專利名稱：一種蒙古黃芪異黃酮合成酶基因及其全長cDNA序列的制作方法
所屬領域本發明涉及一種在蒙古黃芪(Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus)中表達的異黃酮合成酶基因及其核苷酸序列，即蒙古黃芪異黃酮合成酶(Astragalusmembranaceus Bge.var.mongholicus 2-Hydroisoflavone Synthase，AMIFS)的基因及其核苷酸序列。
背景技術：
異黃酮是豆科(Leguminosae)植物抗微生物的植保素，參與防御病原體的侵染；一些異黃酮類化合物能夠阻止害蟲的侵食(Phytochemistry，1986，25979-995；PhysiolPlant，1995385-392)。異黃酮在豆科植物與土壤微生物形成根瘤菌的早期反應中起信號作用(Annu Rev Phytopathol，1995，33345-368)。同時，異黃酮對人體有很多的好處，引起了人們的廣泛關注，如抗腫瘤(J Natl Cancer Inst，1991，83541-546)、防治冠狀心臟病(BioFactors，2000，12209-215)、減輕更年期綜合癥(International Journalof Gynecology & Obstetrics，1995，5163-64)和預防骨質疏松癥(Menopause，1998，59-15)等；近20年來異黃酮在生物學方面的應用研究發展迅速。
異黃酮是苯丙氨酸代謝分枝途徑中的次生代謝物。在異黃酮合成中最關鍵的環節是類黃酮代謝進入異黃酮代謝的反應步驟，該步驟由異黃酮合成酶催化。蒙古黃芪異黃酮合成酶是蒙古黃芪異黃酮合成的催化酶，在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的蒙古黃芪異黃酮合成酶基因及其核苷酸序列。

發明內容
本發明的目的就是提供一種新的蒙古黃芪異黃酮合成酶基因及其全長cDNA序列。
在本發明中，“分離的”cDNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其蛋白質分開。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒、粘粒等。在產生本發明的蒙古黃芪異黃酮合成酶基因時，可以將蒙古黃芪異黃酮合成酶基因編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
本發明的蒙古黃芪異黃酮合成酶基因全長cDNA序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
獲得有關的序列后，用重組法來大批量地獲得有關序列。通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工化學合成的方法來合成有關序列。在本申請之前，現有技術已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然后再進行連接而獲得編碼本發明蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的核苷酸序列。然后，可將該核苷酸序列引入本領域中各種現有的DNA分子(如載體)和細胞中。
表2為本發明的蒙古黃芪異黃酮合成酶基因與大豆異黃酮合成酶基因全長cDNA序列(GenBank Accession No.AF195798)的同源比較圖。
下面結合具體步驟，進一步闡述本發明。應理解，這些步驟僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列步驟中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等《分子克隆實驗指南》、《實驗室手冊》(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
步驟1蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的克隆1.組織分離(isolation)
蒙古黃芪種子來源于山西農業大學，經25℃暗培養4d，用10mmol/L還原型谷光甘肽誘導10h后，取其根部，用液氮速凍。
2.總RNA的分離(total RNA isolation)和檢測取根部，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，電泳圖譜呈現出3條清晰可區分的條帶，其中28SRNA∶18S RNA比值約為2∶1，表明總RNA基本上未降解，可用于蒙古黃芪異黃酮合成酶基因全長克隆。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)進行cDNA全長克隆，分四個階段進行(1).RT-PCR根據大豆和其它豆科植物異黃酮合成酶基因的核苷酸保守序列，設計保守引物RT-F(SEQ ID NO.1)和RT-R(SEQ ID NO.2)，采用RT-PCR的方法(TaKaRa試劑盒)，得到1995PX1(673bp)連接到T-easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列與己知豆科植物如大豆(Glycinemax)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)和刺甘草(Glycyrrhiza echinata)的異黃酮合成酶基因的同源性分別為81％、84％、84％，故初步認為它是一個異黃酮合成酶基因。
(2).3′-RACEAP反轉錄總RNA，得到第一鏈cDNA，PCR(AUAP+1995PXF1(SEQ ID NO.3))得到1995PX1(898bp)，其它過程同(1)所示，測序結果已有的數據庫(Genebank+EMBL)搜索，得到其核酸序列與已知豆科植物如大豆、鷹嘴豆和豌豆(Pisum sativum)的異黃酮合成酶基因的同源性分別為83％、83％、82％，故可進一步確認它是一個異黃酮合成酶基因。
(3).5′-RACE第一輪PCR(AAP+1995PR1(SEQ ID NO.4))第二輪PCR(AUAP+1995PR2(SEQ ID NO.5))得到1995PX 2(970bp)其它過程如同(1)所示。
(4).PCR擴增1995PX編碼區通過組合使用上述3種方法，拼接候選的蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的全長cDNA序列，在該序列(至少包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物F15′-ATGTTGTTAGAACTTGCAGTAAC-3′(SEQ ID NO.6)為正向引物，寡核苷酸R15′-TCAAGAGGAAAGGAGTTTAGTC-3′(SEQ ID NO.7)為反向引物，以總RNA經Oligo(dT)反轉錄為模板，用高保真的Pyrobest酶，進行PCR擴增，F1/R1的PCR條件為94℃4min，隨之以94℃1min、58℃1min和72℃1min 30sec進行35個循環，最后以72℃延伸10min。電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片段長度為1,578bp。(其它過程同(1))。
因此，組合上述4種方法得到的結果，獲得了蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的全長cDNA序列(表1)。
BLAST的結果證明從蒙古黃芪中新得到的基因確為一個異黃酮合成酶基因。由于已知的同源異黃酮合成酶能夠催化黃烷酮生成異黃酮，故推測此基因具有相同的功能。
步驟2蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的序列信息與同源性分析本發明新的蒙古黃芪異黃酮合成酶基因全長cDNA的長度為1,995bp，詳細序列見表1，其中開放讀框位于106-1684位核苷酸。將蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的全長cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸同源性檢索，結果發現它與大豆異黃酮合成酶基因(GenBank Accession No.AF195798)在核苷酸水平上有81％的相同性(表2)，可以認為兩者在功能上有很高相似性。
步驟3蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的功能分析在該步驟中，將全長蒙古黃芪異黃酮合成酶的編碼序列構建入酵母真核表達載體之中，以分析該基因的功能。
1.酵母表達載體的構建依據蒙古黃芪異黃酮合成酶的全長cDNA序列(表1)，設計擴增出完整開放閱讀框的引物，分別在正、反引物上分別引入限制性內切酶位點HindIII和Xba I(根據酵母表達質粒pYES2和蒙古黃芪異黃酮合成酶的全長cDNA序列而定)。以步驟1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，保證蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的閱讀框完全正確，并用HindIII和Xba I內切酶進行37℃酶切3h，回收目的片段1,595bp；酵母表達載體pYES2(Invitrogen)用HindIII和Xba I內切酶37℃酶切3h，回收目的片段5,806bp。將經酶切的蒙古黃芪異黃酮合成酶基因的目的片段克隆至酶切過的pYES2表達載體上，轉化大腸桿菌TOP 10F’，37℃培養20h，進行重組子的PCR鑒定和酶切鑒定。
2.變性鮭精DNA的制備1)溶解1g的鮭精DNA于100ml 1×TE中，并用10ml的槍頭不斷上下吸取促進完全溶解。
2)4℃過夜。
3)用大探頭、3/4功率超聲波處理兩次，共30sec，處理過的鮭精DNA片段大約為7Kb。
4)等分超聲波處理過的DNA到4個新的50ml的離心管中。
5)用25mlTE飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次。
6)重力離心力10,000g，4℃離心5min，取上清液到另一新的50ml的離心管中。
7)用25ml氯仿抽提，重力離心力10,000g，4℃離心5min，吸取上清液到250ml離心瓶中。
8)加入5ml 3M醋酸鈉(pH＝6.0)和125ml-20℃預冷的95％乙醇沉淀DNA。
9)重力離心力12,000g，4℃離心15min。
10)用200ml 70％乙醇洗滌一次，重力離心力12,000g，4℃離心15min。
11)在空氣或真空離心蒸發濃縮器中干燥DNA 20min。
12)轉移DNA到250ml無菌的燒瓶中，用100ml無菌的1×TE溶解DNA。
13)煮沸DNA 20min以變性DNA，立即置于冰上，小等分變性的鮭精DNA，-20℃保存。
3.酵母遺傳轉化1)接種單克隆的INVSc1入10ml的YPD培養基，30℃搖菌過夜。
2)測定過夜培養酵母菌液的OD600值，稀釋菌液濃度至OD600＝0.4，繼續搖菌2-4h。
3)轉速2,500rpm，室溫離心10min，用40ml 1×TE重懸。
4)轉速2,500rpm，室溫離心10min，用2ml 1×LiAc/0.5×TE重懸，室溫溫浴10min。
5)取100ul酵母懸浮液，加入1ug含目的基因的重組質粒和100ug變性的切割的鮭精DNA。
6)加入700ul 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE混勻。
7)30℃溫浴30min。
8)加入88ul DMSO混勻，42℃熱擊7min。
9)小離心機離心10sec，棄上清，用1ml 1×TE重懸。
10)小離心機離心10sec，用50-100ul 1×TE重懸，涂布于選擇培養基SC-U上。
4.蒙古黃芪異黃酮合成酶的誘導表達1)挑取含目的基因的酵母菌INVSc1到SC-U培養基(含2％棉子糖)中，30℃搖菌過夜。
2)測量菌液的OD600值，計算稀釋到50ml誘導培養基中、菌液的OD600＝0.4所需步驟1的菌液量。
3)吸取步驟2計算出來的過夜酵母菌液量，重力離心力1,500g，4℃離心5min。
4)用1-2ml誘導培養基(SC-U培養基含2％半乳糖)重懸酵母菌，接種到50ml誘導培養基中，30℃搖菌。
5)0、2、4、6、8、10h后分別吸取5ml的酵母菌液，測量每個樣品的OD600值。
6)重力離心力1,500g，4℃離心5min。
7)棄上清，用500ul無菌水重懸酵母菌。
8)移取酵母菌液到1.5ml離心管中，在小離心機中最高轉速離心30sec。
9)棄上清，-80℃保存，或繼續下一步實驗以裂解酵母菌、檢測重組蛋白。
5.蒙古黃芪異黃酮合成酶的檢測1)取上一步的酵母細胞，加500ul裂解緩沖液重懸，重力離心力1,500g，4℃離心5min。
2)棄上清，用裂解緩沖液重懸至OD600＝50-100。
3)加入等體積的酸洗玻璃珠。
4)漩渦混勻30sec，然后至冰上30sec，重復4次以裂解酵母細胞，同時可以吸取小量的細胞在顯微鏡下檢測裂解的程度。
5)在小離心機上最大速度離心10min。
6)吸取上清液到一新的小離心管中。
7)加入SDS-PAGE樣品緩沖液，煮沸樣品5min。
8)以BSA作為標樣，取20ug裂解物進行SDS-PAGE電泳。
6.酵母微粒體的制備1)取上一步檢測得到蒙古黃芪異黃酮合成酶含量最高的酵母菌，用消解酶20T消化成原生質球。
2)酵母原生質球在4℃下用玻璃珠和buffer A進行裂解。
3)裂解物連續用重力離心力10,000g和15,000g各離心10min。
4)取上清液，重力離心力160,000g，4℃超速離心90min。
5)沉淀用bufferA重懸，約1.5-2.5mg/ml蛋白。
7.蒙古黃芪異黃酮合成酶活性的分析1)取上述1ml的蛋白酶液，加入30ul含670-1670Bq甘草根廷配基的β-巰基乙醇和20ul的NADPH。
2)25℃溫浴2h，加入30ul乙酸終止反應。
3)乙酸乙酯提取反應混合液，然后用高效液相色譜進行酶活分析，CLC-ODS柱(6.0×150mm)，40％(V/V)甲醇作為流動相，流速1ml/min，柱溫40℃，λ＝285nm檢測大豆黃素是否存在。
本發明涉及的記號及序列分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1TGTGCCCTTGGAACTGTGAG(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性
(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2CTGAGGACGAGACCATGGAGA(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1AGCACGAGAGGAGGTTGACAC(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4GAGAAGAAATCCACAACAAGACC(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸
(iii).序列描述SEQ ID NO.5TCTCCATGGTCTCGTCCTCAG(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ATGTTGTTAGAACTTGCAGTAAC(7)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.7TCAAGAGGAAAGGAGTTTAGTC
表1、蒙古黃芪異黃酮合成酶基因全長序列表<110>福建農林大學<120>蒙古黃芪異黃酮合成酶基因全長序列表<160>1<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>1995<212>DNA<213>蒙古黃芪(Astragalus membranaceus)<221>gene<222>(1)…(1995)<400>Full length sequence of isoflavone synthase gene from Astragalus membranaceus1CAAAAACACA AAATCCTACT AGCTGTTTAG CCTCAACAGA CTCGAGACTCTTACTTGTTC GTTCCTATAG CAAGTTAATT AATTAATTTA GCAAAATCAA101 AGACGATGTT GTTAGAACTT GCAGTAACTC TATTGGTGAT AGCTCTCTTCATACACCTTC GTCCCACACC TTCTGCAAAA TCAAAGGCTC TTCGCCACCT201 TCCTAATCCT CCAAGTCCTA AACCTCGTCT CCCTTTCATT GGCCACCTTCACCTATTGGA CAAACCTCTT CTTCATCAAT CTCTCATCCG TCTAGGTGAA301 CGCTATGGCC CTTTGTACTC TCTCTACTTT GGCTCCATGC CTTGCGTTGTTGCATCCACC CCTGAACTGT TCAAACTCTT TCTTCAAACC CATGAGGCTT401 CTTCCTTTAA TACCAGGTTC CAAACCTCTG CTATTAGACG CCTCACCTATGATAACTCTG TTGCCATGGT TCCCTTTGGA CCTTACTGGA AGTTCATTAG501 GAAGCTCATC ATGAATGACC TTCTCAACGC CACCACTGTC AACAAGTTGAGGCCTTTGAG GAGCCAGGAA ATCCGTAAGG TTCTTAATGT CATGGCAAAG601 AGTGCTGAGG CTCAGCAGCC CCTCAATGTT ACCGAGGAGC TTCTCAAGTGGACCAATAGC ACCATCTCTA GGATGATGTT GGGTGAAGCT GAAGAGATTA701 GAGATATTGC TCGTGATGTG CTTAAGATCT TTGGGGAGTA TAGTCTTACAGACTTCATTT GGCCATTGAA GAAGTTCAAG GTTGGGCAGT ATGAGAAGAG801 AATTGACGAT ATTTTCAACA GGTTTGATCC TGTGATTGAG AAGGTCATCAAGAAACGCCA AGAGATAATC AAGAGAAGAA AGGAGAGAAA TGGAGAACTT901 GAAGAGGGTG AGCAGAGTGT AGTGTTTCTC GATACTTTGC TTCAATATGCTGAGGACGAG ACGATGGAGA TCAAAATTAC CAAAGAACAA ATCAAGGGTC1001 TTGTTGTGGA TTTCTTCTCT GCTGGAACGG ATTCAACCGC CGTCGCAACAGATTATGCTT TGGCGGAGCT GATCAACAAC CCCAAGGTCC TTAGAAAAGC1101 ACGAGAGGAG GTTGACACGG TTGTGGGAAA AGATAGACTG GTTGATGAAT
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1020 TGCTGGAACGGATTCAACCGCCGTCGCAACAGATTATGCTTTGGCGGAGCTGATCAACAA||| || || ||||| || || || |||||||| | || ||||| ||||| ||||||||975 TGCAGGGACAGATTCCACAGCGGTGGCAACAGAGTGGGCATTGGCAGAGCTCATCAACAA1080 CCCCAAGGTCCTTAGAAAAGCACGAGAGGAGGTTGACACGGTTGTGGGAAAAGATAGACT|||| ||| | ||| || || |||||||| ||| |||||||| |||||||||||1035 TCCCAGGGTGTTGCAAAAGGCTCGTGAGGAGGTCTACAGTGTTGTGGGCAAAGATAGACT1140 GGTTGATGAATCAGATGTTCAACATCTTCATTACATTAGAGCTATTGTGAAGGAGACATT||||| ||| || |||| | |||| ||||||||| || |||||||||||||||||1095 CGTTGACGAAGTTGACACTCAAAACCTTCCTTACATTAGGGCCATTGTGAAGGAGACATT1200 CCGTATGCACCCACCACTGCCCGTTGTGAAAAGAAAGTGTACACAAGACTGTGAGATCGA||| |||||||||||||| || || || ||||||||||| ||| |||| |||||||| |1155 CCGAATGCACCCACCACTCCCAGTGGTCAAAAGAAAGTGCACAGAAGAGTGTGAGATTAA1260 CGGCTTTGTCATCCCAGAGGGAGCACTGATACTTTTCAATGTTTGGGCCGTTGGAAGAGA|| | ||| ||||||||||||||| || | ||||||||||||||| || ||||| ||1215 TGGGTATGTGATCCCAGAGGGAGCATTGGTTCTTTTCAATGTTTGGCAAGTAGGAAGGGA1320 TCCAAAGTACTGGGATAGGCCCTCAGAATTTCTTCCTGAGAGATTTTTAGAAAAAGCCGG|| || |||||||| || || |||||||| | ||| ||||| || ||||||| ||1275 CCCCAAATACTGGGACAGACCATCAGAATTCCGTCCCGAGAGGTTCTTAGAAACT...GG1380 TGGTGAAGGGGAAGTAGGTCCGATTGATCTTAGGGGTCAACATTTCCAACTTTTGCCATT|| ||||||||||| ||| || ||||||||||||| || ||||||||||| | |||||1332 TGCTGAAGGGGAAGCAGGGCCTCTTGATCTTAGGGGCCAGCATTTCCAACTCCTCCCATT1440 TGGGTCTGGTAGGAGGATGTGCCCGGGAGTAAATTTGGCTACTGCTGGAATGGCCACGCT||||||||| ||||| |||||||| || || |||||||||||| | |||||||| || ||1392 TGGGTCTGGGAGGAGAATGTGCCCTGGTGTCAATTTGGCTACTTCAGGAATGGCAACACT1500 GCTTGCATCCGTTATCCAAACCTTTGATCTACAGGTACCAGGCCCACAAGGCCAAATATT|||||||| |||||||| |||||| || || || | ||||| ||||| ||||||||1452 TCTTGCATCTCTTATCCAATGCTTTGACCTGCAAGTGCTGGGCCCTCAAGGACAAATATT1560 AAAAGGAGATGAGGCTAAGGTTAGCATGGAAGAAAGAGCTGGTCTCACTGTTCCAAGGGC||||| ||||| || || |||||||||||||| |||||||| ||||| |||||||||||1512 GAAAGGTGATGATGCCAAAGTTAGCATGGAAGAGAGAGCTGGCCTCACAGTTCCAAGGGC1620 ACATAATCTCATCTGTGTTCCGCTTGCAAGAGCAGGTGTCGCAGCTAAACTCCTTTCCTC||||| |||| | |||||||| |||||||||| || ||| ||||||||||||| |1572 ACATAGTCTCGTTTGTGTTCCACTTGCAAGGATCGGCGTTGCATCTAAACTCCTTTCTTA1680 TTGAAACCTACAACAAAAAAGACAAGAATAATGATGTCATGGAAGATGTTATTTTATAAT
| ||| | | | | | || | | || ||| | || || | |||||1632 ATTAAGATAATCATCATATACAATAGTAGTGTCTTGCCATCGCAGTTGCTTTTTATGTAT1740 TTATATATGTTTTGTAGTAATACTCATTTTCAATAAGGCGTCATTAATTAAGAGACAATG| |||| | || | |1692 TCATAATCATCATTTCAATAAGGTGTGACTGGTACT........................
1800 AGTCCAAGCCACGACACCCACAGGATGTTGTTGGAAGAGACACGTATATGCATAGTCTCA1728 ............................................................
1860 ACTAGTCTCTCTTGTTATACAATGTACTTCTTTTTTAGTCACAAATGAAAATTGTTGCAA1728 ............................................................
1920 CTTCTATTTGTATTTTTAAGGGCATATCCACTAATACTACAATCTTGGTTTATCTCTACA|||| ||| |||| |1728 ..............................TAATCAAGTAATTAAGGTTACATACATGC1980 AAAAAAAAAAAAAAAA||||||||||||||||1757 AAAAAAAAAAAAAAAAAA上列蒙古黃芪異黃酮合成酶的核酸序列下列大豆異黃酮合成酶的核酸序列(GenBank Accession No.AF195798)
權利要求
1.一種蒙古黃芪異黃酮合成酶基因，其特征是從蒙古黃芪克隆分離而得，該基因的全長cDNA長度為1,995bp，其中開放閱讀框位于106-1684位核苷酸，詳細序列為1 CAAAAACACA AAATCCTACT AGCTGTTTAG CCTCAACAGA CTCGAGACTC51TTACTTGTTC GTTCCTATAG CAAGTTAATT AATTAATTTA GCAAAATCAA101 AGACGATGTT GTTAGAACTT GCAGTAACTC TATTGGTGAT AGCTCTCTTC151 ATACACCTTC GTCCCACACC TTCTGCAAAA TCAAAGGCTC TTCGCCACCT201 TCCTAATCCT CCAAGTCCTA AACCTCGTCT CCCTTTCATT GGCCACCTTC251 ACCTATTGGA CAAACCTCTT CTTCATCAAT CTCTCATCCG TCTAGGTGAA301 CGCTATGGCC CTTTGTACTC TCTCTACTTT GGCTCCATGC CTTGCGTTGT351 TGCATCCACC CCTGAACTGT TCAAACTCTT TCTTCAAACC CATGAGGCTT401 CTTCCTTTAA TACCAGGTTC CAAACCTCTG CTATTAGACG CCTCACCTAT451 GATAACTCTG TTGCCATGGT TCCCTTTGGA CCTTACTGGA AGTTCATTAG501 GAAGCTCATC ATGAATGACC TTCTCAACGC CACCACTGTC AACAAGTTGA551 GGCCTTTGAG GAGCCAGGAA ATCCGTAAGG TTCTTAATGT CATGGCAAAG601 AGTGCTGAGG CTCAGCAGCC CCTCAATGTT ACCGAGGAGC TTCTCAAGTG651 GACCAATAGC ACCATCTCTA GGATGATGTT GGGTGAAGCT GAAGAGATTA701 GAGATATTGC TCGTGATGTG CTTAAGATCT TTGGGGAGTA TAGTCTTACA751 GACTTCATTT GGCCATTGAA GAAGTTCAAG GTTGGGCAGT ATGAGAAGAG801 AATTGACGAT ATTTTCAACA GGTTTGATCC TGTGATTGAG AAGGTCATCA851 AGAAACGCCA AGAGATAATC AAGAGAAGAA AGGAGAGAAA TGGAGAACTT901 GAAGAGGGTG AGCAGAGTGT AGTGTTTCTC GATACTTTGC TTCAATATGC951 TGAGGACGAG ACGATGGAGA TCAAAATTAC CAAAGAACAA ATCAAGGGTC1001 TTGTTGTGGA TTTCTTCTCT GCTGGAACGG ATTCAACCGC CGTCGCAACA1051 GATTATGCTT TGGCGGAGCT GATCAACAAC CCCAAGGTCC TTAGAAAAGC1101 ACGAGAGGAG GTTGACACGG TTGTGGGAAA AGATAGACTG GTTGATGAAT1151 CAGATGTTCA ACATCTTCAT TACATTAGAG CTATTGTGAA GGAGACATTC1201 CGTATGCACC CACCACTGCC CGTTGTGAAA AGAAAGTGTA CACAAGACTG1251 TGAGATCGAC GGCTTTGTCA TCCCAGAGGG AGCACTGATA CTTTTCAATG1301 TTTGGGCCGT TGGAAGAGAT CCAAAGTACT GGGATAGGCC CTCAGAATTT1351 CTTCCTGAGA GATTTTTAGA AAAAGCCGGT GGTGAAGGGG AAGTAGGTCC1401 GATTGATCTT AGGGGTCAAC ATTTCCAACT TTTGCCATTT GGGTCTGGTA1451 GGAGGATGTG CCCGGGAGTA AATTTGGCTA CTGCTGGAAT GGCCACGCTG1501 CTTGCATCCG TTATCCAAAC CTTTGATCTA CAGGTACCAG GCCCACAAGG1551 CCAAATATTA AAAGGAGATG AGGCTAAGGT TAGCATGGAA GAAAGAGCTG1601 GTCTCACTGT TCCAAGGGCA CATAATCTCA TCTGTGTTCC GCTTGCAAGA1651 GCAGGTGTCG CAGCTAAACT CCTTTCCTCT TGAAACCTAC AACAAAAAAG1701 ACAAGAATAA TGATGTCATG GAAGATGTTA TTTTATAATT TATATATGTT1751 TTGTAGTAAT ACTCATTTTC AATAAGGCGT CATTAATTAA GAGACAATGA1801 GTCCAAGCCA CGACACCCAC AGGATGTTGT TGGAAGAGAC ACGTATATGC1851 ATAGTCTCAA CTAGTCTCTC TTGTTATACA ATGTACTTCT TTTTTAGTCA1901 CAAATGAAAA TTGTTGCAAC TTCTATTTGT ATTTTTAAGG GCATATCCAC1951 TAATACTACA ATCTTGGTTT ATCTCTACAA AAAAAAAAAA AAAAA
全文摘要
本發明提供了一種蒙古黃芪異黃酮合成酶基因，該基因從蒙古黃芪克隆分離而得，其全長cDNA長度為1,995bp，其中開放閱讀框位于106－1684位核苷酸，詳細序列如表1。蒙古黃芪異黃酮合成酶是蒙古黃芪異黃酮合成的第一個關鍵酶，蒙古黃芪異黃酮合成酶基因控制著蒙古黃芪異黃酮合成酶的合成和表達，因此該基因對蒙古黃芪異黃酮合成酶開發有重要的應用價值。
文檔編號C12P19/00GK1580274SQ20041003673
公開日2005年2月16日 申請日期2004年4月28日 優先權日2004年4月28日
發明者鄭金貴, 張丹鳳 申請人:福建農林大學