專利名稱：一種從細菌中分離純化大質粒的方法
技術領域：
一種從細菌中分離純化大質粒的方法，屬于生物化學與分子生物學技術領域。可用于細菌大質粒的提取和鑒定。
背景技術：
質粒是染色體外可以進行自我復制的遺傳元件，大小范圍從11Λ至2001Λ以上不等，廣泛存在于各類生物體的細胞中，尤其在細菌中更為常見，編碼細菌生存非必須的某些生物學性狀，如性菌毛、細菌素、毒素和耐藥性等，一般不整合到細菌染色體上。現在常用的質粒大多數是經過改造或人工構建的，常含抗生素抗性基因，是分子生物學重組DNA技術中重要的工具。分離提取細菌中的質粒是研究和改造質粒的第一步，對于大小在101Λ以內的小質粒通常采用堿裂解法提取質粒DNA，其基本原理為當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子由于較小能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；染色體DNA由于較大不容易復性而與蛋白質一起呈絮狀，離心時可沉淀下來。因此對于細菌中的大質粒，由于其大小和染色體相比差別沒有小質粒那么大，所以傳統的堿裂解法用于提取細菌中的大質粒并不奏效。

發明內容
為了克服傳統的堿裂解法不能用于提取細菌大質粒的不足，本發明提供了一種簡單實用的從細菌中分離純化大質粒的方法。該方法利用脈沖場凝膠電泳技術結合膠回收法能有效的提取細菌中的大質粒DNA。本發明所采用的技術方案是
(1)培養細菌挑取單個菌落接種于細1 LB液體培養基，37°C振蕩(250rpm)過夜培養后離心(4000rpm, IOmin, 4°C)，收集菌體。(2)制作膠塊用 PIV 緩沖液(IOmM Tris, IM NaCl, PH7. 6)洗滌后，取 Iml PIV 緩沖液重懸細菌，與Iml 2%的低熔點瓊脂糖凝膠混勻(溫度保持在50°C)，灌入膠塊澆制槽中制作細菌膠塊。(3)消化蛋白將膠塊放入新鮮溶菌液Lysis buffer (6mM Tris，0. IM EDTA， IM NaCl,0. 5% Brij-58,0. 2%脫氧膽酸鈉，0· 5% SDS, RNaseA 20μ g/ml，溶菌酶 lmg/ml) 中37°C輕搖過夜，ES緩沖液(0. 5M EDTA ,1% SDS)洗滌模塊后用ESP緩沖液(含蛋白酶 KlOO μ g/ml的ES) 50°C過夜消化已去除蛋白質。(4)電泳分離用 TE 緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, PH8. 0)洗滌上述經 ESP 緩沖液消化過夜的膠塊，最后膠塊上脈沖場凝膠電泳儀進行電泳，電泳條件為電壓6V/ cm，角度120°，起始轉換時間范圍l_10s，最后轉換時間范圍為20_60s，電泳時間范圍為 6-24h,電泳液緩沖液為0. 5XTBE，溫度保持在14°C。電泳后經EB染色以觀察大質粒和染色體的分離情況。(5)切膠回收①用手術刀切取含目的大質粒DNA的瓊脂糖凝膠塊并稱重，先加入3倍膠重的溶膠液 QXl，再加入2倍膠重的雙蒸水。②振蕩30秒使QIAEX II顆粒重懸。如果膠塊中的DNA總量不超過2 μ g，則向樣品溶膠液中加入10μ 1的QIAEX II顆粒，然后50°C保溫lOmin，每兩分鐘振蕩一次使顆粒重懸，讓膠塊充分熔化釋放出DNA結合到QIAEX II顆粒上。此時混合物的顏色應為黃色，如果是橙色或紫色的話，應加入PH 5.0 3M的乙酸鈉溶液調節其顏色至黃色，同時再繼續保溫至少5min。③13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之。④加入QXl緩沖液500 μ 1，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地
吸取上清，棄之。此步以洗去殘留的凝膠。⑤加入500μ 1 緩沖液 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ΡΗ8. 0)，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之。此步以洗去殘留的鹽分。⑥室溫干燥10-15分鐘，直到顆粒變白，加入pH 8.5 IOmM Tris-HCl緩沖液 20μ1以溶解大質粒DNA，取2μ1進行普通瓊脂糖凝膠電泳以鑒定所提取的質粒DNA的純度，其余于_20°C保存備用。本發明的有益效果本發明利用脈沖場凝膠電泳技術結合膠回收法能有效的分離純化細菌中的大質粒DNA，克服了傳統的堿裂解法不能用于提取細菌大質粒的弊端。本發明彌補了傳統堿裂解法在提取細菌質粒上的不足，實現了細菌中大質粒的有效提取。對研究細菌中大質粒的生物學特性和功能，以及改造和開發利用細菌中的大質粒，都具有極其重要的作用。


圖1.脈沖場凝膠電泳分離傷寒沙門菌GIFU10007大質粒pBSSBl的電泳圖譜； 圖2.從傷寒沙門菌GIFU10007中提取的大質粒pBSSBl的電泳鑒定圖。
具體實施例方式下述實施例中所涉及的線性質粒pBSSBl (Baker S, Hardy J, Sanderson KE, Quail Μ, Goodhead I， Kingsley RA, Parkhill J, Stocker B, Dougan G (2007) A novel linear plasmid mediates flagellar variation in Salmonella Typhi. PLoS Pathog 3: e59.)、傷寒沙門菌GIFU10007(Zhang H, Sheng X，Xu S et al (2009) Global transcriptional response of Salmonella enterica serovar Typhi to anti-z66 antiserum. FEMS Microbiol Lett四8:51-55)保存于江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院檢驗醫學研究所。實施例以分離純化傷寒沙門菌一線性質粒pBSSBl (27kb)為例說明 具體過程為
(1)培養細菌挑取傷寒沙門菌GIFU10007 (S. Typhi)的單個菌落接種于細1 LB液體培養基中，37°C振蕩(250rpm)過夜培養后離心(4000rpm，lOmin, 4°C)，收集菌體。(2)制作膠塊用 PIV 緩沖液(IOmM Tris, IM NaCl, PH7. 6)洗滌后，取 Iml PIV 緩沖液重懸細菌，與Iml 2%的低熔點瓊脂糖凝膠混勻(溫度保持在50°C)，灌入膠塊澆制槽中制作傷寒沙門菌膠塊。(3)消化蛋白將傷寒沙門菌膠塊放入新鮮溶菌液Lysis buffer (6mM Tris, 0. IM EDTA , IM NaCl，0. 5% Brij_58，0. 2%脫氧膽酸鈉，0· 5% SDS，RNaseA 20yg/ml，溶菌酶lmg/ml)中37°C輕搖過夜，ES緩沖液(0. 5M EDTA ,1% SDS)洗滌模塊后用ESP緩沖液 (含蛋白酶1(10(^8/1111的ES) 50°C過夜消化已去除蛋白質。(4)電泳分離用TE緩沖液洗滌上述經ESP緩沖液消化過夜的膠塊，最后膠塊上脈沖場凝膠電泳儀進行電泳，電泳條件為電壓6V/cm，角度120°，起始轉換時間ls，最后轉換時間35s，電泳時間18h，電泳液緩沖液為0. 5XTBE，溫度保持在14°C。電泳后經EB染色， 大質粒和染色體的分離情況如圖1所示，成功將傷寒沙門菌中的271Λ線性大質粒pBSSBl 和細菌染色體實現了分離。(5)切膠回收
①用手術刀切取圖1中的大質粒PBSSBl的瓊脂糖凝膠塊并稱重得200mg，先加入 600mg的溶膠液QXl，再加入400mg的雙蒸水。②振蕩30秒使QIAEX II顆粒重懸，隨即向樣品溶膠液中加入10 μ 1的QIAEX II顆粒，然后50°C保溫lOmin，每兩分鐘振蕩一次使顆粒重懸，讓膠塊充分熔化釋放出DNA結合到QIAEX II顆粒上，此時混合物的顏色為黃色。③13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之。④加入QXl緩沖液500 μ 1，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地
吸取上清，棄之。此步以洗去殘留的凝膠。⑤加入500μ 1 緩沖液 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ΡΗ8. 0)，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之。此步以洗去殘留的鹽分。⑥室溫干燥10分鐘，顆粒變白，然后加入pH 8.5 IOmM Tris-HCl緩沖液20μ1溶解大質粒PBSSB1，取2μ1進行普通瓊脂糖凝膠電泳，其余于-20°C保存備用。如圖2所示， 本實施例成功提取了高純度的大小為27 kb的線性大質粒pBSSBl。最后，需要指出的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以通過改變脈沖電泳的條件以分離純化細菌中各種大小不同的大質粒。 依據本發明的構想對上述實施方式進行的各種有效的變形，均應認為在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1. 一種從細菌中分離純化大質粒的方法，其特征在于步驟為(1)培養細菌挑取單個菌落接種于細1LB液體培養基，37°C振蕩過夜培養后離心，收集菌體；(2)制作膠塊用PIV緩沖液(IOmMTris, IM NaCl, PH7. 6)洗滌后，取Iml PIV緩沖液重懸細菌，與Iml 2%的低熔點瓊脂糖凝膠混勻，溫度保持在50°C，灌入膠塊澆制槽中制作細菌膠塊；(3)消化蛋白將膠塊放入新鮮溶菌液Lysisbuffer中37°C輕搖過夜，ES緩沖液洗滌模塊后用ESP緩沖液50°C過夜消化已去除蛋白質；所述Lysis buffer的成分為6mM Tris, 0. IM EDTA，IM NaCl，0. 5% Brij_58，0. 2%脫氧膽酸鈉，0. 5% SDS，RNaseA 20yg/ml，溶菌酶lmg/ml ；所述ESP緩沖液是含蛋白酶KlOO μ g/ml的ES緩沖液；(4)電泳分離用TE緩沖液充分洗滌上述經ESP緩沖液消化過夜的膠塊，最后膠塊上脈沖場凝膠電泳儀進行電泳，電泳條件為電壓6V/cm，角度120°，起始轉換時間范圍 Ι-lOs，最后轉換時間范圍為20-60s，電泳時間范圍為6-Mh，電泳液緩沖液為0. 5XTBEJj^ 度保持在14°C ；電泳后經EB染色以觀察大質粒和染色體的分離情況；(5)切膠回收:①用手術刀切取含目的大質粒DNA的瓊脂糖凝膠塊并稱重，先加入3倍膠重的溶膠液 QXl，再加入2倍膠重的雙蒸水；②振蕩30秒使QIAEXII顆粒重懸，如果膠塊中的DNA總量不超過2 μ g，則向樣品溶膠液中加入10μ 1的QIAEX II顆粒，然后50°C保溫lOmin，每兩分鐘振蕩一次使顆粒重懸，讓膠塊充分熔化釋放出DNA結合到QIAEX II顆粒上；此時混合物的顏色應為黃色，如果是橙色或紫色的話，應加入PH 5.0 3M的乙酸鈉溶液調節其顏色至黃色，同時再繼續保溫至少 5min ；③13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之；④加入QXl緩沖液500μ 1，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之，此步以洗去殘留的凝膠；⑤加入500μ 1緩沖液ΤΕ，振蕩重懸顆粒，洗滌顆粒，13000rpm離心30秒，小心地吸取上清，棄之，此步以洗去殘留的鹽分；⑥室溫干燥10-15分鐘，直到顆粒變白，加入pH8.5 IOmM Tris-HCl緩沖液20 μ 1以溶解大質粒DNA，取2 μ 1進行普通瓊脂糖凝膠電泳以鑒定所提取的質粒DNA的純度，其余于-20°C保存備用。
全文摘要
一種從細菌中分離純化大質粒的方法，屬于生物化學與分子生物學技術領域。本發明首先將細菌包埋在低熔點瓊脂糖凝膠中，然后在膠內用溶菌酶對細菌進行破菌，用蛋白酶消化膠內細菌的蛋白，再利用脈沖場凝膠電泳對細菌的DNA進行分離，最后通過膠回收獲得細菌中的大質粒DNA。通過本發明分離純化獲得的大質粒DNA具有純度高、結構完整等特點。本發明對于研究細菌中大質粒的生物學特性和功能，以及改造和開發利用細菌中的大質粒，都具有極其重要的作用。
文檔編號C12N15/10GK102533730SQ20121000677
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者倪斌, 張海方, 徐順高, 杜鴻, 生秀梅, 許化溪, 黃新祥 申請人:江蘇大學