專利名稱：利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉入受體細胞的方法
技術領域：
本發明涉及利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉入受體細胞的方法。屬于植物細胞工程領域。
背景技術：
藏醫藥是中華民族藏文化的傳統瑰寶，具有幾千年的研究歷史，一些青藏高原上特有的藏藥植物因其藥效顯著而倍受國內外重視。
生物技術是一門應用生物研究成果以工程手段增加數量和質量，從而滿足人類日益增長的對生物制品需求的技術。30年來，已在許多領域取得了巨大的進展，但在傳統藥材中的應用才剛剛起步，迄今為止，我國主要開展了以下方面的研究1、體外培養和試管繁殖 目前已有100多種藥用植物經離體培養獲得試管植株，其中苦丁菜、蘆薈、懷地黃、枸杞、金線蓮等已用于栽培種植。
2、液體培養和大規模生產 我國已經建立了三七、人參、西洋參、三尖杉、紫草、洋地黃、長春花、丹參、紅豆杉等十幾種藥用植物的液體培養系統，經過對培養基和培養條件的操作已使有效成分達到或超過原植株，例如，紅豆杉的培養細胞加倍時間能達到3.5-5.6天，紫杉醇產量達到細胞干重的0.2％和0.3％，分別比樹皮紫杉醇含增加11.8倍和17.6倍；日本紅豆杉(Taxus cuspidata)21升規模培養，在培養27天后分別獲得3mg/L的紫杉醇。在這些研究中細胞系的選擇仍然是主要條件。目前，利用植物細胞培養技術生產次生代謝物實現商品性工業化生產的還為數甚少。
3、基因工程研究 近年來，次生代謝產物合成的關鍵酶基因的調控研究非常引人注目，因為中藥有效成分的絕大多數都來源于次生代謝產物，所以進行次生代謝的基因工程，提高中藥材有效成分含量，對于緩解中藥材的資源壓力十分有利。目前，Croteau實驗室相繼克隆了紫杉醇生物合成中幾種酶的cDNA，如taxadiene合成酶，毛牛兒毛牛兒二磷酸合成酶和taxa-4(20)，11(12)-dien-5α-ol-0-乙酰轉移酶。其中乙酰轉移酶cDNA和taxadiene合成酶cDNA在酵母菌(Escherichia coii)中表達。但是編碼其生物合成途徑中各個反應的酶蛋白的基因還未完全克隆，利用微生物轉化中間產物成最終產物紫杉醇仍存在較大的的局限性。另外，隨著基因工程的發展，出現了許多新的培養技術，主要有毛狀根培養，即在80年代末期將發根培養技術應用在生產次生代謝產物上，利用發根農桿菌Ri質粒轉移，轉化后的表現型是毛狀根，以產生植物有效物質。目前，已有30多種植物的毛狀根培養獲得初步成功。Yochikawa等通過誘導人參的原生質體獲得轉化的毛狀根，其生長速度為使用外源激素誘導根的2倍以上。Flores等報道，他們建立的20多個埃及天仙子毛狀根無性系都比正常根生長快得多，而且其產生的托品生物堿含量達到正常根培養水平。1997年黃遵錫從短葉紅豆杉誘導出毛狀根，選育出的5個無性系在20天后生物量平均增加約9倍，是同等條件下愈傷組織液體懸浮培養的生物增量的2.9倍；毛狀根中的紫杉醇(taxol)含量為每千克干重含0.128毫克，是愈傷組織的1.3-8.0倍。同時毛狀根也能向培養液中分泌0.01-0.03mg/L的紫杉醇，但是，目前對于絕大多數次生代謝途徑未知的中藥材基因工程仍未開展，利用毛狀根培養來實現中藥材產業化生產還有較大的困難。
上述的各種方法的研究表明，一些中藥材易于誘導培養可利用細胞、組織培養及毛狀根培養獲得有高含量次生代謝物的細胞系及毛狀根，但對于那些在體外培養難以形成快速生產細胞系的中草藥，尤其是藏藥材，上述方法并不適用，因此，急需探索簡便、快速生產藥用次生代謝產物的新方法。
4、植物體細胞雜交，又稱原生質體融合，可以克服遠緣有性雜交不親和性，將異源遺傳物質轉入受體。其優越性表現在可同時轉移多個目的基因；并使雙親細胞核及胞質基因在雜種細胞中共存。已被成功地用于轉移遠緣不親和種、屬的有用基因。80年代興起的不對稱體細胞雜交方法，通過用χ、γ-射線處理供體，使雜種中供體染色體片段化和消減，實現微量核物質轉移，結果產生了大量的不對稱雜種。本實驗室在國際上首先將紫外線應用于植物的不對稱體細胞雜交，發現紫外線可引起供體染色體片段化和消減，使少量染色體片段或DNA片段進入受體。在我們之后，國外將紫外線用于其它植物體細胞雜交轉移染色體小片段，將目標性狀轉入受體的例證逐漸增加。
將紫外線照射供體的不對稱融合用于藥用植物的體細胞雜交中，可以獲得了大量轉移部分供體基因組的雜種，并且可提高有效藥用成分，因此，利用體細胞雜交可將決定藥用植物有效成分的基因在不同科、屬、種間相互轉移，再生出含有高含量藥效成分基因的體細胞雜種，實現在易于快繁的植物細胞中生產有效藥用成分，可解決瀕危緊缺中藥材料的資源壓力，使中藥應用進入持續發展的階段。但是，現有其它生物技術在實現這一目的上還存在諸多不足。
高寒藏藥材是中華醫藥的瑰寶之一，有極大的開發利用價值。然而，一些重要的資源受其特殊生長環境的限制，不能滿足開發和生產的需求，急需進行生物技術快繁的研究。諸如高寒藏藥材川西獐牙菜(Swertia musstii Franch)系龍膽科(Gentianaceae)、獐牙菜屬(Swertia)，為青藏高原特有種，分布于西藏、青海海拔3800-5000米的高寒地區，為藏族民間常用的一種草藥，稱“藏茵陳”。一年生草本，全草入藥，專治黃膽性肝炎及病毒性肝炎，開發出的“急肝寧”、“乙肝寧”和“藏茵陳膠囊”是治療肝中毒、肝炎的最佳藥物之一。主要有效成分為齊墩果酸(Oleanolic)及其衍生物、芒果甙(Mangiferin)、獐牙菜苦甙、黃酮類化合物、當藥黃素和多種口山酮化合物。
四數獐牙菜(Swertia tetraptera Maxim)系龍膽科(Gentianaceae)、獐牙菜屬(Swertia)，稱“藏茵陳”。在青海省生于海拔2200～3600m的高寒地區，一年生草本，全草入藥，有清熱解毒，舒肝利膽之功效，可用于治療黃膽型肝炎，病毒型肝炎。
管花秦艽(Gentiana siphonantha Maxim)為龍膽科、龍膽屬植物。生于海拔2500-4500米的高山、草地、灘地。多年生草本，根入藥，祛風除濕，退虛熱；主治風濕關節痛、結核病潮熱、黃疸。其主要有效成分為秦艽堿甲、秦艽堿乙及秦艽堿丙。
白花假龍膽(Gentianella albifpra Ma)系龍膽科(Gentianaceae)植物，在青海省生于海拔2200～3600m的高寒地區，一年生草本，全草入藥，有清熱解毒，舒肝利膽之功效，與同科植物川西獐牙萊(Swertia mussotii Franch)及抱莖獐牙萊(Swertia franchetiana H.Smith)同等入藥。可用于治療黃膽型肝炎，病毒型肝炎。
濕生扁蕾(Gentianopsis paludosa(Hook.f.)Ma.)，生于海拔2500-4500米的灌叢中、山坡濕地。全草入藥，清熱解毒，可治療急性黃疸性肝炎、結膜炎、高血壓、急性腎盂腎炎、瘡癤腫毒、感冒及小兒腹瀉。主要有效成分為齊墩果酸(Oleanolic)及其衍生物、芒果甙(Mangiferin)、獐牙菜苦甙、黃酮類化合物。
目前，由于上述地道藏藥材野生資源非常匱乏，不能滿足醫藥生產及外貿出口的需要，主要是采用同屬其它植物為代用品進行混制，不但會影響療效，而且不利于外貿出口。對它們的組培及細胞培養研究表明，它們建立快速繁殖系很困難，因此，只能選擇它們作體細胞雜交的供體，以期將有效成分轉入到快速生長的受體細胞系中，實現在易于快繁的植物細胞中生產有效藥用成分。
狹葉柴胡屬于傘形科(Umbelliferae)、柴胡屬(Bupleurum)，具退熱解毒、舒肝解郁等作用，有效成分主要為柴胡皂甙a、b、d，是治療感冒、瘧疾等癥的常用藥材。目前，已篩選出快速生長、遺傳穩定的細胞系，繼代培養10年，染色體數目仍保持穩定，已經成為體細胞雜交的良好受體。
胡蘿卜為傘形科(Umbelliferae)的常用蔬菜，是進行細胞培養的模式植物，實驗室也已篩選出胡蘿卜快速生長的細胞系，可作為體細胞雜交受體。
馬鈴薯，屬于茄科(Solanaceae)、茄屬(Solanum)，是一種常用蔬菜及工業原料，其生物產量高，適應性廣泛。由于其易于組織培養，通過其再生植株的塊莖無性繁殖，可以產生遺傳穩定的快速繁殖體，亦可作為體細胞雜交受體。
總之，上述植物已成為離體培養及體細胞雜交的理想材料，實驗室也已建立起其快速繁殖的愈傷組織及其高效再生體系，因此，選擇它們作為體細胞雜交的受體，將所述藥物的有效成分轉入到快速生長的受體細胞系中，以期實現在易于快繁的植物細胞中生產有效藥用成分的技術基礎正在具備。

發明內容
針對上述現有技術方法在中藥材改良中的不足，本發明要解決的問題是提供一種利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉入受體細胞的方法。該技術可將決定藥用植物有效成分的基因在不同科、屬、種間相互轉移，再生出含有高含量藥效成分基因的體細胞雜種，實現在易于快繁的植物細胞中生產有效藥用成分，可解決瀕危緊缺中藥材料的資源壓力，使中藥應用進入持續發展的階段。
本發明的利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉入受體細胞的方法，步驟由雙親材料來源；受體原生質體的游離；射線處理供體原生質體；雙親原生質體的融合與培養；雜種愈傷組織及再生植株的鑒定；體細胞雜種中目標性狀的檢測組成。
其中，涉及的關鍵步驟是①雙親材料的選擇、原生質體的游離及UV處理供體；
②雙親原生質體的融合及培養。
本發明中，植物體細胞雜交是指兩種不同細胞去掉細胞壁后進行原生質體融合，形成雜種細胞，繼而發育成雜種植株的過程。
本發明中，雙親材料基因型的選擇及誘導是指受體和供體材料，受體材料為柴胡、胡蘿卜、馬鈴薯胚性愈傷組織。供體材料分別為川西獐牙菜、四數獐牙菜麥、管花秦艽、白花假龍膽、濕生扁蕾愈傷組織；取所述供體的幼葉及未成熟種子在MS誘導培養基上誘導愈傷組織，愈傷組織在繼代培養基上繼代后，選取胚性愈傷組織作為供體。
本發明中，受體原生質體的游離方法為取繼代培養2～4天的上述受體懸浮培養物，放入酶液中，于25℃下游離3～4小時溫育后用300～400目不銹鋼網過濾，500r/min離心收集原生質體，然后用洗液洗一次后，將密度調至1×106/ml作供體，備用。供體原生質體制備的方法為取繼代第6-7天的川西獐牙菜、四數獐牙菜麥、管花秦艽、白花假龍膽、濕生扁蕾的愈傷組織，游離并收集原生質體。原生質體的游離方法同受體。收集的原生質體用洗液洗一次后，調成1×106/mL的密度鋪在直徑3.5cm的玻璃培養皿中成薄層用UV照射；紫外線照射強度為260～380μW/cm2/30s～5min；即分別照射0、30s、1min、2min、3min、5min后作為融合供體。
本發明中，雙親原生質體的融合與培養過程是將各供體分別與上述受體以1×106/ml的密度按1∶1的體積比混合均勻，用PEG法誘導融合。融合流程如下(1)原生質體滴加在直徑3.5cm的培養皿，鋪成一薄層，靜置15分鐘～20分鐘。(2)沿薄層邊緣滴加PEG溶液，靜置15分鐘～20分鐘。(3)再加二倍體積的0.225M～0.275M Ca(NO3)2液，靜置10分鐘～15分鐘。重復一次。(4)吸掉皿中液體，洗液洗兩次，每次5分鐘～10分鐘。(5)用P5液體培養基洗一次。(6)用Parafilm封口，25℃避光保濕培養。再生愈傷組織長至1.5mm～2mm時挑出，轉至MS培養基中繼代培養，每天光照12h，光強2000Lux，溫度25℃。
其中，上述所用溶液配方為酶液成分15mg/ml Cellulase Onozuka RS，3mg/ml Pectolyase Y-23，5mM MES，0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH5.8；洗液成分0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH5.8；PEG溶液的配方2g葡萄糖，1.5g Ca(NO3)2，40g分子量6000的PEG，溶解在100ml無離子水中，調pH至7.0，抽濾滅菌；Ca(NO3)2溶液的配方9g無水Ca(NO3)2+200ml無離子水，調pH至7.0，抽濾滅菌；P5培養基MS培養基的大量元素+MS培養基的微量元素+B5維生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/L MES，pH5.6--5.8；MS培養基MS培養基的大量元素+MS培養基的微量元素+MS維生素+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+30mg/L水解酪蛋白+30mg/L+7g/l蔗糖瓊脂粉，pH5.8--6.0；MS誘導培養基MS培養基+2mg/L 2，4-D；
MS繼代培養基MS培養基+2mg/L 2，4-D+0.5mg/L激動素；MS1培養基MS培養基+1mg/L 2，4-D。
在上述的利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉入受體細胞的方法中，所述的受體材料優選為柴胡原生質體，供體優選為川西獐牙菜及管花秦艽原生質體，柴胡原生質體的優選UV處理條件是在照射強度280～380μW/cm2的UV下，分別照射30s、1min、2min、3min、5min；所述的雙親原生質體融合是指柴胡分別與川西獐牙菜、管花秦艽原生質體在400g/L PEG靜置15分鐘后，加入0.275M無水Ca(NO3)2溶液6滴，靜置10分鐘；重復一次；所述的原生質體培養是指原生質體融合后再在MS1培養基中培養。
本發明中，雜種愈傷組織鑒定的方法主要為(1)染色體分析取雙親以及再生克隆愈傷組織4℃低溫下24小時，經甲醇∶冰乙酸(3∶1)固定4-24小時，壓片法制片，檢查染色體。
(2)同工酶分析對親本及再生愈傷組織進行酯酶同工酶、過氧化物同工酶和蘋果酸脫氫酶分析。制樣及染色方法參考胡能書和萬國賢。
(3)RAPD分析CTAB法提取親本、再生愈傷組織的基因組總DNA。選用隨機引物，按夏光敏等報道的方法進行PCR擴增并分析。
(4)5S rDNA間隔序列分析CTAB法分別提取和純化親本及再生愈傷組織的基因組總DNA。選用兩種引物(20mer和25mer)序列為PI5’-GAGAGTAGTACATCGATGGG-3’；PII5’-GGAGTTCTG ACGGGATCCGG-3’(20mer)PIII5’-GGATGGGTGACCTCCCGGGAAGTCC-3’；PIV5’-CGCTTAACTGCGGAGTTCTGATGGG-3’(25mer)。按周愛芬等報道的方法進行雜種與親本的核糖體5S-rDNA間隔序列分析。
(5)熒光原位雜交1.親本及再生愈傷組織用壓片法進行染色體制片。2.探針的制備采用Nick translation法，用各供體的總基因組DNA(CTAB法提取)制備探針。3.原位雜交程序參照周愛芬(2001，中國科學)的方法，略有改動。雜交前，染色體制片在70％甲酰胺中70℃處理2min，再依次用--20℃預冷的70％→95％→100％乙醇，各處理5min。每張片子加雜交液20μL，包括甲酰胺10μL，50％硫酸葡聚糖4μL，20×SSC 2μL，10％SDS0.2μL，鮭魚精DNA(10μg/μl)1μL，探針50ng、封阻中國春DNA8.0-～10μg，混勻，短暫離心，沸水中變性10min，迅速放人冰水中5-10min。每張玻片加18μl雜交液，蓋上蓋玻片，將玻片移入濕盒中，88℃變性12min，然后放入37℃恒溫箱中雜交過夜。室溫下2×SSC洗片5min后按試劑盒Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIGDetection的要求進行。4μg/ml PI染色10min，加抗褪色劑，封片。在OLYMPUS BX60熒光顯微鏡下觀察。激光波長450-490nm，Kodak 400膠片拍照。
本發明中，體細胞雜種中目標性狀(藥效成分)的檢測方法為實驗儀器為LC-10AD型高效液相色譜儀(日本島津)，SPD-10A紫外-可見檢測儀，Class-vp5.0計算機控制及處理系統，Phenomenex Luna C18反相柱(4.6×250mm，5μm，帶保護柱)，3K30型離心機(德國Sigma公司)，超聲波發生器(寧波新芝科器研究所)。
主要試劑為對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，經高效液相色譜歸一法計算，峰純度均達到99.99％。甲醇為色譜純，購自天津市四友生物醫學技術有限公司；乙醚為分析純，購自天津市廣成化學試劑有限公司；冰乙酸為分析純，購自天津市福晨化學試劑廠。
檢測實驗方法(1)獐牙菜苦甙、龍膽苦甙、芒果甙色譜條件流動相為甲醇—水—冰乙酸(25∶75∶0.04)，臨用前經超聲脫氣處理；檢測波長259nm；流速0.8ml/min；柱溫室溫；數據處理為外標法峰面積定量。
(2)齊墩果酸與熊果酸色譜條件流動相為甲醇—水—冰乙酸(85∶15∶0.04)，臨用前經超聲脫氣處理；檢測波長209nm；流速1.0ml/min；柱溫室溫；數據處理為外標法峰面積定量。
(3)標準溶液及樣品溶液的制備精密稱取獐牙菜苦甙對照品1.00mg，龍膽苦甙對照品1.20mg，芒果甙對照品0.90mg，置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度；精密稱取齊墩果酸對照品1.00mg，熊果酸對照品1.00mg，置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。標準溶液經0.45μm的濾膜濾過備用。分別取干燥恒重并研成粉末狀的藏藥材粉末約1.5g，各體細胞雜種細胞系及其雙親愈傷組織1g，將樣品粉末置具塞管中，加入25ml甲醇，超聲波振蕩處理60min，放冷，補足重量，12000轉離心10min，上清液經0.45μm的濾膜濾過備用。結果詳見附圖及實施例。
本實驗室于1998年將紫外線照射供體的不對稱融合用于藥用植物的體細胞雜交中已獲得多種組合的體細胞雜種(1)葡萄與柴胡、(2)柴胡與石防風、(3)柴胡與川西獐牙菜、(4)胡蘿卜與柴胡、(5)柴胡與管花秦艽、(6)胡蘿卜與西洋參的不對稱體細胞雜種。
本實驗室對含川西獐牙菜部分遺傳物質的柴胡雜種細胞系進行芒果甙含量的測定發現，川西獐牙菜的主要藥效成分已轉入柴胡，且含量比對照高。對胡蘿卜與西洋參雜種中人參皂甙的含量測定發現，雜種中人參皂甙比對照高1倍以上。表明供體(川西獐牙菜、西洋參)的少量遺傳物質已經轉入柴胡及胡蘿卜，此技術可轉移并且提高有效藥用成分。目前，國內外還未見有相關的研究，因此，本發明中的高寒藏藥材藥效成分向快速生長的受體細胞轉移的體細胞雜交技術是藏藥材生物技術改良的一種新方法。
本發明的有益效果本發明是利用體細胞雜交技術獲得藥效成分含量高、快速生長的細胞系，以期實現大規模工業化生產。與組織、細胞培養及基因工程方法相比，本發明的優勢在于體細胞雜交為資源匱乏、難以培養的名貴藏藥材有效成分生產提供了直接而簡便的方法，獲得的藥效成分含量高、生長快速、遺傳穩定的雜種細胞系可用于藏藥材藥效成分的工業化生產，因而在藏藥材資源的有效、快速利用上具有重要的作用，將會產生巨大的經濟效益。本發明所采用的體細胞雜交技術的優勢在于(1)可以超越常規有性雜交的局限性，使遠緣不親和的植物產生體細胞雜種，轉移中藥材的目標次生物；(2)可實現細胞核和胞質基因的轉移，產生多種多樣的，有性雜交無法實現的中藥材新類型；(3)可以轉移由多基因控制的次生代謝途徑及同時轉移多個有益性狀；(4)可以使供體中藥材的染色體以小片段漸滲到受體植物的染色體上，并能夠穩定及遺傳；(5)目標基因在植物之間轉移，因此不存在潛在的安全性問題。
本發明通過利用該技術所獲得的高含量藥效成分的雜種細胞系的特征是(1)生長快速；(2)藥效成分含量高，進一步快繁篩選，可以實現利用液體培養大規模生產有效成分的目的；(3)含有高含量藥效成分單體，具有極大的開發利用價值；(4)可為鑒定、分離及克隆藥用成分相關基因提供了基礎材料。


圖1示柴胡與川西獐牙菜原生質體融合產物；圖2示柴胡與川西獐牙菜體細胞雜種愈傷組織；圖3示柴胡與川西獐牙菜體細胞雜種克隆3染色體，2n＝19；圖4示柴胡與川西獐牙菜體細胞雜種的RPAD結果，M分子量標準，B川西獐牙菜，S柴胡，No.3，4，6，10，11，14為雜種克隆；←柴胡特征帶；→川西獐牙菜特征帶；新帶。
圖5示柴胡與川西獐牙菜體細胞雜種克隆3 GISH結果，箭頭表示川西獐牙菜染色體小片段；圖6示柴胡與管花秦艽體細胞雜種愈傷組織；圖7示柴胡與管花秦艽體細胞雜種愈傷組織脂酶同工酶結果，←柴胡特征帶；→管花秦艽特征帶；新帶。QJ管花秦艽，C柴胡，No.2，3，4，6，8雜種克隆；圖8示柴胡與管花秦艽體細胞雜種愈傷組織的RAPD結果，M分子量標準，C柴胡，Q秦艽，1-2，1-1，3，4，5，6，8雜種克隆，←柴胡特征帶；→管花秦艽特征帶；新帶；具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明實例1利用不對稱體細胞雜交向柴胡轉移川西獐牙菜的有效成分1材料與方法1.1雙親原生質體的來源 以狹葉柴胡愈傷組織建立懸浮細胞系。取繼代3天的懸浮細胞系分離制備原生質體作為受體。
用川西獐芽菜愈傷組織分離原生質體，方法同小麥。原生質體分別經260μW/cm2的紫外線照射1min、2min、3min后作融合供體。
2原生質體的融合和培養將供體與受體以1×106/ml的密度按1∶1比例混勻，用PEG法融合。
3對再生愈傷組織及再生植株進行雜種性質的鑒定包括同工酶分析；染色體分析；RAPD和GISH分析(方法及實施方案如前述)。
4川西獐牙菜藥效成分的檢測(方法實施如前所述)。
結果川西獐芽菜原生質體用強度為260μw/cm2紫外線分別照射0min、1min、2min、3min后，與柴胡原生質體在PEG誘導下融合。對融合再生的46個單細胞克隆進行雜種形態學(圖1，2)、染色體(圖3)、同功酶和RAPD(圖4)分析，結果表明，它們中有32個為體細胞雜種細胞系。染色體觀察表明，11個克隆再生的植株染色體數目均介于雙親之和。主要分布在12-18，同功酶及5SrDAN間隔序列分析，均具有雙親特征譜帶，證實它們為科間體細胞雜種GISH分析表明，雜種含1-4個川西獐牙菜染色體小片段(圖5)。對部分雜種愈傷組織藥效成分(芒果甙)含量測定結果表明(表1)，有4個克隆的芒果甙含量高于原材料川西獐芽菜，最高達0.293％。
表1 柴胡與川西獐芽菜體細胞雜種細胞系芒果甙的含量(％)

實例2利用不對稱體細胞雜交向柴胡轉移管花秦艽的有效成分方法和步驟同實施例1。
結果管花秦艽原生質體用強度為380μw/cm2紫外線分別照射0min、1min、2min、3min后，與柴胡原生質體在PEG誘導下融合。對融合再生的20個單細胞克隆進行雜種形態學(圖6)、染色體、同功酶(圖7)和RAPD(圖8)分析，結果表明，它們中有18個為體細胞雜種細胞系。染色體觀察表明(圖2)，11個克隆再生的植株染色體數目均分布范圍在11-13，同功酶及RAPD分析，均具有雙親特征譜帶，證實它們為科間體細胞雜種。對部分雜種愈傷組織藥效成分(龍膽苦甙)含量測定結果表明(表2)，有2個克隆的龍膽苦甙含量高于親本管花秦艽，最高達0.1792％。
表2 柴胡與管花秦艽體細胞雜種龍膽苦甙含量

權利要求
1.一種利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉入受體細胞的方法，步驟由雙親材料來源；受體原生質體的游離；射線處理供體原生質體；雙親原生質體的融合與培養；雜種愈傷組織及再生植株的鑒定；體細胞雜種中目標性狀的檢測組成，其特征在于①雙親材料的選擇、原生質體的游離及UV處理供體；②雙親原生質體的融合及培養；上述雙親材料的選擇是指受體和供體材料的選擇，受體材料為柴胡、胡蘿卜、馬鈴薯，供體材料為川西獐牙菜、四數獐牙菜麥、管花秦艽、白花假龍膽、濕生扁蕾，取上述供體的幼葉及未成熟種子在MS誘導培養基上誘導愈傷組織，愈傷組織在繼代培養基上繼代后，選取胚性愈傷組織作為供體；受體原生質體的游離方法是指取繼代培養2～4天的上述受體懸浮培養物，放入酶液中，于25℃下游離3～4小時溫育后用300～400目不銹鋼網過濾，500r/min離心收集原生質體，然后用洗液洗一次后，將密度調至1×106/ml作供體，備用；供體原生質體的游離方法同受體；UV照射供體是指將收集的供體原生質體用洗液洗一次后，調成1×106/mL的密度鋪在直徑3.5cm的玻璃培養皿中成薄層后用UV照射；紫外線照射強度為260～380μW/cm2/30s～5min；上述雙親原生質體的融合及培養是指將各供體分別與上述受體以1×106/ml的密度按1∶1的體積比混合均勻，用PEG法誘導融合；融合流程如下(1)原生質體滴加在直徑3.5cm的培養皿中，鋪成一薄層，靜置15分鐘～20分鐘；(2)沿薄層邊緣滴加PEG溶液，靜置15～20分鐘，(3)再加二倍體積的0.225M～0.275M Ca(NO3)2液，靜置10分鐘～15分鐘；重復一次；(4)吸掉培養皿中液體，洗液洗兩次，每次5分鐘～10分鐘；(5)用P5液體培養基洗一次；(6)用Parafilm封口，25℃避光保濕培養；再生愈傷組織長至1.5mm～2mm時挑出，轉至MS1培養基中繼代培養，每天光照12h，光強2000Lux，溫度25℃；其中，上述所用溶液配方為酶液成分15mg/ml Cellulase Onozuka RS，3mg/ml Pectolyase Y-23，5mM MES，0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH 5.8；洗液成分0.6M甘露醇，5mM CaCl3，pH 5.8；PEG溶液的配方2g葡萄糖，1.5g Ca(NO3)2，40g分子量6000的PEG，溶解在100ml無離子水中，調pH至7.0，抽濾滅菌；Ca(NO3)2溶液的配方9g無水Ca(NO3)2+200ml無離子水，調pH至7.0，抽濾滅菌；P5培養基MS培養基的大量元素+MS培養基的微量元素+B5維生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/L MES，pH5.6--5.8；MS培養基MS培養基的大量元素+MS培養基的微量元素+MS維生素+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+30mg/L水解酪蛋白+30mg/L+7g/l蔗糖瓊脂粉，pH5.8--6.0；MS誘導培養基MS培養基+2mg/L 2，4-D；MS繼代培養基MS培養基+2mg/L 2，4-D+0.5mg/L激動素；MS1培養基MS培養基+1mg/L 2，4-D。
2.如權利要求1所述的利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉入受體細胞的方法，其特征在于所述的受體材料為柴胡原生質體，供體為川西獐牙菜及管花秦艽原生質體，柴胡原生質體在照射強度280～380μW/cm2的UV下，分別照射30s、1min、2min、3min、5min；所述的雙親原生質體融合是指柴胡分別與川西獐牙菜、管花秦艽原生質體在400g/L PEG靜置15分鐘后，加入0.275M無水Ca(NO3)2溶液6滴，靜置10分鐘；重復一次；所述的原生質體培養是指原生質體融合后再在MS1培養基中培養。
全文摘要
本發明公開一種利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉入受體細胞的方法，主要步驟包括1)、雙親材料的基因型選擇；2)、受體原生質體的游離；3)、UV照射供體原生質體；4)供、受體原生質體的融合與培養；5)雜種愈傷組織及再生植株的鑒定；6)體細胞雜種中目標性狀的檢測。本發明是利用體細胞雜交技術獲得藥效成分含量高、生長快速的細胞系，其優勢在于可為資源匱乏、難以培養的名貴藏藥材有效成分生產提供直接而簡便的方法，獲得的藥效成分含量高、生長快速、遺傳穩定的雜種細胞系可用于藏藥材藥效成分的工業化生產，因而在藏藥材資源的有效、快速利用上具有重要的作用，將會產生巨大的經濟效益。
文檔編號C12N5/14GK1648246SQ20041007577
公開日2005年8月3日 申請日期2004年12月30日 優先權日2004年12月30日
發明者向鳳寧, 夏光敏, 蔡云飛, 李子東, 江莉 申請人:山東大學