專利名稱：一種快速質粒抽提純化試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速質粒抽提純化試劑盒及其應用，尤其是涉及一種細菌質粒抽提純化試劑盒及其應用。
背景技術：
細菌的質粒是DNA重組的重要載體和工具，分離純化質粒是現代分子生物技術必不可少的手段。現有質粒的分離主要有兩個方法一是由Birnbiom和Doly創造的堿裂解法，二是由Holmes和Quigley發明的煮沸法，還有一些在此基礎上發展而來的其它方法如PEG法、氯化銫密度梯度離心法等。目前普遍使用的質粒抽提方法是以堿裂解方法為基礎結合二氧化硅DNA親和性質，加清洗液用離心或真空抽提的方法得到純化的質粒，此方法創造性地改進了質粒的抽提純化過程，它已廣泛地應用于當前醫學、農學及其它分子生物學研究領域。目前市場上所流行的各種“miniprep”、“midiprep”、“maxiprep”都是商家所提供的各種質粒純化試劑盒，其中以Qiagen公司的最為經典，其試劑盒包括七種獨立存在的不同液體試劑，用它進行質粒純化，具體包括以下步驟收集菌體、重懸、堿裂解、中性化、長時間離心除雜質、DNA結合、洗凈、洗脫等。這一方法縮短了抽提純化質粒的時間，使質粒純化的方法相對以往的方法簡單而有效，一般所花抽提純化時間約為30分鐘，因此為科研人員提供了更多的方便，節約了時間。然而，這一方法需要進行菌體的重懸、中性化和長時間的離心等繁雜步驟，花費的時間仍然較長，所花成本也較高，不太適合大量樣品的抽提，也限制了其自動化的進程。CN1546516A公開了一種質粒DNA提取和純化方法，提取和純化時間也很長，效率低。

發明內容
本發明的目的在于克服現有質粒抽提純化方法存在的缺陷，提供一種構成簡單，抽提純化操作簡便，效率更高的質粒抽提純化試劑盒及質粒抽提純化方法。
本發明的目的是采用以下技術方案實現的本發明試劑盒至少包括下列四種獨立存在的液體菌體裂解液，DNA結合柱前處理液，DNA質粒結合液，清洗液；優選方案是還配置有洗脫液。
所述菌體裂解液配方葡萄糖10mM-1M，三氨基甲烷鹽酸20mM-1M，乙二胺四乙酸10mM-500mM，碳酸氫鈉100mM-500mM，曲拉通1％-50％(體積/體積)，十二烷基磺酸鈉1％-25％(重量/體積)，溶菌酶2mg/ml-1g/ml，核糖核酸酶5-50mg/ml。
所述DNA結合柱前處理液配方氯化鋰或氯化鈉10mM-5M，氫氧化鉀或氫氧化鈉100mM-2M，十二烷基磺酸鈉5％-20％(重量/體積)，鹽酸0.01M-2.5M。
所述DNA質粒結合液的配方鹽酸胍1M-6M，氯化鈉10mM-100mM，嗎啉代乙烷磺酸10mM-100mM，異丙醇；四者體積配比40∶40∶10∶10。
所述清洗液配方三氨基甲烷鹽酸1-50mM，乙醇70-85％(體積)。
所述洗脫液為pH8-9濃度8-12mM的三氨基甲烷鹽酸；當試劑盒中沒有配備此種洗脫液時，可以純水代替此種洗脫液進行洗脫。
將各原料按配比混合，即可制備成所述各種溶液。
使用本試劑盒進行細菌質粒抽提純化的方法如下裂解菌體將40-100μl裂解溶液加入300-1000μl(OD600＞2)培養菌液，混合放置40-80秒鐘；前處理DNA結合柱將150-300μl DNA結合柱前處理溶液加入DNA結合柱中，以10000-15000轉離心8-20秒，棄除溶液；結合質粒DNA將200-400μl DNA質粒結合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管8-12次，混合，加入已經處理過的DNA結合柱之中，以10000-15000轉離心10-30秒；清洗加入清洗溶液700-900μl，以10000-15000轉離心8-20秒，棄除離心液，再離心50-80秒鐘。
洗脫加入30-40μl洗脫液于DNA結合柱中心，以10000-15000轉離心20-40秒，即可得到高純度質粒DNA。
使用本發明試劑盒及質粒抽提純化方法得到的質粒DNA，經使用分光光度計檢測，A260/A280值為1.7-2.0。
使用本發明試劑盒及質粒抽提純化方法從培養的菌體中提取高純度的質粒，可用于下列各種實驗，如酶切重組、測序、PCR等等。
本發明摒棄了以往質粒抽提所用堿裂解法，采用溫和變性劑及酶裂解法，不必離心收集菌體，直接利用高濃度(OD600＞2)培養菌液(如大腸桿菌DH5α、XL1-Blue等)進行裂解；采用全新溶液配方前處理二氧化硅纖維膜，使蛋白、RNA細菌膜片等雜質更易清除，而且質粒DNA更易結合；還省去了現有廣泛使用的經典方法中的重懸、中性化等步驟；正是由于上述原因，使用本發明之試劑盒及質粒抽提純化方法，可在3-5分鐘內快速有效地完成質粒抽提純化工作，大大縮短抽提時間，從而可為研究人員節省大量實驗時間；還可以用于大批量樣品抽提，在緊急情況下抽提純化質粒；此法還為質粒抽提的自動化和大規模化奠定了技術基礎。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明作進一步說明。
實施例1裂解液的配方為葡萄糖10mM，三氨基甲烷鹽酸20mM，乙二胺四乙酸10mM，碳酸氫鈉100mM，曲拉通1％(體積/體積)，十二烷基磺酸鈉1％(重量/體積百分比)，溶菌酶2mg/ml，核糖核酸酶5mg/ml。做每個樣品需取60μl放入離心小管內。
DNA結合柱前處理液的配方為氯化鋰10mM，氫氧化鈉0.001M，十二烷基磺酸鈉5％，鹽酸0.01M。做每個樣品取250μl放入結合柱中。
DNA質粒結合液的配方為鹽酸胍6M，氯化鈉100mM，嗎啉代乙烷磺酸100mM，異丙醇，四者體積之比為40∶40∶10∶10。做每個樣品取350μl放入結合柱中。
清洗液的配方為三氨基甲烷鹽酸1mM，再加入無水乙醇80％(體積)。做每個樣品取750μl放入結合柱中。
洗脫液為三氨基甲烷鹽酸8mM，pH8。每個樣品取量為40μl。
使用本試劑盒，進行質粒抽提純化的步驟如下(1)將裂解溶液60μl加入800μl(OD600＞2)大腸桿菌DH5α培養液，混合放置80秒鐘，同時進行第二步；(2)將250μl前處理溶液加入DNA結合柱中，10000轉離心20秒，棄除溶液；(3)將350μ1 DNA結合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管12次，混合，加入已經處理過的DNA結合柱之中，離心30秒(15000轉)；(4)加入清洗溶液750μl，15000轉離心20秒，棄除離心液，再離心80秒鐘；(5)加入40μl洗脫液于結合柱中心，15000轉離心40秒，得到高純度質粒DNA。
經使用分光光度計對抽提純化所得質粒DNA進行檢測，A260/A280值為1.7。
實施例2裂解液的配方為葡萄糖500mM，三氨基甲烷鹽酸200mM，乙二胺四乙酸100mM，碳酸氫鈉200mM，曲拉通10％(體積/體積百分比)，十二烷基磺酸鈉10％(重量/體積百分比)，溶菌酶20mg/ml，核糖核酸酶0.5mg/ml。做每個樣品取50μl放入離心小管內。
DNA結合柱前處理液的配方為氯化鈉2M，氫氧化鉀0.1M，十二烷基磺酸鈉10％(重量/體積百分比)，鹽酸0.5M。做每個樣品取200μl放入結合柱中。
DNA質粒結合液的配方為鹽酸胍2.5M，氯化鈉3mM，嗎啉代乙烷磺酸50mM，異丙醇100％(體積)，四者體積比例40∶40∶10∶10。做每個樣品取300μl放入結合柱中。
清洗液的配方為三氨基甲烷鹽酸10mM，加入無水乙醇80％(體積)。做每個樣品取600μl放入結合柱中。
洗脫液為pH8.5濃度10mM的氨基甲烷鹽酸。每個樣品取量為35μl。
使用本試劑盒，進行質粒抽提純化的步驟如下(1)將50μl裂解溶液加入500μl(OD600＞2)大腸桿菌DH5α培養液，混合，放置60秒鐘，同時進行第二步；(2)將200μl前處理溶液加入DNA結合柱中，12000轉離心10秒，棄除溶液；(3)將300μl結合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管10次，混合，加入已經處理過的DNA結合柱之中，12000轉離心10秒；(4)加入清洗溶液600μl，12000轉離心10秒，棄除離心液，再離心60秒鐘；(5)加入35μl洗脫液于結合柱中心，12000轉離心30秒，即得到高純度質粒DNA。
經使用分光光度計對抽提純化所得質粒DNA進行檢測，A260/A280值為2.0。
實施例3裂解液的配方為葡萄糖1M，三氨基甲烷鹽酸1M，乙二胺四乙酸500mM，碳酸氫鈉500mM，曲拉通50％(體積/體積)，十二烷基磺酸鈉25％(重量/體積)，溶菌酶1mg/ml，核糖核酸酶50mg/ml。做每個樣品取40μl放入離心小管內。
DNA結合柱前處理液的配方為氯化鋰5M，氫氧化鉀2M，十二烷基磺酸鈉20％(重量/體積)，鹽酸2.5M。做每個樣品取150μl放入結合柱內。
DNA質粒結合液的配方為鹽酸胍1M，氯化鈉10mM，嗎啉代乙烷磺酸10mM，異丙醇，四者體積比例為40∶40∶10∶10。做每個樣品取250μl放入結合柱內。
清洗液的配方比為三氨基甲烷鹽酸50mM，再加入乙醇85％(體積)。做每個樣品取500μl放入結合柱內。
洗脫液為純凈水。每個樣品取量為30μl。
使用本試劑盒，進行質粒抽提純化的步驟如下(1)將40μl裂解溶液加入300μl(OD600＞2)XL1-Blue培養液，混合放置40秒鐘，同時進行第二步。
(2)將150μl前處理溶液加入DNA結合柱中，10000轉離心8秒，棄除溶液。
(3)將250μl結合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管8次，混合，加入已經處理過的DNA結合柱之中，離心10秒(10000轉)。
(4)加入清洗溶液500μl，10000轉離心8秒，棄除離心液，再離心50秒鐘。
(5)加入30μl純凈水于結合柱中心，10000轉離心20秒，即得到高純度質粒DNA。
經使用分光光度計對抽提純化所得質粒DNA進行檢測，A260/A280值為1.8。
上述實施例中所使用的DNA結合柱為長沙安比奧生物技術有限公司生產的Miniprep DNA結合柱。
權利要求
1.一種質粒抽提純化試劑盒，其特征在于，至少包括下列四種獨立存在的液體菌體裂解液，DNA結合柱前處理液，DNA質粒結合液，清洗液；所述菌體裂解液配方葡萄糖10mM-1M，三氨基甲烷鹽酸20mM-1M，乙二胺四乙酸10mM-500mM，碳酸氫鈉100mM-500mM，曲拉通1％-50％(體積/體積)，十二烷基磺酸鈉1％-25％(重量/體積)，溶菌酶2mg/ml-1000mg/ml，核糖核酸酶5-50mg/ml；所述DNA結合柱前處理液配方氯化鋰或氯化鈉10mM-5M，氫氧化鉀或氫氧化鈉100mM-2M，十二烷基磺酸鈉5％-20％(重量/體積)，鹽酸0.01M-2.5M；所述DNA質粒結合液的配方鹽酸胍1M-6M，氯化鈉10mM-100mM，嗎啉代乙烷磺酸10mM-100mM，異丙醇；四者體積配比40∶40∶10∶10所述清洗液配方三氨基甲烷鹽酸1-50mM，再加入乙醇70-85％(體積)。
2.據權利要求1所述的質粒抽提純化試劑盒，其特征在于，還配置有洗脫液，所述洗脫液為pH7.5-8.5濃度8-12mM的三氨基甲烷鹽酸。
3.一種質粒抽提純化方法，其特征在于，包括以下步驟裂解菌體將40-100μl裂解溶液加入300-1000μl(OD600＞2)培養菌液，混合放置40-80秒鐘；前處理DNA結合柱將150-300μl DNA結合柱前處理溶液加入DNA結合柱中，以10000-15000轉離心8-20秒，棄除溶液；結合質粒DNA將200-400μl DNA質粒結合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管8-12次，混合，加入已經處理過的DNA結合柱之中，以10000-15000轉離心10-30秒；清洗加入清洗溶液700-900μl，以10000-15000轉離心8-20秒，棄除離心液，再離心50-80秒鐘；洗脫加入30-40μl洗脫液于DNA結合柱中心，以10000-15000轉離心20-40秒，即可得到高純度質粒DNA。
4.根據權利要求1所述的質粒抽提純化方法，其特征在于包括以下步驟裂解菌體將50μl裂解溶液加入500μl(OD600＞2)培養菌液，混合放置60秒鐘；前處理DNA結合柱將200μl DNA結合柱前處理溶液加入DNA結合柱中，以12000轉離心10秒，棄除溶液；結合質粒DNA將300μl DNA質粒結合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒離心小管10次，混合，加入已經處理過的DNA結合柱之中，以12000轉離心20秒；清洗加入清洗溶液780μl，以12000轉離心10秒，棄除離心液，再離心60秒鐘。洗脫加入35μl洗脫液于DNA結合柱中心，以12000離心30秒。
全文摘要
本發明公開了一種快速質粒抽提純化試劑盒及進行細菌質粒抽提純化的方法，其試劑盒包括下列獨立存在的液體無堿含酶菌體裂解液，DNA結合柱前處理液，DNA質粒結合液，清洗液，洗脫液。使用本試劑盒進行細菌質粒抽提純化的方法包括如下步驟裂解菌體；前處理DNA結合柱；結合質粒DNA；清洗；洗脫。使用本發明試劑盒及質粒抽提純化方法，可在3－5分鐘內快速有效地完成質粒抽提純化工作，大大縮短抽提時間；所得到的質粒DNA，經使用分光光度計檢測，A
文檔編號C12N15/63GK1654660SQ20041004713
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月31日 優先權日2004年12月31日
發明者李樂攻, 李東屏, 黃詠 申請人:李樂攻, 李東屏, 黃詠