專利名稱：：促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸合成的轉錄因子及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸合成的轉錄因子及其編碼基因與應用。
背景技術：
：高等植物的胚胎一般是受精作用的產物，即通過精子和卵子的結合發育而成。但在某些特殊情況下，胚胎也可以經由體細胞胚胎發生途徑產生。所謂體細胞胚胎發生是指雙倍體的體細胞在未經性細胞融合的情況下，模擬有性合子胚胎發生的各個階段而發育形成一個新的個體的形態發生過程。從理論上講，任何一個植物細胞都有發育成完整生物個體的潛在能力，但細胞要表達全能性必須首先回復到分生狀態或胚性細胞狀態，而具有這種回復能力的外植體受到基因型、生長期、生理狀態和培養基的條件環境等多種因素的影響。其中物種或基因型是決定體細胞胚胎發生能力的首要因素(KiellyandBowley1992;Crea，Belluccietal.1995)。擬南芥作為一種典型的模式植物，具有生長周期短、個體形態小、基因組小、容易轉化等特點，在植物分子生物學研究中已經成為非常重要的工具(Meyerowitz1989;G印steinandHorwitz1995;Kunkel1996)。雖然具有以上優點，但由于基因型的原因，擬南芥體細胞胚胎再生非常困難。1992年，Wu等首先利用擬南芥未成熟胚胎作為外植體培養出體細胞胚胎(Wu，Haberlandetal.1992)。此后，人們相繼從擬南芥原生質體等誘導出體細胞胚胎(LuoandKoop1997)。但利用上述方法培養體細胞胚胎，不但步驟繁瑣，費時費力，而且很難獲得足夠的胚胎用于科學研究。Zuo等認為擬南芥營養器官難于培養出體細胞胚胎，是因為僅外源激素不能激活由體細胞向胚性細胞轉變的關鍵調控因子(Zuo，Niuetal.2002)。因此，在適當外源激素的調控下，這些基因的功能獲得性突變體的細胞命運就可能向胚性細胞轉變?；谠撛O想，Zuo等(Zuo，Niuetal.2002)篩選到一個功能獲得性突變體p《a^;^a6根外植體在無外源激素的情況下，能夠以很高的頻率再生出體細胞胚，這些體細胞胚在誘導培養基上能夠直接萌發，并能長成具有育性的成體(Zuo,Niuetal.2002)。尸^^基因編碼一個轉錄因子，與先前報道的/f〃5"是等位基因(Mayer,Schoofetal.1998)。Gallois等人的研究驗證了這一結果，他們利用熱激誘導表達的方法讓/ftt異位表達，發現在轉基因植株中，在異位形成的分生組織中分別有葉狀器官和胚胎的產生(Gallois,Noraetal.2004)。此外，他們還發現在缺乏生長素時，^/5"的過量表達可以引起擬南芥根中胚胎標志基因^6Z75、凡/5^和^K7的表達，但表達水平很低；而當有生長素存在時這些基因的表達水平明顯增強，并且所有表達^KS"的根都分化出胚胎而不再有葉狀器官形成(Gallois，Noraetal.2004)。除了/^5"以外，還有許多轉錄因子參與植物胚性細胞命運的決定，這些轉錄因子的異位表達也能促進體細胞胚胎發生。擬南芥Jec突變體胚胎發育嚴重缺陷，子葉特化具有了真葉的特征。Z^67編碼一個CCAAT轉錄因子的HAP3亞基，可能結合在CCAAT順勢元件上，從而調控基因的表達(Lotan，0htoetal.1998;Lee，Fischeretal.2003)。Z^T2編碼VP1/ABI3-likeB3家族轉錄因子(Stone,Kwongetal.2001)。異位表達這兩個基因都可以促進體細胞向胚性細胞的轉變(Lotan，0htoetal.1998;Stone，Kwongetal.2001)。擬南芥/YOZ￡(尸AZ)基因也是調控體細胞胚胎發生的一個重要調控因子。但與上面介紹的基因不同，尸AX在體細胞胚胎發生過程中起負調控作用。/^7突變體的苗中均表達了一些胚胎的特征，尤其是它的主根因積累了大量與種子中類似的儲藏蛋白和中性脂肪酸而使根部膨大變粗并呈綠色狀，因此被稱為"pickleroots"(Ogas，Chengetal.1997;Rider,Heiranetal.2004)。并且突變體的根外植體在不添加外源激素的培養基上能夠再生出體細胞胚(Ogas，Chengetal.1997;0gas，Kaufmannetal.1999)。這說明，；^J突變體細胞部分喪失了從胚胎發育向苗期生長轉變的能力。在pA7突變體中，胚胎特異基因^t7、Z^6^和尺/5"J的表達明顯提高，尤其是在"pickleroots"中，它們的表達水平提高了上百倍(0gas，Kaufmannetal.1999;DeanRider，Hendersonetal.2003;Rider，Hemmetal.2004)。以上實驗表明尸AZ是^T類基因的負調節因子，萌發后它通過抑制ZfC基因的表達來抑制細胞的胚性特征。最近，Mantiri等對苜蓿胚性愈傷基因轉錄譜的分析表明，在胚性愈傷中乙烯合成和相應基因都明顯上調(Mantiri，Kurdyukovetal.2008)。其中，5"6)細77Cfiffi/州jfiL47^"/^CT朋JQ/f5^y,力基因上調近2倍。MtSERFl是AP2/EREBP家族轉錄因子的一員，該家族的轉錄因子大多與脅迫反應有關。在球形胚時期，該基因在整個胚胎中都表達；而在心型胚時期，僅在莖頂端組織的一小塊細胞中表達(Mantiri，Kurdyukovetal.2008)。i^6^y」W基因不僅參與了合子胚胚胎發生，而且在體細胞胚胎發生過程中也起著重要作用。利用RNAi技術將該基因Knock-down后，轉基因苜蓿體細胞胚胎發生頻率僅為對照的10%左右(Mantiri，Kurdyukovetal.2008)。該研究為脅迫(乙烯)促進體細胞胚胎發生提供了分子水平的證據。除了上述基因之外，人們利用反向遺傳學的方法也篩選到一些基因，這些基因也能夠促進體細胞向胚性細胞的轉變。1997年，Schmidt及其同事先在胡蘿卜下胚軸胚性細胞培養物中分離出的一段cDNA克隆也編碼一種類受體蛋白激酶，由于它首先在體胚發生過程的胚性單細胞中表達，因此命名為體細胞胚胎發生相關類受體蛋白激酶(5"6鵬77C^ffi/JW^V^5751A^G5F7朋-ZiT^U朋5^,5^7A)基因(Schmidt,Guzzoetal.1997)。研究表明，"c5KJ及其擬南芥同源基因Jt5S&f可標記有胚胎發生能力的細胞，并且這些基因的表達可以促進體細胞向胚性細胞的轉變(Hecht，Vielle-Calzadaetal.2001)。除此之外，^45Fj5^6^0^必和^^4M〃5"-hie"ffi/》基因的異位表達也能促進體細胞胚胎的發生。除此之外，還有很多基因特異地在體細胞胚胎中表達(Imin，Nizamidinetal.2005;Marsoni，Bracaleetal.2008)，但它們在體細胞胚胎發生過程中的作用還不清楚。綜上所述，植物的胚胎發生過程是一個復雜而有序的過程，這個過程受到多種基因的協同作用。通過對調控體細胞胚胎發生的關鍵因子進行遺傳操作，促進體細胞胚胎發生是一條行之有效的途徑。植物中脂肪酸又被稱為植物油，它廣泛存在于植物的種子中。植物油用途廣泛，運用生物技術來改良植物體內脂肪酸的組分和含量具有重要經濟價值?；蚬こ谭椒ㄋx用的操作基因必需依賴于對植物體內脂肪酸生物合成過程的分子調控機制的了解的基礎之上。但目前人們對此卻了解很少，因此通過基因工程的方法來提高油料作物中含油量的工作目前進展緩慢。在植物中，轉錄因子按照其DNA結合域的相似性可以分為幾個家族，MYB轉錄因子家族是其中最大的家族之一。MYB轉錄因子蛋白的N端具有保守的MYB-DNA結合域；這些DNA結合域是由一個到三個大約50個氨基酸殘基的螺旋-轉角-螺旋不完全重復結構構成，按照這些不完全重復結構又可以分為MYB1R，MYBR2R3和MYB3R。模式植物擬南芥的MYB因子(AtMYB)參與調控了植物的多種生理活動過程，包括植物發育，細胞命運和細胞特征決定，對環境因子和植物激素的反應，非生物脅迫，病原菌侵染抗性以及植物次生代謝物合成等信號轉導過程(Ralf,S等，2001，Curr0pinPlantBiol4:447-456)。AtMYB轉錄因子大部分都是R2R3型的MYB因子。目前研究比較清楚的R2R3型MYB因子多參與了植物次生物代謝調控，如^J/^么」fi/^Z57/^尸厶^#份卯//^尸么"M^^/7T么除此之外，力^/IS^A477i7參與了色氨酸的合成調控。然而大部分的已經預測到的AtMYB轉錄因子功能或者他們參與的信號轉動途徑未知。
發明內容本發明的目的是提供促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸合成的轉錄因子及其編碼基因與應用。本發明所提供的促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸合成相關的轉錄因子，命名為AtMYB115，來源于擬南芥，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)在序列表中序列3的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且促進植物體細胞胚胎發生的相關由a)衍生的蛋白質。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。其中，序列表中的序列l由359個氨基酸殘基組成。其中，自N末端第158到204位氨基酸和自N末端210到255分別為R2和R3兩個DNA結合域。為了使a)的AtMYB115蛋白質便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標簽。表l.標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述b)中的AtMYB115蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述b)中的AtMYB115蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列表中序列2自5'末端第1-1080位所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標簽的編碼序列得到。AtMYB115蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。AtMYB115蛋白的編碼基因，是如下l)至5)中任一所述的基因；1)其核苷酸序列是序列表中序列1;2)其核苷酸序列是序列表中序列2;3)其編碼序列是序列表中序列2自5'末端第1-1080位；4)在嚴格條件下與l)或2)或3)限定的DNA片段雜交且編碼促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸合成相關蛋白的DNA分子；5)與l)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性，且編碼促進植物體細胞胚胎發生相關蛋白的DNA分子。所述步驟5)中的基因，與l)或2)或3)的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列1由1481個堿基組成，自5'端第1-579位堿基為該基因的第一個外顯子，自5'端第580-759位堿基為該基因的第一個內含子，自5'端第760-886位堿基為該基因的第二個外顯子，自5'端第887-986位堿基為該基因的二個內含子，自5'端第987-1481位堿基為該基因的第三個外顯子，自5'端第1-79位堿基為該基因的5'非編碼區(UTR)，自5'端第1440-1481位堿基為該基因的3'UTR。序列表中的序列2由1080個堿基組成，其編碼序列為自5'端第1-1080位堿基，編碼具有序列表中序列3的蛋白質。上述嚴格條件可為在O.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。擴增^^M^^遂因全長或任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。含有上述Jf^K5U堪因的重組載體、轉基因細胞系和重組菌也屬于本發明的保護范圍。可用現有的植物表達載體構建含有」fM^75基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pC雄IA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。攜帶有本發明的/1^/份775基因的植物表達載體可通過使用原生質體-化學介導法(Ca2+、PEG)、Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、花粉管、微注射、電激、基因槍、農桿菌介導等常規生物學方法中的任何一種或幾種方法的組合轉化植物細胞、組織或器官，并將轉化的植物細胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的愈傷組織、花、莖尖、葉片等。使用J^/)^^^基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子。所述組成性表達啟動子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，玉米Ubiquitin啟動子或水稻actinl啟動子等；所述組織特異性表達啟動子可為種子特異性表達啟動子、花特異性表達啟動子或根特異性表達啟動子；所述誘導型啟動子可為受ABA、乙烯、乙醇、雌二醇或地塞米松等誘導的啟動子。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的AtMYB115基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(新霉素磷酸轉移酶基因、潮霉素磷酸轉移酶基因、慶大霉素標記物或卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉移酶基因的宿主植物細胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進行篩選，含潮霉素磷酸轉移酶基因的宿主植物細胞、組織或器官可由潮霉素進行篩選。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接通過體細胞胚胎篩選轉化植株。經上述方法進行篩選后還可采用Southern、PCR或點雜交等分子檢測手段對轉基因植株進行檢測，以確定其是否轉化有目的基因。在所述重組表達載體中，力^/^^75基因也可作為轉基因植物的篩選標記基因。如在培育轉基因植物的過程中，可用組成型啟動子驅動J^/^W5基因，將基因作為篩選標記基因轉化植物細胞、組織、器官、愈傷組織或成體植物，利用^^/1^L^基因可以促進植物體細胞胚胎再生的特性，篩選體細胞胚胎從而得到轉基因植物；也可利用各種誘導型啟動子驅動^yW^^基因，將^MWM基因作為篩選標記基因轉化植物細胞、組織、器官、愈傷組織或成體植物，利用^ki/l^A^基因可以促進植物體細胞胚胎再生的特性，篩選體細胞胚胎，然后將其進行非誘導培養而得到轉基因植物。本發明的^MUJ5基因可促進植物體細胞胚胎發生，如將力^/K^J5基因導入植物組織、細胞或器官中，從而促進植物體細胞向胚性細胞的轉變，提高體細胞胚胎發生的頻率。本發明的」d/KgW5基因還可用于培育具有無性生殖能力的轉基因植物，如利用jfi^i^^基因轉化植物細胞、組織、器官、愈傷組織或成體植物，從而使被轉化的植物通過體細胞胚胎再生得到完整的植株。本發明的^d/^W5基因還可用于培育種子/胚胎相關的脂肪酸和/或油含量提高的轉基因植物，如將^fi/J^W5基因導入植物細胞、組織、器官或整株植物，使^fi/J^775基因過量或異位表達，而獲得植物油含量提高的轉基因植物細胞、組織、器官或整株植物。其中，上述的種子/胚胎特異的脂肪酸和/或油是指植物體內存在的各種脂肪酸和油，包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。本發明的Z^OT^^5基因也可用于生產人工種子。如可將^d/份W5基因導入植物細胞、組織、器官或成體植物中，從而促進植物體細胞胚胎的發生，利用獲得的體細胞胚胎生產人工種子。上述的各個方法對雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉化的植物細胞、組織或器官既可來源于擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草等雙子葉植物，也可來源于水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。本發明以擬南芥"raZ^/c^w\s"3^'朋a)哥倫比亞生態型為材料，用PCR的方法分離得到^fi/K9W5基因，并且構建了含有^tM^W5基因的植物重組表達載體，用該載體轉化擬南芥，獲得了轉v4^/^2J5基因的擬南芥植株，表達分析表明^M^W5基因過量表達的擬南芥植株的體細胞具有胚性特征；同時，X^/份W5基因過量表達的擬南芥的營養器官中脂肪酸等營養物質的積累量提高。實驗證明，本發明所述基因可以正調控胚胎特異基因Zi"的表達，進而調控胚胎的發育。另外，過量表達JfM^75后，植物體細胞具有了胚性特征，在轉基因植物的營養組織中用RT-PCR方法可以檢測到^^/義尸〃5^、Z^^等胚胎/種子特異性基因的表達。同時，過量表達JtM^W5基因的植物營養器官中脂肪酸等營養物質的積累水平提高。本發明的促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸合成的轉錄因子基因及其編碼蛋白對于植物胚胎發生分子機制的研究，以及提高植物體內尤其是植物種子中脂肪酸和油含量具有重要的作用。圖1為^d/1^775基因組的框架結構。圖2為轉y4^/l^A^基因擬南芥站和tt6轉基因系2周齡幼苗經10uM雌二醇誘導16小時后，J^/KW75基因的表達。第一排^i/份A5;第二排^T7內參。圖3轉J^W^775基因的擬南芥株系的表型。A:圖2中的轉^^^57M基因的擬南芥tt5和恥株系在10nM雌二醇誘導培養基上萌發并生長后兩周的表型；B:A圖中箭頭所示植物的放大圖；C:A圖中轉^^ffiW7^基因的擬南芥站株系在不同濃度雌二醇培養基上的表型。圖4為轉力tM^W5基因的擬南芥共5株系的植物根外植體體細胞胚胎。圖5為轉^ffZ^75基因的擬南芥站株系的根外植體體細胞胚胎掃描電鏡。A:球形胚；B:子葉胚；C:子葉融合的畸形胚胎。圖6為RT-PCR檢測^^i/i^775基因在擬南芥不同組織和器官中的表達情況1:幼苗；2:根；3:莖；4:蓮座葉；5:莖生葉；6:花蕾；7:花；8:果莢。圖7為蘇丹紅染色指示轉^ti/7萬W5基因的擬南芥tt5株系體內脂肪酸含量A:轉pER10載體對照；B:轉^M^"基因植物。具體實施例方式實施例l、^tM^75基因的克隆根據Jd/K5A^基因的核苷酸序列設計PCR引物，擴增^^W^W基因，弓l物序列如下MYB115F(上游引物)5'-CCTCGAGGAAGAACATCTACAATAAAATCTCC-3'MYB115B(下游引物)5'-CAGATCTTCATTCCAACCATTCATGAGCATCC-3'。用TRIZAL試劑(Invitrogen)并參照試劑盒說明書提取擬南芥(AraZ^/oA^'sf力a力'3朋)哥倫比亞生態型(Col-0)新鮮角果的總RNA，然后用SMerScriptIIReverseTranscriptase試劑盒(Invitrogen)反轉錄合成其第一鏈cDNA，再以所合成的cDNA為模板，在引物P1和P2的引導下進行PCR擴增，反應結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA回收試劑盒(鼎國公司)回收長度約1000bp的目的片段，將回收片段連接入到載體pGEM-Teasy(Promega)中，再將連接產物用熱激法轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，篩選陽性克隆，將其接種于含50mg/L氨芐青霉素的5mLLB液體培養基中，在37。C、200rpm下培養12-16小時，提質粒，得到含有回收片段的重組質粒，命名為pGEM-TVector-A#mMc，對其進行測序，測序結果表明擴增片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，由1080個堿基組成，編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列的蛋白質，其中，自5'端第567-705位堿基編碼Myb結構域，自5'端第723-858位堿基編碼Myb結構域，其編碼序列為自5'端第1-1080位堿基，編碼具有序列表中序列3的蛋白質。利用上述引物，從哥倫比亞生態型(Col-0)擬南芥基因組中用高保真DNA聚合酶K0D-Plus(日本東洋紡公司)進行PCR擴增。PCR擴增產物按照上述方法連接到pGEM-Teasy(Promega公司)中，構建重組表達載體pGEM-TVector-^fM^775"，對其進行測序，測序結果表明擴增片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，由1481個堿基組成，包括79個堿基的5'UTR區，開放閱讀框架為5'端第81到第1439位堿基，3'UTR區為1440到1481位堿基。自5'端第80-579位堿基為該基因組基因的第一個外顯子，自5'端第580-759位堿基為該基因組基因的第一個內含子，自5'端第760-886位堿基為該基因組基因的第二個外顯子，自5'端第887-986位堿基為該基因組基因的第二個內含子，自5'端第987-1439位堿基為該基因組基因的第三個外顯子。該基因的框架結構見圖l，將該基因命名為^^/Z^/5，將其編碼蛋白命名為AtMYB115。將利用MYB115F和MYB115B從哥倫比亞生態型(Col-0)擬南芥基因組擴增得到的PCR片段通過Xhol和Smal兩個多克隆位點連接到pBluescriptSK(+)(Stratagene公司)載體上，然后通過Xhol和Spel多克隆位點連接到pER10載體(Zuo等，2001年，PlantJ.24:265-273.USPatent6452068)(中國科學院遺傳與發育生物學研究所)上，構建成植物表達載體，命名為pER10-M^W5。實施例2、轉^d/)S^^基因擬南芥的獲得將實施例1中構建的植物表達載體pER10-J/^9775用電激法轉化農桿菌GV3101感受態細胞，將其涂布于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的LB抗性平板上在28°C、150rpm下培養12-16小時，挑取長出的農桿菌單菌落再接種于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的20mLLB液體培養基中在28°C、150rpm下振蕩培養2天，然后，再按1%的接種量將菌液接種于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的300mLLB液體培養基中在28'C、150rpm下振蕩培養16-18小時。培養結束后，5000rpm離心20分鐘收集菌體，再將菌體懸浮于250mL含有5%蔗糖的Silwetl-77中，慢慢搖勻。最后，將菌液轉于250mL燒杯中，將已去掉花和果莢的哥倫比亞生態型擬南芥植株倒置于燒杯中，侵染10分鐘，為提高轉化效率，一周后再重復一次。將轉化植株進行常規培養，收獲種子，所得種子經50mg/L卡那霉素篩選后得到J^ffiWM轉基因植株，移栽到蛭石中繁殖種子。按照上述方法將pER10載體轉入哥倫比亞生態型擬南芥中，獲得轉pER10載體的擬南芥植株，移栽到蛭石中繁殖種子，作為對照。實施例3、^tiW^775過表達植株基因表達檢測挑選實施例2中轉^^M^75基因的擬南芥轉基因系中兩個不同轉基因系站和#6檢測擬南芥體內^d/J^775基因的表達水平，以轉pER8載體的擬南芥植株作為對照。以上植物種子分別播種在1/2MS培養基(Sigma)。在16小時光照，22。C培養2周左右。然后，轉到含有10uM雌二醇的液體1/2MS培養基中，誘導16小時。同時，以轉到不含雌二醇的液體1/2MS培養基中，誘導16小時作為對照。用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)并參照試劑盒說明書提取總RNA，然后用Invitrogen公司的SuperscriptIIReverseTranscriptase試劑盒并參照試劑盒說明書反轉錄合成其第一鏈cDNA，再以所合成的cDNA為模板，在引物MYB115RTF和MYB115RTB的引導下進行PCR擴增，反應結束后，對PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。其中，PCR擴增的反應條件是94'C變性2分鐘，94°C30秒，56。C30秒，72。C30秒，共進行25輪反應，最后72。C延伸10分鐘。引物MYB115RTF和MYB115RTB的序列為MYB115RTF:5'-GTTGTCACGAGCCAGTTCTTGT-3';MYB115RTB:5'-TGTTGTTGATTGTGATAGACCT-3'。實驗結果表明，因為^ti/TOU5基因表達是誘導表達，所以在不加誘導劑雌二醇的條件下轉基因的幼苗中檢測不到^^/^W5基因表達，在加了誘導劑雌二醇的條件下，明顯看到轉基因植物中目的基因有明顯過量表達。圖2所示為^dffiW75基因過量表達的擬南芥中兩個轉基因株系(#5和恥)2周幼苗經10uM雌二醇誘導16小時后，J^/ISW5基因的表達。圖2中"+"代表10uM雌二醇誘導16小時，"-"代表未經雌二醇誘導。實施例4、^^M^W5過量表達植物表型分析將實施例2中收獲的種子分別播種在含有O、0.01、0.1、1和10umol/L的雌二醇和不含有雌二醇的1/2MS培養基。在16小時光照，22"C培養2周左右。在不含雌二醇的培養基上，轉^tli^^5基因植物生長完全正常，無異常表型。然而，在含有10uM雌二醇的培養基上，轉^^/1^^5基因植物種子萌發后始終保持胚胎特性，例如子葉不能伸展、根不能伸長等如圖3A和3B。圖3A中"tt5"和"郞"分別代表轉^fM^W5基因擬南芥tt5株系和tt6株系，在"#5"中左邊為轉J^W^W5基因擬南芥貼株系在正常培養基中的表型，右邊為轉^ld/KW75基因擬南芥tt5株系在10ixM雌二醇的培養基中的表型；在"恥"中左邊為轉^d/i^W5基因擬南芥tt6株系在正常培養基中的表型，右邊為轉^d/I^A^基因擬南芥共6株系在10uM雌二醇的培養基中的表型。轉^^W^L^基因植物的表型隨著誘導劑雌二醇濃度的升高而加強如圖3C，轉pER10空載體的植物和轉力fvW^A^植物在不加誘導劑雌二醇的條件下的生長情況與野生型相同，無異常表型。圖3C中，pER10為轉pER10載體的擬南芥植株在含有10uM雌二醇的培養基上的表型，其余為在不同濃度雌二醇的培養基中的轉」^W^^5基因擬南芥tt5株系的表型。實施例5、過量表達^fM^^5基因促進了體細胞胚胎發生將^d^v^75基因過表達的擬南芥tt5植株和轉pER10載體的擬南芥植株分別移栽到蛭石中繁殖種子，將收獲的種子分別播種在MS培養基。生長1-2周后，將15-20株幼苗轉移到250ml三角瓶中，每個三角瓶盛有IOOmlB5液體培養基(1XB5鹽(Sigma)，1XB5維生素，3%蔗糖，0.5g/LMES，pH5.7)。然后，將三角瓶放在搖床上，并設置轉速為125rpm。在溫度為22。C，16h光照/8h黑暗培養。1-2周后，根就可以用作再生體細胞胚胎的外植體。把B5液體培養基中的幼苗轉移到一個滅菌培養皿上，用滅菌剪刀剪根，并切成小段(約lcm長)；用剪刀把所有的根分開；根放在四層滅菌濾紙上吸去殘留的液體，再用滅菌鑷子把根轉移到CIM固體培養基上(1XB5鹽，2%葡萄糖，0.5g/LMES，0.5mg/L2，4-D，0.05mg/L激動素，0.25%Phytagel，pH5.7)，并且盡量讓所有的根外植體直接接觸到培養基;用封口膜密封，然后放于標準組織培養條件下培養2-3天；然后，轉移到SCM培養基(1XMS鹽，1%蔗糖，0.5g/LMES，10uM雌二醇，0.15mg/LIAA，0.25%Phytagel植物凝膠，pH5.7);繼續培養3-5周，結果表明^^/J^L^基因過表達的擬南芥#5產生了大量體細胞胚胎，如圖4和5所示。轉pER10載體的擬南芥按照上述方法誘導后沒有產生體細胞胚胎。實施例6、Jz^份W5基因表達譜分析按照實施例3所述的方法提取擬南芥哥倫比亞野生型植物的幼苗、根、莖、蓮座葉、莖生葉、花蕾、花和果莢的總RNA并反轉錄得到cDNA。然后，用實施例3所述的引物MYB115RTF和MYB115RTB進行PCR反應，PCR擴增的反應條件是94'C變性2分鐘，94。C30秒，56。C30秒，72。C30秒，共進行25輪反應，最后72。C延伸IO分鐘。實驗結果如圖6，表明^^M^775基因在擬南芥的花蕾、花和角果中特異表達，在擬南芥的幼苗、根、莖、蓮座葉和莖生葉中沒有表達。實施例7、蘇丹紅染色指示轉基因植株體內脂肪酸含量的變化將^i/K^75基因過表達的擬南芥貼植株和轉pER10載體的擬南芥植株分別移栽到蛭石中繁殖種子，將收獲的種子分別播種在含有1UM雌二醇的1/2MS培養基(Sigma)上。在16小時光照，22。C培養7天左右。分別取上述誘導培養基中的J^ffi9W5基因過量表達的擬南芥植株與轉pER10載體的擬南芥植株浸泡于1%蘇丹紅(FatRed7B)(Sigma公司)，室溫30分鐘，用去離子水清洗3遍。蘇丹紅染色實驗結果如圖7顯示，^fM^775基因過量表達的擬南芥植株的根部和子葉處的脂肪酸的積累明顯比轉pER10載體的擬南芥植株的根部和子葉處的脂肪酸的積累水平高。序列表<110>中國科學院遺傳與發育生物學研究所<120>促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸合成的轉錄因子及其編碼基因與應用<130>CGGNARW81380<160>3<210>1<211>1481<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥"raZjVoAAfA37i朋3」<400>1aaatctccttctaaactctcacttatttcgcaaaaagagcatctta_aatc60tcttgatcggttttcgaagatgtatcaccaaaatctgatttcatcgaccccaaaccaaaa120ttctaatcctcacgattgggatattcaaaatcctttattttccatacatccttcagctga180aataccctcaaaatatccctttatgggtatcacttcttgcccaaacaccaatgtttttga240ggaatttcaatataaaataacc犯cgatc3aaactttccaacgacctataacaccccatt300ccctgtaatatctgaaggtatatcatacaatatgcatgatgttcaagagaatactatgtg360tggttatactgctcacaatcaagggcttatcattggttgtcacgagccagttcttgttca420tgccgtggttgagtctcagcaatttaatgtcccacagtcageigga_ta_tc3atttagtatc■tc卿gtgsg3gggtc3cag犯gataaggtaatgttcaaaaccgatcataagaagaeiaga540cattattggc肌agggcaatggactcctactgaagacgagtaagttttatttttatttta600tttaatg犯3actattaataattcatatgttgacaaaaaaataatgactccattataaat660attcttataaatattttatttttgttatttttcttattattgtggatctt720gtatt3tta^犯tgtttgggtattcgtaggttgttggtga_g組ggtg肌780aagtaaaggaacgaaaaactggacatcaatcgcaaaaatgttccaaggacgagtaggaaa8408ca_atgtcgagagaggtggcataaccatcttcgaccaaacatcaaggtagatttgtttta900atctttcgatttaagt3t3tatgtgacatgtgaga^tatttactaaatgcatctagcta960tatataaaatgaatgtgtgttttcagaaaaatgattggagtgaagaagaagatcaaatac1020ttattgaagtccacaagatagttggcMcaaatggaccgaaattgctaaaagacttcctg1080aaatattgttggaatgctacaaaacgtcgactacactccg1140gagaagtgatgctttttcccctcgcaacaatgcccttgaaaattacataa1200ggtctatcacaatcaacaacaatgcccttatga3C8ga_ga_agttgattctataactgcaa1260actcggaaattgatagtacc卿tgtg柳atattgttga_cgaggtgatgaatctgaatc1320tgcacgctacaacgtccgtttatgttccggagca^gcsgtgttgacatggggttatgatt1380ttacaaaatgttatgaacccatggatgatacatggatgctcatgaatggttggaattaat1440ttctggtgtagg柳ttgctttgctaaagatgttttctcat1481〈210〉2<211>1080〈212>DNA<213〉擬南芥屬擬南芥〈400〉2atgtatcaccaaaatctgatttcatcgaccccaaaccaaaattctaatcctcacgattgg60g3t3ttc^aatcctttattttccatacatccttcagctgaaataccctcaaaatatccc120tttatgggtatcacttcttgccca_a_aca_ccaatgtttttgaggaatttcaatataaaata180accaacgatcaaaactttccaacgacctat33caccccattccctgtaatatctgaaggt240atatcatacaatatgcatgatgttcaagag犯tactatgtgtggttatactgctcacaat300ca^gggcttettcattggttgtcacgagccagttcttgttcatgccgtggttgagtctcag360caatttaatgtcccacagtcagaggatatcctcagagtgagagggtcaca420taatgttcaaaaccgatcataagaaga肌gacattattggcaaagggcaa■tggactcctactgaagacgagttgttggtgagaatggtg3￡iaagta^aggaacgaaaaac540tgg3CEltC^tcgcaaaaatgttCC犯gg3cgagtaggaa匿組gtcg卿gaggtgg600cataaccatcttcgaccaaacatcaagaaaaatga_ttgg3gtgaagaagaagatcaaata660ctt3ttgaagtccacaagat.agttggcaacaaatggaccgaaattgctaaaagacttcct720ggacgaagtgaaaatattgttaaaaatcattggaatgctacaaaacgtcgactacactcc780gtaaggactaagagaagtgatgctttttcccctcgcaacaatgcccttga840aggtctatcacaatgcccttatgaacagagaagttgattc900aactcggaaattgatagtaccagatgtgagaatattgttgacgaggtgatgaatctgaat960ctgcacgctacaacgtccgtttatgttccggagcaagcagtgttgacatgggg也tg3t1020111acaaaatgttatgaacccatggatgatacatggatgctcatgaatggttggaattaa1080<210〉3〈211〉359<212〉PRT〈213〉擬南芥屬擬南芥"ra力iVo/^i'sz^sh'a/^<400>3MetTyrHisGinAsnLeulieSerSerThrProAsnGinAsnSerAsn151015ProHisAspTrpAsplieGinAsnProLeuPheSerlieHisProSer202530AlaGlulieProSerLysTyrProPheMetGlylieThrSerCysPro354045AsnThrAsnValPheGluGluPheGinTyrLyslieThrAsnAspGin505560AsnPheProThrThrTyrAsnThrProPheProVallieSerGluGly65707580lieSerTyrAsnMetHisAspValGinGluAsnThrMetCysGlyTyr859095ThrAlaHisAsnGinGlyLeulielieGlyCysHisGluProValLeu100105110ValHisAlaValValGluSerGinGinPheAsnValProGinSerGlu115120125AsplieAsnLeuValSerGinSerGluArgValThrGluAspLysVal130135140MetPheLysThrAspHisLysLysLysAsplielieGlyLysGlyGin145TrpThrProThrGlyThrGlyLysLysGin195AsnAsn180Cys150GluAsp165TrpThrSerlie155160GluLeuLeuValArgMetValLysSerLys170175LysMetPheGinGlyArgValLysLysAsnAsp210HisLyslieVal225GlyArgSerGluArgGluArgTrpSerGlyArgLeuAsnAsnHisAla275MetAsn245ValAsn230lieGlu215LysTrp200GluAla185HisAsnHisLeuGinGly190ArgProAsnlie205LeulieGluValTrpValLysArgThrLysSer260LeuGluAsnTyrGluAspGinlie220ThrGlulieAlaLysArgLeuPro235240AsnHisTrpAsnAlaThrLysArg250255SerAspAlaPheSerProArgAsnAlaLeu290AspSerThrArg305LeuHisAlaThrlie280AspArg265ArgSerlieThrPheSer270lieAsnAsnAsn285AsnSerGlulieTrpGlyTyrAsp340MetLeuMetAsnGlyTrpAsn355ArgGluValAspSerlieThrAla295300CysGluAsnlieValAspGluValMetAsnLeuAsn310315320SerValTyrValProGluGinAlaValLeuThr330335GluProMetAspAspThrTrpThr325PheThrLysTyrCysTyr345AspAsp350權利要求1.一種蛋白質，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)在序列表中序列3的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且促進植物體細胞胚胎發生的相關由a)衍生的蛋白質。2.權利要求l所述蛋白的編碼基因。3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下l)或2)或3)或4)或5)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列l;2)其核苷酸序列是序列表中序列2;3)其編碼序列是序列表中序列2的自5'末端第1-1080位；4)在嚴格條件下與l)或2)或3)限定的DNA片段雜交且編碼促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸積累相關蛋白的DNA分子；5)與l)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性，且編碼促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸積累相關蛋白的DNA分子。4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌及擴增權利要求2或3所述基因的全長及其任意片段的引物對。5.根據權利4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體中，權利要求2或3所述基因作為轉基因植物的篩選標記。6.權利要求2或3所述基因在促進植物體細胞胚胎發生中的應用。7.權利要求2或3所述基因在培育脂肪酸和/或油脂含量提高的轉基因植物中的應用。8.權利要求2或3所述基因在改善植物幼苗、愈傷組織、營養器官或種子內脂肪酸和/或油脂含量中的應用。9.一種使植物具有無性生殖能力的方法，是指將權利要求2或3所述基因導入植物細胞、組織、器官或植株中，使植物具有通過體細胞胚胎再生成完整植株的能力。10.一種人工種子的生產方法，是將權利要求2或3所述的基因導入植物細胞、組織、器官或植株中，獲得體細胞胚胎，利用獲得的體細胞胚胎生產人工種子。全文摘要本發明公開了一種促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸合成的轉錄因子及其編碼基因與應用。所述轉錄因子是如下的蛋白a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)在序列表中序列3的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且促進植物體細胞胚胎發生的相關由a)衍生的蛋白質。本發明還公開了所述轉錄因子的編碼基因以及含有所述基因的重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌。本發明所述促進植物體細胞胚胎發生和脂肪酸合成的轉錄因子及其編碼基因具有很大的應用價值，如促進植物體細胞胚胎發生、培育脂肪酸含量提高的轉基因植物、作為轉基因植物的篩選標記、使植物具有無性生殖能力和人工種子的生產。文檔編號C12N15/29GK101597328SQ200810114530公開日2009年12月9日申請日期2008年6月6日優先權日2008年6月6日發明者左建儒,牟金葉,王興春,沖騰申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所