相同的位置上替換)。換句話說，“對應”的含義是，在對兩個序列進行比對，將供體序列上的氨基酸殘基放置在親本序列上的殘基的對應處。當然，本領域已知(例如，Roguska et al，P.N.A.S. 91969-973，1994；Kabat 1991 Sequences of Proteinsof Immunological Interest，DHHS，Washington，DC)，有的時候，應該在一個或兩個序列上產生1、2或3個缺口，或是插入1、2、3或4或更多個氨基酸從而完成排列比對。這樣，在很多實施方案中，在一個兔親本抗體序列中插入空隙，或缺失氨基酸，從而完成兔親本序列和人序列之間的排列比對。
在其它實施方案中，本方法涉及到兔抗體的一個區替換為供體抗體對應的一個區。與親本抗體序列相比，被替換的區可以增加或缺失氨基酸。在大多數實施方案中，被替換的氨基酸并非是相鄰的，可能由一組親本抗體和供體抗體之間不同的非相鄰氨基酸組成。因此，在某些實施方案中，按照下面所討論的限制條件，在人源化方法中，將供體人抗體構架區替換為人親本抗體的構架區，從而對兔抗體進行人源化。如果與兔抗體序列相比的話，人抗體序列多出一個氨基酸，那么，一般需要在兔抗體序列中增加一個氨基酸，同樣，如果與兔抗體序列相比的話，人抗體序列缺少一個氨基酸，那么，在人源化過程中，一般需要在兔抗體序列中缺失一個氨基酸。
可變區的N-末端與人VH鏈的N-末端相比，兔子的全部三個主要VH1同種異型(A1，A2，A3)的抗體VH區都具有預計缺少一個殘基的N-末端(即這些抗體的FR1區)。但是，由于VH基因在兔中比VH1基因使用的頻率低，因此，并非所有的兔抗體重鏈都有一個長度較短的N-末端。實際上，在我們所克隆的可變κ鏈中，大約有一半比其它兔的VK和比所有人的VK在其N-末端缺少一個殘基(見圖2)。
總之，除了下面提到的某些氨基酸之外，兔抗體的全部FR1區(即抗體重鏈的N-末端區，這個抗體又是第一個互補決定區(CDR1)的第一個氨基酸的N-末端，包括A鏈、A’鏈和B鏈的一部分)被供體抗體的全部FR1區所替代，這樣，人源化兔抗體重鏈和輕鏈的前三個N-末端殘基(1，2和3)與供體人抗體重鏈和輕鏈的前三個N-末端殘基完全匹配。在本發明的大多數實施方案中，殘基VK22，VH24，VH27，VH28，VH29和VH30不應該變化，因為它們非常接近于互補決定區。可以對殘基VK11，VK13，VK19，VH9，VH12和VH18進行保守的氨基酸替換。
VH的D-E環圖5說明D-E環相對于抗體重鏈的CDR的位置。三個主要VH1同種異型的兩個(A1，A3)具有D-E環區，在一般情況下，與人和兔的A2同種異型VH鏈相比，它們分別缺少一到兩個殘基。在親和力成熟期間，這個區的氨基酸殘基數是可以改變的，但一般很少出現變化。按照本發明，通過將從72一直到77位置的六個相鄰的兔殘基替換為被選擇供體抗體序列的對應殘基，對D-E環進行人源化。在某些實施方案中，可以采用如下的序列替代兔抗體序列的72到77殘基可以采用DTSKNQ(SEQ ID NO24)，DNSKNT(SEQ ID NO25)、DNAKNS(SEQ ID NO26)，或是在某些實施方案中DDSKNS(SEQ IDNO27)，DDSKNT(SEQ ID NO28)，DESTST(SEQ ID NO29)，DGSKSI(SEQID NO30)、DKSIST(SEQ ID NO31)，DKSKNQ(SEQ ID NO32)、DKSTST(SEQ ID NO33)、DMSTST(SEQ ID NO34)，DNAKNT(SEQ ID NO35)，DNSKNS(SEQ ID NO36)、DRSKNQ(SEQ ID NO37)，DRSMST(SEQ IDNO38)，DTSAST(SEQ ID NO39)、DTSIST(SEQ ID NO40)，DTSKSQ(SEQ ID NO41)，DTSTDT(SEQ ID NO42)、DTSTST(SEQ ID NO43)，DTSVST(SEQ ID NO44)，ENAKNS(SEQ ID NO45)或NTSIST(SEQ IDNO46)。
在可選擇的實施方案中，可以從對A2同種異型純合的兔獲得具有正確長度D-E環的兔抗體。
VK C80/E-F環兔抗體的κ鏈，例如屬于κ-1 b4、b5以及b6同種異型的κ鏈，在位點80處有一個半胱氨酸殘基(cys80)，它在κ恒定區與一個半胱氨酸殘基形成二硫鍵(見圖4)。如果存在于兔抗體中的話，應該將cys80突變為非半胱氨酸殘基。一般情況下，雖然可以用任何其它氨基酸替代cys80，但是，pro、ala或ser(P，A，S)是最經常使用的。在其它實施方案中，可以使用被選擇供體抗體相應位置(即VK80)上的殘基。
在可選擇的實施方案中，可以采用兔制備在位置80處不包含半胱氨酸殘基的兔抗體，在所述的兔中，產生缺少包含cys80的VK-CK二硫鍵的κ鏈。尤其是，basilea(bas)兔只能產生VK κ-2同型和λ鏈，兩者都沒有所述二硫鍵。此外，還可以采用來自b9/b9純合兔的抗體，因為它們不需要利用Cys80。但是，在來自b9/b9兔的抗體中，cys108卻形成了二硫鍵。
在另一種用于替代兔抗體Cys80的實施方案中，如果兔親本抗體輕鏈存在一個E-F環(VK77到VK83之間的殘基)的話，E-F環被其它序列，如來自所選擇供體抗體的序列所替代。這7個氨基酸一般被替換成以下的氨基酸序列SLQPEDF(SEQ ID NO47)或RVEAEDV(SEQID NO48)；或NIESEDA(SEQ ID NO49)、RLEPEDF(SEQ ID NO50)、SLEAEDA(SEQ ID NO51)、SLEPEDF(SEQ ID NO52)、SLQAEDV(SEQID NO53)、SLQPDDF(SEQ ID NO54)、SLQPEDI(SEQ ID NO55)、SLQPEDV(SEQ ID NO56)或SLQSEDF(SEQ ID NO57)。在某些實施方案中，在任何人抗體中發現的任何不包含半胱氨酸殘基的對應序列都可以使用，包括被選擇供體抗體中的序列。
在這7個殘基中，處于位置82的殘基必須總是D(asp)。如在兔中發現的，如果對應的人殘基具有明顯不同的尺寸、電荷或疏水性，處于位置78和83的殘基應當保留，因為這些殘基經常處于隱蔽狀態。在大多數情況下，無論是兔還是人VKs，處于位置78的兔殘基都是保守的(V，L，I或M)，但這卻不適用于處于位置83的殘基，因為它的電荷和大小在兔和人VKs之間存在著顯著的差異。因此，在很多實施方案中，殘基83保持完整，而所有的E-F環氨基酸都可以按照上述的序列之一加以改變。
其它半胱氨酸對對于在位置108上擁有一個半胱氨酸殘基的兔κ鏈，例如κ-1 b9同種異型的那些抗體，半胱氨酸殘基可以改變為其它任何其它殘基，但一般是見于人抗體相同位置上的殘基，例如所選擇的供體抗體。
除了VK cys80或cys108之外，兔抗體的可變區經常具有其它人抗體中不存在的其它半胱氨酸。通過模型分析，或是與一種已知結構進行比較，抗體的相互接近的其它半胱氨酸對——即足夠接近以通過二硫鍵鍵合，應該予以改變。在某些實施方案中，一對結合半胱氨酸殘基中的一個半胱氨酸殘基被改變，而在其它實施方案中，結合成對的兩個半胱氨酸殘基都被改變。因此，在很多實施方案中，本過程包括確定一對彼此極為接近的半胱氨酸(例如，在大約4，5，6或大約7埃之內)，并將兩個半胱氨酸殘基都改變為其它氨基酸。這些半胱氨酸殘基可以改變為任何其它氨基酸，一般為另一個抗體，例如被選擇的供體抗體，相應位置上的非半胱氨酸氨基酸。
在特定的實施方案中，兔的VH半胱氨酸對cys21/cys79可以改變為S21/Y79、T21/S79或是在其它實施方案中，變為S21/H79和T21/V79。
一般情況下，不應該改變包含在互補決定區之一內的假定半胱氨酸對。但是確實存在某些例外情況。其中一個例外情況是存在于互補決定區內的VH35-VH50半胱氨酸(按Kabat的定義，1991，見上文)。按照結構模型，這兩個半胱氨酸的側鏈都處于隱蔽狀態，此外，這兩個半胱氨酸占據的位置都在β鏈上。因此，在這種情況下，任選地將半胱氨酸改變為對應的人殘基。
對于上述的抗體修飾，無論是單獨進行還是與其它任何方法同時進行，都不得修飾表1所示的氨基酸，或是在其它實施方案中，可以對處于隱蔽的氨基酸進行保守的改變。這些氨基酸還將在下面詳細加以介紹，它們預計將變成與互補決定區緊密接近的氨基酸，形成不同的鏈或是隱蔽的氨基酸。
互補決定區接觸互補決定區H3一般不能有把握地建模，不管采用何種產生抗體的動物物種都如此。尤其兔抗體包含有一個比人或小鼠長(例如，長2、3、4、5、6、7或更多個氨基酸)的互補決定區時，更難以建模。因此，一般單獨根據蛋白質序列不能把確定的已知的規范結構運用于兔的CDR。然而，按照本發明，我們仍然可以預測到大多數可能與互補決定區緊密接近的構架殘基，因為隨著互補決定區變長，例如互補決定區H3和互補決定區L3就是這種情況，或是當它們采取不同的構象時，它們就越有可能在僅接觸抗原或其它互補決定區的環區、而不是構架殘基上發生變化。因此，即使是粗糙的兔抗體模型，也足以預測出與互補決定區接觸的殘基。
鏈間接觸。表1所列出的很多氨基酸參與鏈間接觸(例如，在VK/VH交界面上)，這樣，在人源化期間不應該對它們進行改變。
隱蔽殘基。隱蔽殘基(即，預測不處于抗體表面的氨基酸)在人源化期間不應進行改變，或是在一些實施方案中，可以用具有類似大小和疏水性的氨基酸進行替代，以對氨基酸序列進行保守的改變(見表1)。
在很多實施方案中，在每個可變區內，最多可以有2、約4、約6、約8、約10、約12、約14、約16或約20個氨基酸被修飾。
表1由于形成互補決定區接觸(CDR)、鏈間接觸(INT)或成為隱蔽(BUR)而可能在結構上較為重要的構架殘基。注屬于一個以上類別的殘基僅列入一個類別(氨基酸的列示順序INT＞CDR＞BUR)。
VKCDR1，2，3，4，5，7，22，23，35，45，48，49，58，60，62，66，67，69，70，71，88INT36，38，43，44，46，85，87，98，100BUR6，11，13，19，21，37，47，61，73，75，78，82，83，84，86，102，104，106VHCDR1，2，4，24，27，28，29，30，36，38，40，46，48，49，66，67，68，69，71，73，78，80，82，86，92，93，94，INT37，39，43，44，45，47，91，103，105BUR6，9，12，18，20，22，76，82c，88，90，107，109，111在很多實施方案中，本方法采用以計算機或計算機系統的算術方法進行。在這些實施方案中，用戶至少可以把兔抗體一個構架區或一個可變區的氨基酸序列輸入到計算機中，使用例如用戶的界面，由計算機運行上述方法，通過這種算法，輸出一個人源化的兔構架或修飾的可變區氨基酸序列，甚至是一個編碼修飾的兔構架或修飾的可變區的核苷酸序列。該領域的技術人員很熟悉這個程序。
按本發明進行的編程可以記錄在計算機的可讀介質上，例如計算機可以直接閱讀和存取的所有介質。上述介質包括但不限于磁性存儲介質，如軟盤、硬盤儲存介質以及磁帶；光學存儲介質，如CD-ROM；電子存儲介質，如RAM和ROM；這些介質的混合，如磁性/光學存儲介質。本領域技術人員可很容易地知道如何利用目前已知的任何計算機可讀介質生產產品，包括對實施上述方法所采用的程序或算法加以記錄。
人源化兔單克隆抗體本發明提供了一種按上述方法進行人源化的兔抗體。
一般情況下，人源化兔抗體保留親本抗體識別抗原的特異性，這種人源化兔抗體具有相當高的親合力(例如，至少107M-1、至少108M-1或至少在109M-1到1010M-1，甚至更高)，與兔親本抗體相比，在人宿主內一般產生較低的免疫原性。如上所述，在很多實施方案中，修飾的兔抗體包含至少一套來自人抗體的連續或非連續氨基酸。
與兔親本抗體在人宿主內的免疫原性水平相比，人源化兔抗體在人體宿主內的免疫原性水平可以通過多種方式加以確定，其中包括給一個人宿主施用等摩爾量的兩種分離的抗體，以及測量人宿主對每一種抗體的免疫反應。可選擇地，將親本抗體和修飾的抗體分別施用于不同的人宿主，然后測量宿主的免疫反應。測量非兔宿主針對每一種抗體的免疫反應的一種比較恰當的方法是酶聯免疫吸附測定法(ELISA)(見Ausubel，et al，Short Protocols in MolecularBiology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995，UNIT 11-4)，按照這種方法，將適當的等量每一種抗體滴在微量滴定板上的孔內，然后采用來自人宿主的多克隆抗血清進行測定。在大多數實施方案中，與未修飾的兔親本抗體相比，試驗用人源化兔抗體產生的免疫原性大約低10％，20％，30％，40％，50％，60％，80％，90％或甚至約95％。
根據所采用的是恒定區還是其它區，用本方法可以制備幾種類型的本領域已知的抗體。用本方法也可以制備全長抗體以及抗體的抗原結合片段。這些片段包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、單鏈Fvs(scFv)，單鏈免疫球蛋白(例如，其中重鏈或重鏈的一部分，以及輕鏈或輕鏈的一部分進行了融合)、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)、二價抗體、三價抗體、四價抗體、scFv微型抗體、Fab微型抗體以及二聚scFv和其它所有在構象中包含一個VL和一個VH區、從而形成特異性抗原結合區的片段。包括單鏈抗體在內的抗體片段，可以僅包含可變區，或可以與以下各區的全部或部分組合構成重鏈上的重鏈恒定區或其部分，例如CH1、CH2、CH3、跨膜和/或胞質區，以及輕鏈上的輕鏈恒定區，例如Cκ區或Cλ區，或其部分。此外，本發明還包括所有可變區與CH1、CH2、CH3、Cκ區、Cλ區、跨膜及胞質區的組合。術語“抗體”是指任何類型的抗體，其中包括上面所列的那些抗體，我們已經在前面解釋過，它們的重鏈和輕鏈是自然配對的，即不包括所謂的“噬菌體展示”抗體。
當然，人源化兔抗體也可以容納一定程度的氨基酸變異，例如，保守性氨基酸替換，只要它們保持特異性，具有相當高的親和力，與親本抗體相比，一般會降低非兔宿主的免疫原性。
編碼兔單克隆抗體的核酸本發明還提供了包含編碼修飾的試驗兔抗體的核苷酸序列的核酸，及其部分，包括重鏈或輕鏈、重鏈或輕鏈可變區或重鏈或輕鏈可變區的構架區。試驗核酸是通過一種試驗方法產生的。在很多實施方案中，核酸還包含一個針對恒定區的編碼序列，例如所有人抗體的恒定區。編碼人免疫球蛋白前導肽(例如MEFGLSWVFLVAILKGVQC，SEQ IDNO58)的核酸可以通過生物工程技術，實現抗體鏈的分泌。
由于操縱核酸的遺傳密碼和重組技術是已知的，并且可以通過上述方法獲得目標抗體的氨基酸序列，因此，編碼人源化兔抗體的核酸的設計和制備完全在技術人員的技能之內。在某些實施方案中，一般采用的是標準重組DNA技術(Ausubel，et al，Short Protocols inMolecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995；Sambrook，etal.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。例如，可以采取任何一種或多種重組方法的組合從生成抗體的細胞中分離出抗體編碼序列，這些重組方法就不必在本文中加以贅述了。隨后，可以利用標準重組DNA技術，對編碼蛋白質的核酸序列中的核苷酸進行替換、缺失和/或添加。
例如，可以采用定點誘變技術和亞克隆技術在編碼抗體的多核苷酸中導入、缺失或替換核酸殘基。在其它實施方案中，則可以采用PCR。可以通過對寡核苷酸進行化學合成完整地制備編碼感興趣多肽的核酸(例如，Cello et al.，Science(2002)2971016-8)。
在某些實施方案中，可以對編碼感興趣多肽的核酸密碼子進行優化，從而在特定物種的細胞中加以表達，尤其在哺乳動物的細胞，例如人的細胞中。
本發明還提供了包含目標核酸的載體(也被稱為“構建體”)。在本發明的許多實施方案中，在使目標核酸序列與表達控制序列，例如包括啟動子可操作地連接之后，在宿主體內表達目標核酸序列。一般情況下，還把目標核酸插入表達載體中，表達載體可以作為游離體或宿主染色體DNA的組成部分在宿主細胞內進行復制。通常，表達載體將包含有選擇標記，例如四環素或新霉素，從而可以檢測目標DNA序列轉化的細胞(見美國專利No.4,704,362，其引入這里作為參考)。包括單表達盒載體和雙表達盒載體在內的載體是本領域已知的(Ausubel，et al，Short Protocols in Molecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995；Sambrook，et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。合適的載體包括病毒載體、質粒、粘粒、人工染色體(人造染色體、細菌人工染色體、酵母人工染色體等等)、微型染色體及其它此類載體。也可以采用逆轉錄病毒、腺病毒以及腺相關病毒的載體。
為了在細胞中制備感興趣多肽的目的，多種表達載體都是本領域技術人員能得到的。一種用于某些實施方案的合適載體是豬巨細胞病毒(pCMV)。按照《國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約》的規定，這種載體于1998年10月13日存入美國典型培養物保藏中心(ATCC)。該DNA經過美國典型培養物保藏中心(ATCC)的檢驗，并確認為是存活的。美國典型培養物保藏中心(ATCC)已經給pCMV指定了如下的保藏編號ATCC #203351。
目標核酸一般包含編碼目標抗體的單開放閱讀框架，但是在某些實施方案中，由于用于表達感興趣多肽的宿主細胞可能是真核細胞，例如哺乳動物細胞，如人類細胞，單開放閱讀框架可能會被內含子打斷。目標核酸一般是轉錄單元的一部分，該轉錄單元除包含目標核酸之外還可以包含3’和5’的非翻譯區(uTRs)，該非翻譯區可以指導RNA的穩定性和翻譯的效率等。目標核酸還可以是表達盒的一部分，該表達盒除包含目標核酸之外還包含一個啟動子和一個轉錄終止子，該啟動子指導多肽的轉錄和表達。
真核生物的啟動子可以是任何在真核細胞或任何其它宿主細胞中發揮作用的啟動子，包括病毒啟動子或源自真核基因或原核基因的啟動子。典型的真核生物啟動子包括，但不限于如下啟動子鼠類金屬硫蛋白I基因序列的啟動子(Hamer et al.，J.Mol.Appl.Gen.1273-288，1982)；皰疹病毒的TK啟動子(McKnight，Cell 31355-365，1982)；SV40早期啟動子(Benoist et al.，Nature(London)290304-310，1981)；酵母gall基因序列的啟動子(Johnston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)796971-6975，1982)；Silver etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)815951-59SS，1984)；CMV啟動子；EF-1啟動子；蛻皮激素反應性啟動子；四環素反應性啟動子等等。病毒啟動子可能具有特殊的意義，因為它們常常是特別強的啟動子。在某些實施方案中，所采用的啟動子是目標病原體的啟動子。用于本發明的啟動子的選擇原則是它們能在所要導入的細胞(和/或動物)中發揮作用。在某些實施方案中，啟動子是CMV啟動子。
在某些實施方案中，目標載體還可以提供可選擇標記的表達。合適的載體和可選擇標記是本領域熟知的，而且已經在很多相關文獻中進行了闡述和討論，其中包括Ausubel等人(Short Protocols inMolecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995)以及Sambrook等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition，(2001)Cold Spring Harbor，N.Y.)。人們已經采用了眾多的不同基因作為可選擇標記，在本目標載體中作為可選擇標記而采用的特定基因主要是依據便利性而選擇的。目前已知的可選擇標記基因包括胸苷激酶基因；二氫葉酸還原酶基因；黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因；CAD；腺苷脫氨酶基因；天冬酰胺合成酶基因；抗生素抗性基因，例如四環素抗性基因(tetr)、氨芐青霉素抗性基因(ampr)、氯霉素抗性基因(Cmr或cat)、卡那霉素或新霉素抗性基因(kanr或neor)(氨基糖苷磷酸轉移酶基因)、潮霉素B磷酸轉移酶基因等等。
目標核酸還可以包含限制性酶切位點、多克隆位點、引物結合位點、可連接末端、重組位點等，以便于構建編碼人源化兔抗體的核酸。
一般而言，用于制備編碼抗體的核酸的幾種方法是本領域已知的，其中包括美國專利6,180,370、5,693,762、4,816,397、5,693,761和5,530,101。有一種PCR方法采用了“重疊延伸PCR”(Hayashi etal.，Biotechniques.1994312，314-5)，用于構建編碼輕鏈和重鏈核酸的表達盒。按照這種方法，采用從抗體產生細胞獲得的cDNA產物以及其它適當的核酸作為模板，通過多重重疊PCR反應產生表達盒。
制備人源化兔單克隆抗體的方法在大多數實施方案中，編碼人源化單克隆抗體的目標核酸被直接導入宿主細胞，細胞在適當的條件下進行培養，從而誘導編碼抗體的表達。
任何適用于表達盒進行表達的細胞都可以作為宿主細胞。例如酵母、昆蟲、植物等的細胞。在很多實施方案中，一般采用不會產生抗體的哺乳動物宿主細胞系，其實例如下猴的腎臟細胞(COS細胞)；由SV40轉化的猴的腎臟CVI細胞(COS-7，ATCC CRL 1651)；人的胚腎細胞(HEK-293，Graham et al.J.Gen Virol.3659(1977))；幼倉鼠的腎臟細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠的卵巢細胞(CHO，Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)774216，(1980)；小鼠的塞爾托利細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴的腎臟細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴的腎臟細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人的子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬的腎臟細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠的肝臟細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人的肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人的肝臟細胞(hep G2，HB 8065)；小鼠的乳腺癌細胞；(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci 38344-68(1982))；NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)；小鼠L細胞(ATCC CCL-1)。其它細胞系是本領域普通技術人員顯而易見的。從美國典型培養物保藏中心(ATCC)可以獲得多種細胞系，地址American Type CultureCollection，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209。
將核酸導入細胞的方法是本領域熟知的。合適的方法包括電穿孔技術、粒子槍技術、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等等。具體方法的選擇一般取決于被轉化的細胞類型，以及進行轉化所處的具體環境(即在體外、離體還是在活體內進行)。有關這些方法的一般性介紹可以參考Ausubel，et al，Short Protocols in Molecular Biology，3rded.，Wiley & Sons，1995。在一些實施方案中，可以采用脂質轉染胺(Lipofectamine)和鈣介導的基因轉移技術。
在將目標核酸導入到細胞中之后，一般對細胞進行溫育，正常溫育溫度為37℃，某些時候溫度是可以選擇的，溫育時間為大約1到24個小時，從而充分地實現抗體表達。在大多數實施方案中，抗體一般分泌到培養細胞的培養基的上清液中。
在哺乳動物的宿主細胞中，可以利用許多以病毒為基礎的表達系統表達目標抗體。在采用腺病毒作為表達載體的情況下，感興趣的抗體編碼序列可以連接到一個腺病毒轉錄/翻譯控制復合體上，例如晚期啟動子和三聯前導序列。之后，可以采用體外或活體內重組的方法，將這個嵌合基因插入腺病毒基因組。如果插入病毒基因組非必需區(例如，E1或E3區)的話，將會得到重組病毒，其是活的并且能在被感染的宿主內表達抗體分子。(例如見Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81355-359(1984))。通過包含適當的轉錄增強元件和轉錄終止子等，可以提高表達的效率(見Bittner et al.，Methods in Enzymol.15351-544(1987))。
為了長期和高產量的生產重組抗體，可以使用穩定的表達系統。例如，通過生物工程技術構建穩定表達抗體分子的細胞系。而不是使用含有病毒復制起點的表達載體，可以用免疫球蛋白表達盒以及可選擇標記對宿主細胞進行轉化。在導入外源的DNA之后，工程化細胞可以在滋養培養基中生長一到兩天，之后，將滋養培養基換成選擇培養基。在重組質粒中的可選擇標記提供選擇抗性，使得細胞將重組質粒穩定整合入染色體中并使細胞生長形成轉化灶，該轉化灶反過來可以被克隆，并進一步生長成為細胞系。這種工程化細胞系尤其適用于對直接或間接與抗體分子相互作用的化合物進行篩選和評價。
一旦制備出本發明所述的抗體分子，就可以采用本領域已知的用于免疫球蛋白分子純化的任何方法，對這個抗體分子進行純化，例如通過色譜法(例如，離子交換，親和層析，尤其是使用蛋白質A的針對特異性抗原的親和層析，以及分子篩柱層析)、離心分離法、液相分離法(differential solubility)以及對蛋白質進行提純的其它標準技術。在很多實施方案中，細胞分泌的抗體進入培養基，并從培養基收獲該抗體。
人源化兔抗體結合親和力的測定在制備修飾的抗體之后，一般采用已知的方法對它的親和力進行測定，例如這些測定方法包括1)采用標記(用放射性標記或熒光標記)兔親本抗體、修飾的抗體以及由親本抗體識別的抗原的競爭結合分析法；2)采用如BIACore儀器進行的表面細胞質基因組共振分析，提供抗體的結合特征。采用這種方法，把抗原固定在固相基質芯片上，并以實時方式測量液相中抗體的結合力；以及3)流式細胞計量術，例如，采用熒光激活的細胞分類(FACS)分析法，研究抗體與細胞表面抗原的結合力；4)酶聯免疫吸附測定法(ELISA)；5)平衡透析或FACS。在這種FACS法中，表達抗原的轉染細胞和天然細胞可用于研究抗體的結合力。測定抗體親和力的方法一般采用Harlow等人介紹的方法《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual，First Edition(1988)Cold Spring Harbor，N.Y.；Ausubel，et al，Short Protocolsin Molecular Biology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995)。
如果親和力分析表明修飾的抗體的結合力與親本抗體相比有所下降的話，可以對構架進行“微調”，從而達到增加親和力的目的。微調構架的方法之一是采用定點誘變技術，有系統地將每個修飾的殘基變為原始的狀態。通過對這些回復突變的抗體進行表達和分析，我們可以預測除非不降低親和力否則無法進行修飾的關鍵殘基。
另一種預測需要回復突變殘基的方法是分子建模。通過對原始抗體、人源化抗體或鼠源化抗體結構的三維模型進行比較，來自與互補決定區殘基太接近(例如距離低于大約5埃)的表面殘基的任何殘基都應該回復突變為兔的殘基或兩個物種的共同殘基。
功用本發明的人源化兔抗體可以用于臨床診斷、抗體成像以及治療對基于單克隆抗體的療法敏感的疾病。尤其，人源化兔抗體可以用于被動免疫或除去不需要的細胞或抗原，如通過補體介導的細胞溶解或抗體介導的細胞毒性(ADCC)，所有通過這些方法得到的抗體都不會產生與許多以前抗體有關的各種免疫反應(例如，過敏性休克)。例如，本發明的抗體可以用于治療因多余細胞表面特異性表達被該抗體識別的蛋白質(例如HER2)而誘發的疾病，或是該抗體可以用于對多余的毒素、刺激物或病原體進行中和。人源化兔免疫球蛋白尤其適用于治療多種類型的癌癥，例如結腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等等，這些癌癥都與特定的細胞標志物表達有關。由于絕大多數(如果不是所有)與疾病有關的細胞和病原體都具有成為抗體的潛在目標的分子標記，許多疾病可以是人源化抗體藥物的可能指示。這些疾病包括由特定類型免疫細胞攻擊自我抗原的自體免疫性疾病，例如胰島素依賴性糖尿病、系統性紅斑狼瘡、惡性貧血、過敏癥和類風濕性關節炎；和器官移植有關的免疫激活性疾病，例如移植排斥、移植物抗宿主疾病；其它免疫系統疾病，例如敗血癥性休克；傳染性疾病，例如病毒性感染和細菌性感染；心血管疾病，例如血栓癥以及神經性疾病，例如阿爾茨海默氏病。
試劑盒根據上面的介紹，本發明還提供了用于實施本發明方法的試劑盒。該試劑盒至少包括一種或多種如下試劑編碼至少一種人源化兔抗體構架序列的核酸，具體見前文所述，包含上述核酸的載體以及對該核酸進行擴增的寡核苷酸引物。試劑盒中其它可以選用的成分還包括限制性內切酶、對照引物和質粒、緩沖液等。試劑盒中的核酸可能還有限制性酶切位點、多克隆位點、引物位點等等，以便于實現它們與非兔抗體互補決定區編碼核酸的連接。試劑盒的各成分既可以存在于分開的容器中，也可以根據需要，把某些相容的成分預先混合放于一個獨立的容器內。
除了上述的成分之外，試劑盒一般還包括為實施本發明方法而使用試劑盒中的成分的使用說明。實施本發明方法的使用說明一般記錄于適當的記錄介質上。例如，可以把使用說明印在紙、塑料或其它材質的基質上。這樣，這些使用說明可以作為包裝插入物放在試劑盒中，存在于試劑盒或其成分的容器的標簽上(即與包裝或小包裝相關)，等等。在其它實施方案中，這些使用說明可以采取電子儲存數據文件的形式，儲存在適當的計算機可讀儲存介質上，如CD-ROM、磁盤等。在其它的實施方案中，實際的使用說明并不包括在試劑盒中，而是提供以遠程通訊形式獲取這些使用說明的方式，例如通過互聯網獲取。這種實施方案的一個具體例子就是在試劑盒上標注了網址，此時，使用者可以在線閱讀這些使用說明，也可以通過網絡下載這些使用說明。對于這樣的使用說明，這種獲取這些使用說明的方式記錄在適當基質上。
本發明還提供至少包括一種計算機可讀的介質的試劑盒，該介質儲存著上述的程序和使用說明。使用說明可能還包括安裝或設置說明書。使用說明還有可能包括使用上述個別方案或各種方案組合的本發明的用法說明。在某些實施方案中，使用說明同時包括兩類信息。
同時提供軟件和使用說明的試劑盒，可以用于多種用途。也可以將該組合包裝并作為一種工具購買，用于制備在非兔宿主中產生免疫原性低于親本抗體的兔抗體或其核苷酸序列。
使用說明一般記錄于適當的記錄介質上。例如，可以把使用說明印在紙、塑料或其它材質的基質上。這樣，這些使用說明可以作為包裝插入物放在試劑盒中，存在于試劑盒或其成分的容器的標簽上(即與包裝或小包裝相關)，等等。在其它實施方案中，這些說明可以采取電子儲存數據文件的形式，儲存在適當的計算機可讀儲存介質上，如CD-ROM、磁盤等，包括存放程序的相同介質。
具體實施例方式
如下實施例的目的是為本領域的普通技術人員提供如何進行和使用本發明的完整描述和說明，而不是為限制發明人所認為的發明的范圍，也不是為了說明以下實驗是進行的所有或僅有的實驗。盡管發明人已經采取了盡可能的措施，以確保這些實驗所采用數字的準確性(例如數量、溫度等等)，但仍然需要考慮到實驗誤差和偏差。除另有說明之外，份數是重量份，分子量是指重均分子量，溫度采用攝氏度單位，壓力為大氣壓或接近于大氣壓。
實施例1兔單克隆抗體圖2描述了對由各種兔單克隆抗體克隆的可變重鏈和κ鏈進行序列比對的過程，該兔單克隆抗體由Epitomics公司開發。它顯示出，兔鏈的結構特征明顯不同于人和鼠類抗體。絕大部分VK鏈和一半的VH鏈在N-末端上缺少一個殘基(與其它兔抗體序列相對于人抗體序列相比)。絕大部分重鏈在D-E環區也缺少一個或兩個殘基。所有分離的κ鏈在位置80處有一個半胱氨酸殘基。很多κ鏈的CDR3序列比以前所知道的人或鼠類抗體的相應序列長。少數κ鏈在它們的第三個互補決定區內有一對額外的半胱氨酸殘基。額外的一對半胱氨酸也存在于某些VH區內。最后，由于這一事實在圖中沒有清楚地顯示，使得無法把以前所知道的典型的結構賦予某些互補決定區。
實施例2兔單克隆抗體B1的人源化兔抗整聯蛋白β-6單克隆抗體B1的可變區κ鏈和重鏈是按下面的聚合酶鏈反應(PCR)程序克隆獲得的。對幾種獨立的PCR產物進行了測序，用一套引物進行的聚合酶鏈反應(PCR)一般情況下就足夠了。
制備雜交瘤細胞的懸浮液-1毫升的生長的B1細胞，1100轉/分鐘離心5分鐘-用1×PBS進行沖洗-檢查細胞的數量，調整到每毫升400,000個細胞制備RNA-把1ul細胞加入9ul緩沖液A，放置在冰塊上-加5ul冷的緩沖液B-加熱到65℃，保持1分鐘-在基因擴增儀上逐漸冷卻55℃ 45℃ 35℃ 23℃ 冰點
30秒 30秒30秒2分鐘-加冷卻緩沖液C 每管5ul-在42℃的溫度下溫育42分鐘-放回到冰塊中緩沖液A，B，C緩沖液A-2ul 二硫蘇糖醇(DTT)(0.1M)-2ul 5×第一鏈合成緩沖液-5ul 焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水緩沖液B-1.0ul 0.1％ NP40-1.0ul 第一鏈合成緩沖液-1.0ul oligo(dT)-0.5ul RNaseOut核酸酶抑制劑40U/ml-1.5ul 焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水緩沖液C-1ul 10mM dNTP混合物-1ul 5×第一鏈合成緩沖液(Invitrogen)-1ul Superscript RT II(Invitrogen)-2ul 焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水聚合酶鏈反應(PCR)引物濃度3pmole/ul2.50ul 10×緩沖液
0.75ul 50mM MgCl23.00ul 引物13.00ul 引物20.50ul 10mM dNTP混合物0.25ul Taq或其它聚合酶10.00ul水5.00ul 模板----------------25.00ul94℃ 2分鐘 68℃ 10分鐘第一輪用于H鏈引物1+引物10用于L鏈引物12+引物19嵌套聚合酶鏈反應僅用于H鏈引物2+引物8＞引物1 TCGCACTCAACACAGACGCTCACC(SEQ ID NO59)＞引物2 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTT(SEQ ID NO60)＞引物8 GCTCAGCGAGTAGAGGCCTGAGGAC(SEQ ID NO61)＞引物10 TTGGGGGGAAGATGAAGACAGACGG(SEQ ID NO62)＞引物12 CAGTGCAGGCAGGACCCAGCATGG(SEQ ID NO63)＞引物19 GCCCTGGCAGGCGTCTCRCTCTA(SEQ ID NO64)互補決定區和殘基數量的設置與Chothia(1998，見上文)和Kaba(見上文)介紹的編號方法保持一致。圖3總結了計劃用于對抗整聯蛋白β-6兔單克隆抗體B1進行人源化的序列。詳細情況見以下章節。在VK和VH區內，分別有總共15個和17個構架殘基從兔型變異為人型。兩個殘基分別插入到VH的位置1和73。在VK和VH區內，相對于可能進行改變的最大數量而言，分別有4個和7個構架殘基保持不變。在VK和VH構架內的ID百分比分別從76％增加到95％和從72％增加到94％。
下面的很多人源化步驟都要求詳細了解抗體的可變區結構。獲取此類知識最可靠也是最簡便的方法是閱讀各類有關抗體結構方面的文獻(例如Chothia 1998，見上文)。然而，對公眾可在pdb數據庫得到的幾百個抗體結構以及準備進行人源化的特定兔抗體的結構，進行模型化處理也許會更加便于使用。
為了建立兔抗體模型，需要將兔序列與pdb數據庫進行比照，在數據庫中尋找適當的結構用于同源建模(homology modeling)。一般情況下，我們可以尋找其蛋白質序列與兔抗體的蛋白質序列最為接近的成對VH/VL鏈的結構。當然，兩個序列之間類似性越相近，最終得到的模型就越好。
我們可以利用幾種程序通過同源性建立模型。有些程序可以在市場上購買，有些也可以通過互聯網得到。例如，Swiss Pdb Viewer，也被稱為“Deep View”，可以用于對同源蛋白質進行建模。相對于模板結構的環而言，如果在兔抗體的環中存在間隙或插入，則可以利用其它結構進行建模。互補決定區如果屬于已知的規范結構，建模可能較為容易。例如，互補決定區L2一般就是這種情況。但是在正常的情況下，我們幾乎不可能把已知的規范結構直接用于兔的互補決定區，這樣，也許就很難找到良好的模板結構對它們進行建模。特別需要指出的是，我們在為互補決定區L3和H3尋找適當的模板結構時會很困難。同樣，D-E環的建模也不會簡單。但是，在對互補決定區環和D-E環建模時沒有必要做到完美無缺。
程序pdb閱讀器可以用于確定哪些構架殘基有可能與互補決定區進行接觸。另外，我們可以采用多種程序語言，例如PERL編寫腳本，甚至可以采用Microsoft Excel，其可以直接采用來自pdb文件的坐標，確定哪些殘基與任何互補決定區殘基的接觸距離在5埃或更近的距離之內。由于不能期望兔抗體的模型十全十美，因此，我們建議采取保守的做法，對于在距離互補決定區6埃或甚至7埃之內的殘基實際進行計算，然后，用圖形加以表述，從而確定它們是否有可能接觸到互補決定區。同樣的方法也可以用于尋找哪些殘基可能涉及到鏈間接觸，盡管在這種情況下，我們最好采用pdb閱讀器對幾個結構進行觀察。最后，我們可以使用pdb閱讀器的腳本語言計算相對表面接近程度，從而確定哪些殘基處于隱蔽狀態。
兔單克隆抗體B1具有預測的二硫鍵，因此，除非半胱氨酸80被一個非半胱氨酸的人殘基所替代，否則，就不可能實施人源化。根據本發明，cys80和位置77到83的相鄰殘基從DLECADA(SEQ IDNO65)被改變為SLQPDDA(SEQ ID NO66)。除位置83上的最后一個殘基沒有從A改變為F之外，人源化序列與上述序列中之一——SLQPDDF(SEQ IDNO67)幾乎完全一致。這是因為，同樣是按照本發明，殘基應在替換的側鏈中保持完整是相當不同的。這個殘基經常處于隱蔽狀態，如果從A改變為F就意味著，需要把一個大的甲基-苯基放置在原來只有一個甲基的位置上。
兩個鏈的N-末端分別被完全人源化為VK的殘基21和VH的殘基27。殘基VK22、VH28和VH29都沒有發生變化，因為它們過于接近互補決定區，或是已經接觸互補決定區。
圖5描繪了兔VH區的模型化結構，這個VH區說明了三個互補決定區和D-E環的位置。后者靠近互補決定區。兔單克隆抗體B1的這個區通過采納這三個可能出現的最佳人抗體序列中的一個包括多余殘基的DNSKNT(位置72-77)，實現了人源化，因而在人源化兔抗體中變成一個大環。
由于兩個殘基預計將處于隱蔽狀態，并同時成為互補決定區的一部分，因此，兔B1抗體的VH區中存在的cys35-cys50對沒有改變。
除以下殘基外，所有其它殘基都發生了變化，從而和人的目標序列相匹配-VK43和VH91，因為它們都接近于VK/VH界面，或是處于VK/VH界面處。
-VK83，因為它有可能被隱蔽，改變(從A到F)將會導致其大小出現顯著的變化。
-VK67、VH48、VH49、VH71和VH78，因為它們都接近互補決定區或與CDR接觸。
在這種情況下，B1抗體兩個計劃中的可變區被合成，并克隆到表達載體中，該表達載體編碼人的κ鏈和IgG1的恒定區。然后，載體被曖時表達于HEK293細胞中，把培養液的上清液用于細胞的酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，從而顯示出，人源化兔抗體緊密地與抗原結合。
在其它情況下，我們可以進行點突變，而不是對可變區基因進行合成。我們也可以表達抗體的片段，而不是整個IgG。
上面的實驗結果和討論顯然可以說明，本發明為實現兔抗體的人源化提供了一種新的重要手段。因此，本發明方法和系統具有多種用途，包括研究、農業、治療以及其它應用。所以，本發明對該領域的發展做出了巨大的貢獻。
雖然本發明已經根據其特定實施方案進行了描述，本領域技術人員應當理解，可以進行各種改變和等同替換，而不背離本發明的實際精神和范圍。此外，為適應于某些具體情況、材料、物質的組成、過程、過程中的各個步驟以及本發明的目的、宗旨和范圍，可以進行很多改進。所有這些改進都落在本發明附加權利要求書的范圍之內。
序列表<110>Couto，Joseph<120>兔單克隆抗體的人源化方法<130>EPIT-009WO<140>未指定<141>與此一起提交<160>67<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>1Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly1 5 10 15Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn Asn20 25 30Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln65 70 75 80Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Gly Gly Gly85 90 95Met Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys100 105<210>2<211>109<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>2Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Val Val Gly Gly1 5 10 15Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn Asn20 25 30Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Gly Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Glu Val Gln65 70 75 80Cys Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Gly Gly Gly85 90 95Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys100 105<210>3<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>3Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly1 5 10 15Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Asn Asn20 25 30Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Phe Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln65 70 75 80Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Glu Phe Phe Cys Ser85 90 95Ser Gly Asp Cys Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110<210>4<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>4Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly1 5 10 15Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Arg Asn20 25 30Asn Leu Ala Trp Phe Gln Arg Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu35 40 45Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys50 55 60Ala Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln65 70 75 80Cys Asp Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Glu Phe Ser Cys Ser85 90 95Ser Ala Asp Cys Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys100 105 110<210>5<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>5Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly1 5 10 15Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Lys Asn Ile20 25 30Trp Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu35 40 45Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu65 70 75 80Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Trp Ser Gly Glu85 90 95Ile Tyr Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val ValVal Lys100 105<210>6<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<221>變體<222>7<223>Xaa＝任何氨基酸<400>6Gln Val Leu Thr Gln Thr Xaa Tyr Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly1 5 10 15Thr Val Thr Val Asn Cys Gln Ala Ser Lys Ser Val Trp Asn Lys Asn20 25 30Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu35 40 45Leu Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln65 70 75 80Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ala85 90 95Arg Ala Glu Cys Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Val Ile Lys100 105 110<210>7<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>7Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly1 5 10 15Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ala Lys20 25 30Tyr Trp Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln65 70 75 80Cys Asp Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Tyr Ser Tyr Tyr Ser Pro85 90 95Ser Ser Ser Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys100 105 110<210>8<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>8Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly1 5 10 15Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ala Lys20 25 30Tyr Trp Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Lys Ala Ala Thr Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln65 70 75 80Cys Asp Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Tyr Ser Tyr Phe Ser Pro85 90 95Ser Ser Ser Asp Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys100 105 110
<210>9<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>9Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly1 5 10 15Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Thr Gly Arg Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Phe35 40 45Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys65 70 75 80Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Ile Arg Asn85 90 95Ser Tyr Glu Asn Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys100 105 110<210>10<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>10Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly1 5 10 15Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Leu20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Thr Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr His Tyr Ser Lys Ser85 90 95Ser Thr Tyr Val Ash Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys100 105 110<210>11<211>110<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>11Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro1 5 10 15Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Asn Asn Tyr Ser20 25 30Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly35 40 45Ala Ile Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly50 55 60Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Ile Asp Leu Lys Ile Thr65 70 75 80Ser Pro Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gly85 90 95Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105 110<210>12<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>12Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro1 5 10 15Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly35 40 45His Ile Glu Thr Pro Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly50 55 60Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr65 70 75 80Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly Asp85 90 95Val Ala Ser Tyr Asn Ala Ala Tyr Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>13<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>13Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser1 5 10 15Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Leu Ser Phe20 25 30Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Ala Cys Ile Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp50 55 60Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ala Thr Thr Val Thr65 70 75 80Leu Gln Met Thr Thr Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Ser Ala Ser Ser Thr Thr Phe His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>14<211>122<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>14Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Gly20 25 30Val Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Phe Ile Tyr Thr Gly Ser Glu Ser Pro Tyr Tyr Ala Asn Trp50 55 60Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr65 70 75 80Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Leu Asp Val Ala Gly Gly Ala Tyr Leu Phe Gly Leu Trp100 105 110Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>15<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>15Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Arg Asp1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Asn Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr20 25 30Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu GIu Trp Ile35 40 45Gly Phe Val Tyr Ile Ser Gly Arg Met Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys50 55 60Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val Thr Leu65 70 75 80Thr Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Val Cys Ala
85 90 95Arg Ser His Ser Ile Asp Asn Ser Leu Tyr Ile Trp Gly Pro Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>16<211>122<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>16Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Cys Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Thr Ser Asn Tyr20 25 30Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp50 55 60Val Asn Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Asp Gln Ser Thr Gly65 70 75 80Cys Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Gly Gly Val Pro Gly Gly Phe Tyr Tyr Tyr Asn Ile Trp100 105 110Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>17<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>17Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Leu20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Thr Ser Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys65 70 75 80Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr His Tyr Ser Lys Ser85 90 95Ser Thr Tyr Val Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys100 105 110<210>18<211>63<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>18Asp Ile Met Thr Gln Pro Ser Ser Ala Val Gly Val Thr Ile Cys Gln1 5 10 15Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Gly Val20 25 30Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile35 40 45Ser Leu Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Val Lys50 55 60<210>19<211>96<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>19Asp Ile Met Thr Gln Pro Ser Ser Ala Val Gly Val Thr Ile Lys Cys
1 5 10 15Gln Ala Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys20 25 30Pro Gly Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Asp Leu Thr Ser35 40 45Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Gly Thr Glu Phe Thr Leu50 55 60Thr Ile Ser Leu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr His Tyr65 70 75 80Ser Lys Ser Ser Thr Tyr Val Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Val Lys85 90 95<210>20<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>20Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser1 5 10 15Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Leu Ser Phe20 25 30Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Ala Cys Ile Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp50 55 60Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ala Thr Thr Val Thr65 70 75 80Leu Gln Met Thr Thr Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Ser Ala Ser Ser Thr Thr Phe His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>21<211>61<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成序列<400>21Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Gly Ser Leu Leu Cys Ala Ser1 5 10 15Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Arg20 25 30Phe Thr Ile Ser Ser Thr Leu Gln Met Leu Ala Asp Thr Ala Tyr Cys35 40 45Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser50 55 60<210>22<211>105<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>22Glu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Gly Ser Leu Leu Cys Ala1 5 10 15Ser Gly Phe Ser Phe Ser Leu Ser Phe Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln20 25 30Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Tyr Ser Gly Ser35 40 45Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile50 55 60Ser Lys Ser Thr Val Leu Gln Met Leu Ala Asp Thr Ala Tyr Phe Cys65 70 75 80Ala Arg Ser Ala Ser Ser Thr Thr Phe His Tyr Phe Asn Leu Trp Gly85 90 95Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser100 105<210>23<211>5<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成序列<221>變體<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>23Gly Gly Xaa Gly Gly1 5<210>24<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>24Asp Thr Ser Lys Asn Gln1 5<210>25<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>25Asp Asn Ser Lys Asn Thr1 5<210>26<211>6<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成序列<400>26Asp Asn Ala Lys Asn Ser1 5<210>27<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>27Asp Asp Ser Lys Asn Ser1 5<210>28<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>28Asp Asp Ser Lys Asn Thr1 5<210>29<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>29Asp Glu Ser Thr Ser Thr
15<210>30<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>30Asp Gly Ser Lys Ser Ile1 5<210>31<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>31Asp Lys Ser Ile Ser Thr1 5<210>32<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>32Asp Lys Ser Lys Asn Gln1 5<210>33<211>6
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>33Asp Lys Ser Thr Ser Thr1 5<210>34<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>34Asp Met Ser Thr Ser Thr1 5<210>35<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>35Asp Asn Ala Lys Asn Thr1 5<210>36<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列
<400>36Asp Asn Ser Lys Asn Ser1 5<210>37<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>37Asp Arg Ser Lys Asn Gln1 5<210>38<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>38Asp Arg Ser Met Ser Thr1 5<210>39<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>39Asp Thr Ser Ala Ser Thr1 5
<210>40<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>40Asp Thr Ser Ile Ser Thr1 5<210>41<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>41Asp Thr Ser Lys Ser Gln1 5<210>42<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>42Asp Thr Ser Thr Asp Thr1 5<210>43<211>6<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成序列<400>43Asp Thr Ser Thr Ser Thr1 5<210>44<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>44Asp Thr Ser Val Ser Thr1 5<210>45<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>45Glu Asn Ala Lys Asn Ser1 5<210>46<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>46
Asn Thr Ser Ile Ser Thr1 5<210>47<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>47Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe1 5<210>48<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>48Arg Val Glu Ala Glu Asp Val1 5<210>49<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>49Asn Ile Glu Ser Glu Asp Ala1 5<210>50
<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>50Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe1 5<210>51<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>51Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala1 5<210>52<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>52Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe1 5<210>53<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>53Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val1 5<210>54<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>54Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe1 5<210>55<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>55Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile1 5<210>56<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>56Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val1 5
<210>57<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>57Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe1 5<210>58<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>58Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys<210>59<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>59tcgcactcaa cacagacgct cacc 24<210>60<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>60atggagactg ggctgcgctg gctt 24<210>61<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>61gctcagcgag tagaggcctg aggac25<210>62<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>62ttggggggaa gatgaagaca gacgg25<210>63<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>63cagtgcaggc aggacccagc atgg 24<210>64<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>64gccctggcag gcgtctcrct cta 23<210>65<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>65Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala1 5<210>66<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>66Ser Leu Gln Pro Asp Asp Ala1 5<210>67<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成序列<400>67Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe1 權利要求
1.一種對兔單克隆抗體進行人源化的方法，所述方法包括(a)對兔親本抗體重鏈和輕鏈可變區的氨基酸序列與類似人類抗體重鏈和輕鏈可變區的氨基酸序列進行比較；和(b)在構架區內改變所述兔抗體的所述重鏈和輕鏈可變區的氨基酸，使改變后的構架區在序列上更接近于所述類似人抗體的對應構架區；其中所述改變的氨基酸不涉及互補決定區(CDR)接觸、鏈間接觸或是帶有實質上不同的側鏈的隱蔽殘基。
2.權利要求1的方法，其中所述親本單克隆抗體的所述輕鏈包含一個互補決定區CDR3，該互補決定區比所述人抗體的互補決定區CDR3多至少一個氨基酸。
3.權利要求1的方法，其中所述兔親本抗體的特異性和親和力與所述改變的兔抗體的特異性和親和力基本相同。
4.權利要求1的方法，其中所述改變的兔抗體在人宿主內的免疫原性低于所述兔親本抗體。
5.權利要求1的方法，其中所述親本兔單克隆抗體的構架區1被所述人抗體的構架區1所替代，從而使所述親本兔單克隆抗體的長度延長一個或多個氨基酸。
6.權利要求1的方法，其中所述親本兔單克隆抗體VH區的D-E環被所述人抗體的D-E環所替代，從而使所述親本兔單克隆抗體的D-E環的長度延長一個或多個氨基酸。
7.權利要求1的方法，其中所述親本兔單克隆抗體位置80上的任何VK半胱氨酸殘基被所述人抗體位置80上發現的氨基酸所替代。
8.權利要求1的方法，其中所述親本兔單克隆抗體的VK E-F環被所述人抗體的E-F環所替代。
9.權利要求1的方法，其中所述親本單克隆抗體中位置相互接近的半胱氨酸對被所述人抗體中相同位置上發現的氨基酸所替代。
10.按照權利要求1所述的方法進行人源化的兔單克隆抗體。
11.權利要求13的人源化兔單克隆抗體，其中所述抗體針對抗原可測量的結合親合力為2×107M-1或更高，所述兔親本抗體對該抗原結合親合力為108M-1或更高。
12.根據權利要求10的修飾的兔抗體，其中所述抗體不與病毒多肽的片段連接。
13.根據權利要求10的修飾的兔抗體，其中所述抗體為抗體片段。
14.編碼權利要求10所述單克隆抗體的重鏈或輕鏈可變區的核酸。
15.包含權利要求14的核酸的載體。
16.包含權利要求15的載體的宿主細胞。
17.制備人源化兔抗體的方法，所述方法包括在足以制備所述抗體的條件下溫育權利要求16的宿主細胞；和收獲所述抗體。
18.試劑盒，其包含按照權利要求1的方法進行人源化的單克隆抗體；和使用該單克隆抗體治療疾病的使用說明。
19.計算機可讀取的介質，其包含使用說明以指導處理器實施權利要求1的方法。
20.計算機所使用的工具包，所述工具包包括(a)權利要求19的計算機可讀取的介質；和(b)按照所述程序對所述計算機進行操作的使用說明。
全文摘要
本發明提供了一種對兔單克隆抗體進行人源化的方法。總體上看，這種方法包括把兔親本抗體的氨基酸序列與類似的人抗體的氨基酸序列進行比較，改變兔親本抗體的氨基酸序列，這樣，兔親本抗體的構架區在序列上更接近于類似人抗體的對應構架區。在很多實施方案中，不屬于互補決定區接觸殘基、鏈間接觸殘基或隱蔽殘基的兔親本抗體中的氨基酸不加以修飾。本發明還提供了編碼目標抗體的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞，以及制備目標抗體的方法。目標抗體、核酸組合物以及試劑盒具有多種用途，包括診斷、臨床治療以及疾病和不適的研究。
文檔編號C12N5/12GK1839144SQ03827110
公開日2006年9月27日 申請日期2003年8月7日 優先權日2003年8月7日
發明者F·J·R·D·柯特 申請人:宜康公司