本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種抗人Tim-3單克隆抗體8E11及其制備方法。

背景技術：

Tim-3基因及Tim-3結構蛋白：小鼠Tim-3基因位于第11號染色體上，轉錄本全長為1015個堿基；而人類Tim-3基因位于第5號染色體上，轉錄本全長為1116個堿基。Tim家族至少有四位成員，分別為Tim-1、Tim-2、Tim-3、Tim-4。其中Tim-1為甲型肝炎病毒的受體，Tim-2可以特異性表達于Th2細胞，Tim-3蛋白是活化的Th1細胞表面標志，Tim-4作為Tim-1的配體分子，表達于成熟的DC。

目前的數據表明，小鼠Tim-3分子由281個氨基酸組成，與Th1相關的反應及疾病有關；人類Tim-3分子是由301個氨基酸組成的I型膜蛋白，其胞外部分包括一個富含半胱氨酸的Ig樣區域和一個黏蛋白區域，Ig樣區包括4個保守的半胱氨酸，黏蛋白區富含蘇氨酸、絲氨酸和脯氨酸。其胞內區約含42～77個氨基酸，這是小鼠和人類同源物中最高度保守的區域。

Tim-3基因和免疫系統相關疾病及功能方面的聯系：人類Tim家族位于5q33.2，此區是哮喘的易感區。某些遺傳性過敏癥，例如哮喘和過敏性鼻炎，其敏感性和Tim-3基因-574T/G多態性位點聯系最為密切。在過敏性鼻炎患者中，Tim-3基因在-1516G/T，-574T/G，4259G/T位點的基因型和等位基因頻率和正常人存在顯著性差異。對Tim-3啟動子區兩個單核甘酸多態性位點和過敏性哮喘之間的關系進行了研究，證明了Tim-3啟動子區多態性位點和過敏性疾病之間有著密切關聯。

自身免疫病是一種和炎癥反應相關的疾病。如果能下調炎癥反應，就可以減少，甚至是阻止自身免疫病的發生。一些受體分子(例如CTLA-4)、細胞因子(例如TGF-β)，還有調節性細胞(例如CD4⁺CD25⁺T細胞)共同保持機體的免疫平衡。Tim家族蛋白是炎癥反應的一種主要調節分子，提供抑制性信號，下調炎癥反應，減少自身免疫病和過敏反應的發生。Fri-sancho-Kiss等通過降低病毒感染鼠Tim-3信號的表達，可以在巨噬細胞和肥大細胞誘導協同刺激分子CD80降低表達，還可以降低CD4⁺T細胞CTLA-4水平，最終導致了調節T細胞的減少和心臟炎癥反應的增加，說明Tim-3信號在調控適應性免疫應答方面起著很重要的作用。

免疫因素是影響腫瘤細胞在體內存活并擴增的重要因素之一。長期使用免疫抑制劑的移植受者，由于不能活化大量有功能的T細胞，常常有并發某些惡性腫瘤的危險。一般認為，T細胞免疫為腫瘤免疫的主要內容，體內如果能夠產生足夠針對腫瘤細胞的特異性細胞毒性T細胞(CTL)，腫瘤細胞很難存活。Tim-3為Th1型細胞的特異性表面標志，不表達于初始T細胞、B細胞、DC以及造血細胞。推測Tim-3可以通過調節Th1型細胞反應，進而調節腫瘤免疫。

Tim-3/Tim-3L與Th免疫反應：Tim-3的配體(Tim-3L)表達比Tim-3要廣泛得多。Zhu等的研究發現了Tim-3L高表達在TK-1(一種CD8⁺的小鼠淋巴瘤細胞)上，并鑒定為半乳凝素-9(Galectin-9)。Galectin-9是一黏附在細胞膜上的可溶性糖蛋A，可誘導胸腺細胞和外周的CD4⁺、CD8⁺T細胞凋亡，在調節免疫細胞的動態平衡和炎癥反應中起著重要的作用。另有研究發現，阻斷Tim-3/Galectin-9通路，CD4⁺CD25⁺調節性T細胞介導的可以延長同種異體皮膚移植的存活作用消失了，證明了Tim-3L不僅僅表達在CD4⁺CD25⁺調節性T細胞上，而且Tim-3/Galectin-9通路影響了CD4⁺CD25⁺調節性T細胞功能的發揮。Galectin-9也存在于脾內少數CD11⁺樹突狀細胞和CDllb⁺單核細胞的表面，Tim-3L可能還表達于巨噬細胞及APC上。

Tim-3與Tim-3L(Galectin-9)結合從而下調Thl型免疫應答，并且可以調節CD4⁺CD25⁺調節性T細胞。為了了解Tim-3與其配體結合從而抑制Th1細胞效應功能的機制，Kuchroo等在分化成熟的Thl、Th2細胞中加人Galectin-9，發現異常的鈣離子內流和快速的Thl細胞死亡，而Th2細胞和Tim-3^-/-的Thl細胞無此效應，從而證實了Galectin-9的作用依賴于與Tim-3的結合。在許多Thl反應異常的疾病中存在著Tim-3/Tim-3L信號通路的異常。自身免疫性腦脊髓炎(EAE)屬于典型的Thl型免疫反應，Monney等在在小鼠EAE模型中，應用Tim-3抗體能加速疾病的發作，增加疾病的嚴重性和死亡率。WangF等_研究表明在同種異體皮膚移植小鼠給予重組Galectin-9，能選擇性刪除Tim3⁺Th1細胞，使IFN-γ分泌下降，顯著抑制同種異體移植物排斥反應，增加同種異體移植皮膚的存活率。

Tim-3/Tim-3L與腫瘤免疫：一般認為腫瘤免疫中以T淋巴細胞為核心，CD8⁺T細胞可以直接作為效應細胞來特異地殺傷癌細胞,被稱為殺傷性T淋巴細胞(CTL)。還有另一類殺瘤細胞為NK細胞，此類細胞無需抗原預先致敏就能自發地殺傷靶細胞，且具有細胞毒效應。CD4⁺T細胞較少受到關注，但它們在調節機體的腫瘤免疫中也發揮著重要的作用。CD4⁺T細胞Thl細胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，它們可以直接或間接地通過激活CTL細胞、NK細胞和巨噬細胞的細胞毒和吞噬作用來促進細胞免疫，因此它們對機體的抗腫瘤免疫反應非常重要。在進展期腫瘤患者中主要是Thl細胞受到抑制，因而腫瘤免疫治療要設法使其Thl/Th2向Thl漂移。Tim-3為Thl型細胞的特異性表面標志，不表達于初始T細胞、B細胞、DC以及造血細胞。進而推測Tim-3可以通過調節Thl細胞反應,從而調節腫瘤免疫。

Tim-3/Tim-3L在腫瘤免疫中的負性調控

Klibi等的研究發現：鼻咽癌細胞分泌的外核體中有大量的Galectin-9表達,Galectin-9插人到外核體中表達,則能夠防止被蛋白酶切割。鼻咽癌細胞分泌的外核體能夠誘導特異性的鼻咽癌CD4⁺T細胞大量凋亡，此效應可以被抗Tim-3抗體或者抗Galectin-9抗體所抑制，從而證明了阻斷Tim-3/Galectin-9這條通路，能夠減輕鼻咽癌外核體對Thl免疫應答的抑制反應，從而維持T細胞的抗腫瘤效應，提高了臨床免疫治療鼻咽癌的效果。Zoltan等的研究發現：Tim-3在人的肥大細胞和黑色素瘤細胞上都有高表達,有趣的是Galectin-9也在肥大細胞上表達，而不在腫瘤細胞上表達；他們還發現TGF-β1刺激過的肥大細胞，其Tim-3的表達量的升高會抑制機體的抗腫瘤能力，而且這種促瘤作用可能是依賴肥大細胞上表達的Tim-3與自身肥大細胞上表達Galectin-9的結合，所以他們認為Tim-3是促進黑色素瘤這種腫瘤細胞的發展。Geng等構建了sTim-3的真核表達質粒psTim-3，轉染了該表達質粒的動物，其體內黑色素瘤細胞加速生長，這可能與sTim-3在體內可以抑制細胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-β的產生有關；且抗腫瘤CTL細胞的活性下降，腫瘤組織中的浸潤淋巴細胞數量減少，說明sTim-3能顯著降低T細胞的抗腫瘤免疫；在實時定量PCR監測腫瘤微環境的基因表達情況中還發現Thl細胞因子的基因表達下調，而與調節性T細胞相關的基因Foxp-3、IL-10、TGF-β表達情況則基本不變。由此表明，sTim-3可能參與了T細胞介導免疫應答的負性調控。

技術實現要素：

鑒于現有技術的情況，本發明的目的在于提供一種抗人Tim-3單克隆抗體8E11及其制備方法。

為了實現上述目的及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面提供了一種抗人Tim-3單克隆抗體，所述抗體含有輕鏈可變區和重鏈可變區。

優選地，輕鏈可變區含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

優選地，重鏈可變區含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本發明第二方面提供了一種多核苷酸，其編碼所述抗人Tim-3單克隆抗體。

本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。

編碼所述單克隆抗體的多核苷酸序列可以通過本領域技術人員熟知的任何適當的技術制備。所述技術見于本領域的一般描述，如《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等，科學出版社，1995)。包括但不限于重組DNA技術、化學合成等方法。

在本案的較佳實施例中，編碼上述單克隆抗體的多核苷酸為DNA分子，所述DNA分子含有編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區核苷酸序列以及編碼所述單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列。

編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。編碼所述單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本發明第三方面提供了一種表達載體，其含有所述多核苷酸以及與該序列操作性相連的表達調控序列。

本領域的技術人員熟知的方法能用于構建所述載體。這些方法包括重組DNA技術、DNA合成技術等。可將編碼所述單克隆抗體的DNA有效連接到載體中的多克隆位點上，以指導mRNA合成進而表達蛋白，或者用于同源重組。

較佳的，所述載體為原核載體或穿梭質粒等。

本發明第四方面提供了一種宿主細胞，其被所述載體所轉化。

宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門菌、李斯特細菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO,COS.293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。

本發明第五方面提供了一種制備上述單克隆抗體的方法，該方法具體包括如下步驟：

a)獲得目的基因片段；

b)將目的基因融合片段插入表達載體中；

c)將獲得的表達載體轉化真核宿主細胞；

d)在適合所述單克隆抗體表達的條件下培養步驟c)所得的真核宿主細胞；

e)分離純化獲得所述重組單克隆抗體。

較佳的，步驟a)中，所述目的基因含有SEQ ID NO：3所示的編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的編碼所述單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列。

較佳的，步驟b)中，所述表達載體可以是常規的原核系統表達載體，優選pNP表達載體。

較佳的，步驟c)中，可將獲得的表達載體轉化大腸桿菌，優選大腸桿菌DH5a；宿主細胞，可優選CHO細胞。

較佳的，步驟e)中，分離純化方法為：用ProteinG親和層析柱從細胞培養上清中直接分離純化出上述單克隆抗體。

本發明第六方面，提供了所述單克隆抗體在制備Tim-3檢測或診斷試劑盒中的應用。

本發明第七方面，提供了一種Tim-3檢測或診斷試劑盒，含有前述單克隆抗體。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

本發明的抗人Tim-3單克隆抗體特異性高，效價高，相對于目前市場上常用的R&D公司和eBioscience公司的抗人Tim-3抗體結合效率更高，為Tim-3的檢測提供了全新的手段。

附圖說明

圖1：本發明的抗人Tim-3單克隆抗體8E11抗體標記L929-Tim3細胞，再標記羊抗鼠PE二抗(eBioscience)，流式細胞儀檢測結果，同時設置商品化抗體和同型對照。

具體實施方式

本發明涉及一種抗人Tim-3單克隆抗體，該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區。輕鏈可變區含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。重鏈可變區含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本文所用的術語“單克隆抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對單個抗原點。而且，與常規多克隆抗體制劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤培養來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來產生抗體。

本文所用的術語“抗體”和“免疫球蛋白”是有相同結構特征的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其后是多個恒定區。每條輕鏈的一端由可變區(VL)，另一端有恒定區：輕鏈的恒定區與重鏈的第一個恒定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的氨基酸在輕鏈和重鏈的可變區之間形成界面。

本文所用的術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗體可變區中。它集中于輕鏈和重鏈可變區中稱為互補決定區(CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為架構區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈p一折疊構型，由形成接連環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分p折疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等，NIH PuB，No.91-3242,卷I，647-669頁(1991))，恒定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細胞毒性。

單克隆抗體可用本領域技術人員熟知的各種方法來獲得。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature,256:495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)制得。單克隆抗體也可用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技術從噬菌體抗體庫中分離獲得。

本發明還提供了編碼本發明抗人Tim-3單克隆抗體的DNA分子。在一個較佳的實例中，該DNA分子含有SEQ ID NO：3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的編碼所述單抗重鏈可變區的核苷酸序列。

在獲得編碼本發明抗人Tim-3單克隆抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列后，通常可通過以下方法來制備本發明的單克隆抗體。

首先，提供含有編碼本發明的單克隆抗體的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達調控序列的表達裁體。

本文所用的術語“表達調控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達的序列。表達調控序列包括與目標核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。它們通常含包括核苷酸序列適當翻譯所需的序列。“操作性相連”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活動。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉錄，則它與編碼序列是操作性相連的。

編碼本發明單克隆抗體的DNA序列可用本領域技術人員熟知的常規手段來制得。例如，可根據本發明公開的序列人工合成或用PCR法擴增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列。然后，用本領域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切為點將這些核苷酸序列插入合適的表達裁體中，使它們分別在表達裁體中所攜帶的重鏈恒定區編碼序列和輕鏈恒定區編碼序列之前，并使它們在同一讀框中。

本發明所用的表達裁體是本領域技術人員已知的各種市售的表達裁體，例如購自Qiagen和Promega公司的表達裁體，以及可購得的表達裁體pMG18(《根據INCP-9質粒序列進行環境監測的工具德開發》(DEVELOPMENT OFTOOLS FORENVIROMNENTAL MONITORING BASED ON INCP-0PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created,R.Krasowiak,M.Titok,C.M.ThomasSchool of Biological Sciences,University of Birmingham,Edgbaston,Birmingham B152TT,UK and Faculty of Biology,Dept of MicroBiology,Belarus State UniversityScoring Av.4,Minsk 220080Belarus).

隨后，用上述獲得的表達裁體轉化合適的宿主細胞。“宿主細胞”一般包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞核哺乳動物細胞。在本發明中，較佳的宿主細胞是CHO細胞。用表達裁體轉化宿主細胞的方法有很多種，所用的轉化程序取決于待轉化的宿主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞中的方法本領域所知的，其包括葡聚糖界導的轉染、磷酸鈣沉淀、Polybrene(1，5一二甲基一1，5一二氮十一亞甲基聚臭化物)介導轉染、原生質體融合、電穿孔、脂質體介導轉染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發明中，較佳的方法是電穿孔法或脂質體介導法等。例如可采用Invitrogen公司的脂質體法試劑盒來轉染CHO細胞。

然后，在適合本發明單克隆抗體表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞。然后用常規的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的重組抗雙酚A單克隆抗體。

所得單克隆抗體可用常規手段來鑒定。單克隆抗體的結合特異性可用免疫沉淀或體外結核試驗(如放射性免疫測定Munson等，Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard)分析來測定。

以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發明具體實施方式之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中另外明確指出，單數形式“一個”、“一”和“這個”包括復數形式。

當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。

除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實施例1抗人Tim-3單克隆抗體8E11的制備與獲得

一、動物免疫

以純化的重組人Tim-3蛋白(R&DSystems,2365-TM)為免疫原，免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，每2周免疫1次，共免疫3次，于融合前4天，再次以加強免疫。

二、骨髓瘤細胞的準備

融合前10天復蘇小鼠骨髓瘤細胞Ag8，采用含10％胎牛血清的DMEM培養基培養，待細胞生長旺盛、形態良好(渾圓，透亮，大小均一)，且細胞活力大于95％(苔盼藍染色)方可用以融合。融合前24～36h用新鮮培養基將細胞濃度調整為3×10⁵/mL。

三、雜交瘤細胞株的建立

實驗開始前將DMEM基礎培養基、PEG溶液置于37℃水浴中預溫。收集2×10⁷個生長良好的Ag8細胞，與1×10⁸個脾臟細胞混合于50ml離心管中，用無血清DMEM培養基洗滌兩遍，1000rpm離心5min后棄盡上清，用手指彈擊管底，使兩種細胞充分混勻成糊狀。將塑料管置于37℃保溫杯中，吸取1ml經37℃預溫的50％的PEG溶液，將尖頭吸管輕輕插入細胞懸液中，在1min內勻速加完，且邊加邊輕輕攪拌，然后在37℃水浴中靜置90s。接著在3個1min內同樣勻速分別加入1ml、2ml、3ml 37℃預溫的無血清DMEM，最后加入37℃預溫的無血清DMEM使管內液體終體積為40ml，室溫靜止5min，800rpm離心10min，棄上清，將沉淀細胞輕置于100ml含2％HAT、10％胎牛血清的DMEM培養基中。混勻后滴加在含有飼養細胞的96孔培養板中，100μl/孔，37℃、5％CO₂培養，3～4d后半量換液，10d后改用HT培養基，2周后轉用含10％胎牛血清的DMEM培養基。

四、陽性雜交瘤細胞的篩選

待雜交瘤細胞克隆布滿1/3-1/4培養孔時(培養基顏色呈黃色)，即可吸取上清用間接免疫熒光標記和流式細胞術進行篩選。以L929-Tim-3基因轉染細胞為陽性抗體篩選細胞，L929為陰性抗體篩選細胞，同時以商品化PE標記的抗人TIM-3單抗(R&DClone#344823)為陽性對照。吸取雜交瘤培養上清用間接免疫熒光標記法和流式分析進行篩選，獲得陽性克隆后適時換液并及時按上述方法進行復篩。

五、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養

采用有限稀釋法將陽性孔的細胞準確計數后，用HAT選擇培養基梯度稀釋為10個/ml細胞，稀釋后的細胞懸液100μl/孔于96孔培養板中，每孔平均含有1個細胞，37℃、5％CO₂培養。根據細胞的生長狀態適時更換培養基并及時按已建立的陽性克隆的篩選方法進行復篩。選擇單個克隆生長、形態良好、抗體效價高的雜交瘤細胞繼續亞克隆，直至抗體分泌陽性率大于98％；擴大培養并及時液氮凍存。

將獲得的鼠抗人Tim-3單克隆抗體8E11進行可變區測序。

從雜交瘤細胞株中分離總RNA，轉錄成cDNA庫。PCR擴增編碼抗體重鏈和輕鏈可變區DNA。PCR產物跑膠之后回收純化之后送測序。

得知，本發明的抗人Tim-3單克隆抗體8E11，輕鏈可變區具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具體為：

LDIVLTQSPSYLAAPPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAMYYRQQHNEYPWTFGGGTKLEIKRI。

重鏈可變區具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具體為：

HRVESGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFLSRLNITMDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARDLYHYAMDYWGQGTSITVSSKSQSFPNVFPLISCDSPLSDKNLV。

編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的，具體為：

CTCGATATTGTGTTGACACAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCACCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAACTTCTTATATACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAACCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACCGTCAACAGCATAATGAATACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAACGTATA。

編碼所述單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具體為：

GCTGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGGCTTCAGGTGCACCGGGTGGAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAcCTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCCTATCCAGACTGAACATCACCATGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGCCTGCAAGCTGATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGACCTTTACCACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAATCACCGTCTCCTCAAAGAGTCAaTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCaTCTCCTGCGACAGCCCCCTGTCTGATAAGAATCTGGTGGC。

實施例2抗人Tim-3單克隆抗體的效價評價

培養L929-Tim3細胞，轉移至96孔板，每孔1×10⁵細胞懸浮在100μl的含1％FBS的PBS中。每孔加入相同量0.2μg的抗體，包括實施例1制備的抗人Tim-3單克隆抗體8E11、同型對照以及R&D和eBioscience公司抗人Tim-3抗體。在4℃避光條件下孵育20分鐘，然后離心棄去上清，重懸在含1％FBS的PBS中，流式細胞術檢測。

結果如圖1所示，與R&D公司以及eBioscience公司已知的抗體相比，本發明的抗人Tim-3單克隆抗體，在相同濃度下可以更高效率的結合率。

以上的實施例是為了說明本發明公開的實施方案，并不能理解為對本發明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發明中方法、組合物的變化，在不脫離本發明的范圍和精神的前提下對本領域內的技術人員來說是顯而易見的。雖然已結合本發明的多種具體優選實施例對本發明進行了具體的描述，但應當理解，本發明不應僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領域內的技術人員來說顯而易見的修改來獲取發明都應包括在本發明的范圍內。

SEQUENCE LISTING

<110> 常州格魯康生物醫藥科技有限公司

<120> 一種抗人Tim-3單克隆抗體8E11及其制備方法

<130> 164867

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 輕鏈可變區具有的氨基酸序列

<400> 1

Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Pro Pro

1 5 10 15

Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Arg Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile

100 105 110

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 重鏈可變區具有的氨基酸序列

<400> 2

His Arg Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly Val

20 25 30

His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val

35 40 45

Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Leu Ser Arg

50 55 60

Leu Asn Ile Thr Met Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp

85 90 95

Leu Tyr His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Ile Thr

100 105 110

Val Ser Ser Lys Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe Pro Leu Ile Ser

115 120 125

Cys Asp Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val

130 135

<210> 3

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區核苷酸序列

<400> 3

ctcgatattg tgttgacaca gtctccatct tatcttgctg cacctcctgg agaaaccatt 60

actattaatt gcagggcaag taagagcatt agcaaatatt tagcctggta tcaagagaaa 120

cctgggaaaa ctaataaact tcttatatac tctggatcca ctttgcaatc tggaattcca 180

tcaaggttca gtggcagtgg atctggtaca gatttcactc tcaccatcag taacctggag 240

cctgaagatt ttgcaatgta ttaccgtcaa cagcataatg aatacccgtg gacgttcggt 300

ggaggcacca agctggaaat aaaacgtata 330

<210> 4

<211> 473

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 編碼所述單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列

<400> 4

gctgctcgag cggccgccag tgtgatggat atctgcagaa ttcggcttca ggtgcaccgg 60

gtggagtcag gacctggcct agtgcagccc tcacagagcc tgtccatcac ctgcacagtc 120

tctggtttct cattaactac ctatggtgta cactgggttc gccagtctcc aggaaagggt 180

ctggagtggc tgggagtgat atggagtggt ggaagcacag actataatgc agctttccta 240

tccagactga acatcaccat ggacaattcc aagagccaag ttttctttaa aatgaacagc 300

ctgcaagctg atgacacagc catatattac tgtgccagag acctttacca ctatgctatg 360

gactactggg gtcaaggaac ctcaatcacc gtctcctcaa agagtcaatc cttcccaaat 420

gtcttccccc tcatctcctg cgacagcccc ctgtctgata agaatctggt ggc 473