專利名稱：微生物分批發酵轉化法制備11α羥基坎利酮的方法
技術領域：
本發明屬于微生物制備技術。涉及一種微生物轉化法生產11α羥基坎利酮的制備工藝，特別涉及以赭曲霉為菌種，坎利酮為底物，采取分批發酵技術制備11α羥基坎利酮的方法。
背景技術：
11α羥基坎利酮(11αOH Canrenone)，化學名孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，11，17-二羥基-3-氧-γ-內酯。是合成依普利酮(Eplerenone)的重要醫藥中間體。依普利酮是由11α羥基坎利酮出發經由六步化學反應最終合成，主要用于治療充血性心衰(CHF)。
11α羥基坎利酮由坎利酮通過微生物轉化在11位上羥基得到。由于市場潛力巨大，很早就有了坎利酮11α羥化反應的報道。
1971年，B.lunt等就已經嘗試用坎利酮生產11α羥基坎利酮。在坎利酮投料量為0.5g/l時，轉化率達到90％。
1980年Deshayes在優化后的條件下，1.5g/l坎利酮能得到95％的轉化率。這被認為是該領域一個巨大的進步，但其投料量不高，不適于大規模工業化生產。
1996年，Ng；John S.等采用間歇補料，雖然投料量大為提高，但由于間歇補入碳源、氮源、抗生素(如鹽酸四環素，硫酸卡那霉素等)，使成本大大提高；而且過程中生物量不斷增長，菌體甚至會暴露于空氣中，攪拌轉速500-1000rpm，給生產控制帶來相當難度；轉化時間140-180h，由于轉化時間長，無形中加大了生產成本。
綜上所述，現有的微生物發酵法生產11α羥基坎利酮生產工藝仍存在生產周期長，成本高，工藝復雜等問題，限制了該產品的推廣與應用。所以研究和開發一種工藝簡單、經濟實用的11α羥基坎利酮生產工藝是當務之急。

發明內容
要解決的問題針對上述問題，本發明目的是解決現有的微生物間歇補料發酵法，制備11α羥基坎利酮生產周期長、成本高、工藝復雜等問題；提供一種工藝簡單、投料量高、轉化過程中不需要補料、經濟實用、適于大規模生產的11α羥基坎利酮的分批發酵法制備技術。
技術方案微生物分批發酵轉化法生產11α羥基坎利酮的制備技術是以赭曲霉(AS3.4411)為生產菌種，坎利酮為底物，經過產孢和生產斜面制備、孢子懸液制備、一級種子培養、二級發酵培養、底物轉化的分批發酵技術最終得到目標產物，具體方法如下(1)產孢和生產用斜面制備生產菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，將該菌置于葡萄糖土豆汁斜面PDA培養基或小米斜面上，25-28℃恒溫培養4-7天生成黃色孢子，覆蓋在斜面上，顏色為灰黃色，于PDA斜面背面可以觀察到紅色色素，然后轉接在酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖斜面培養基YPDA斜面上，25～28℃培養7-10天，可生成金黃色孢子，即生產用斜面，于4℃冰箱中保藏，保藏時間在15天以內；(2)孢子懸液制備將5ml2％吐溫80溶液加入生產斜面中，洗下孢子，計數調整孢子懸液濃度為4-8×108個/100ml；(3)一級種子培養種子培養基由碳源、氮源組成，用10％H3PO4(w/v)調節pH 5.0～6.0，120～125℃滅菌15～25min，每100ml種子培養基接入1ml孢子懸液，在搖床轉速150-200r/min下，25-30℃培養18～24h即得到適于接種的種子培養物；(4)二級發酵培養發酵培養基由碳源、氮源、磷源組成，用10％HCl(w/v)調節pH至4.0～6.0，120～125℃滅菌15～25min。將生長良好的種子培養液按2％～5％(v/v)的接種量接入到發酵罐中，在發酵過程中初始轉速為100～200r/min，通氣量為70～100L/h，罐壓為0.05～0.1Mpa，培養溫度25～28℃。通過調節發酵罐的通氣量、轉速和罐壓來控制發酵液中溶氧水平保持在20％～30％，培養18-22小時后，殘糖降至10-14g/L時，即得適宜于轉化的菌體培養液；(5)底物的轉化·發酵采用干粉投料，將底物進行預處理，底物要預先粉碎，要求粒度小于100μ，于50～100℃烘4h，投料量10～20g/L，在轉化過程中通過調節發酵罐的通氣量、轉速和罐壓來控制發酵液中溶氧水平在10～30％，轉化60-70h；·檢測轉化60h之后，通過薄層層析TLC和高效液相HPLC檢測其轉化率，其中采用TLC方法分析時，選用展開系統為苯∶丙酮＝3～5∶1～4或氯仿∶乙酸乙酯＝2～4∶1～5，采用HPLC分析時，選用C18柱，檢測波長為280nm，選用70-90％甲醇水或乙腈水作為流動相，當轉化率高于90％后放罐。
需要說明的是
種子培養基由蛋白胨和酵母膏組成復合氮源，葡萄糖作為碳源，其組成含量為葡萄糖16～26g/L；蛋白胨15～23g/L；酵母膏16～24g/L；pH5.0～6.0。
發酵培養基由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及KH2PO4構成。其組成含量為葡萄糖16～26g/L；蛋白胨15～23g/L；酵母膏16～24g/L；KH2PO41～5g/L；pH4.0～6.0；轉化時底 物粉碎粒度推薦為10-20。底物烘烤溫度60℃、轉化時間60-70h為宜。
轉化時采用TLC方法分析時，選用展開系統推薦為苯∶丙酮＝4∶1(v/v)或氯仿∶乙酸乙酯＝3∶2(v/v)；采用HPLC分析時，推薦選用80％甲醇水(v/v)作為流動相。
坎利酮11α羥化反應如下 坎利酮11α羥基坎利酮有益效果本發明提供一種投料量高、轉化過程中不需要補料、經濟實用適于大規模生產的分批發酵轉化法制備11α羥基坎利酮的生產技術。本工藝與以往間歇補料發酵法生產工藝相比，工藝簡單，從而降低了生產成本。菌體生物量達到峰值后持續下降，不存在菌體暴露于空氣中的現象，解決了發酵液上層菌體不能參與轉化反應的缺點。由于過程簡單，染菌的機率很低，且轉化時間短。終了轉化率仍高于90％。本發明是一種新的、經濟實用的、用生物技術生產11α羥基坎利酮方法，為大規模工業化生產奠定了基礎，具有較大經濟效益。
具體實施例方式
實施例1生產菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，該菌在PDA斜面(葡萄糖土豆汁斜面培養基)置于25℃恒溫培養7天生成黃色孢子。覆蓋在PDA斜面上，顏色為灰黃色，于斜面背面可以觀察到紅色色素。然后轉接在YPDA斜面上，28℃培養5天，可生成金黃色孢子。于4℃冰箱中保藏，保藏10天后使用。將5ml2％吐溫80溶液加入生產斜面中，洗下孢子，計數調整孢子懸液濃度為4×108個/100ml。種子培養基由碳源、氮源組成，即葡萄糖20g/L；蛋白胨20g/L；酵母膏20g/L；pH6.0；用10％H3PO4(w/v)調節pH＝6，120～125℃滅菌15min。每100ml種子培養基接入1ml孢子懸液(4×108個)，在搖床轉速150r/min下，28℃培養18h即得到適于接種的種子培養物。
發酵培養基組成葡萄糖 20g/L；蛋白胨 20g/L；酵母膏 20g/L；KH2PO43.3g/L；pH 4.5；采用7L發酵罐，裝液量為4.5L。用10％HCl(w/v)調節pH至4.5，120～125℃滅菌20min。將生長良好的種子培養液按3％(v/v)的接種量(135ml)接入到上述發酵培養基中。初始轉速為100r/min，通氣量為70L/h，罐壓為0.05Mpa，28℃培養，過程中通過調節轉速，通氣量，罐壓來維持溶解氧在30％左右。培養18h，殘糖濃度為10g/L時即可得到適合轉化的發酵培養物。采用干粉投料，要求底物粒度在30-50μ，投料前于80℃烘箱中烘3h之后投料。投67.5g底物坎利酮，轉化過程中調節轉速，通氣量，罐壓維持溶解氧在20％左右。轉化60h之后，取樣通過TLC和HPLC檢測轉化率，其中TLC方法分析，選用展開系統為苯∶丙酮＝4∶1(v/v)。HPLC分析時選用80％甲醇水(v/v)作為流動相。檢測波長為280nm，選用C18柱。待轉化率高于90％之后放罐。
實施例2
生產菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，該菌在小米斜面上置于28℃恒溫培養5天生成黃色孢子。覆蓋在PDA斜面上，顏色為灰黃色，于斜面背面可以觀察到紅色色素。然后轉接在YPDA斜面上，26℃培養7天，可生成金黃色孢子。于4℃冰箱中保藏，保藏15天后使用。將5ml2％吐溫80溶液加入生產斜面中，洗下孢子，計數調整孢子懸液濃度為8×108個/100ml。
種子培養基由碳源、氮源組成，即葡萄糖 24g/L；蛋白胨 23g/L；酵母膏 16g/L；pH 6.0；用10％H3PO4(w/v)調節pH，120～125℃滅菌15min。每100ml種子培養基接入1ml孢子懸液(8×108個孢子)，在搖床轉速180r/min下，28℃培養18h即得到適于接種的種子培養物。
發酵培養基組成葡萄糖 24g/L；蛋白胨 17g/L；酵母膏 22g/L；KH2PO42g/L；pH 4.0；將108g葡萄糖溶于270ml水中配制成40％溶液。110℃滅菌10～15min。將蛋白胨76.5g，酵母膏99g，KH2PO49g溶于4.23L水中。用10％HCl(w/v)調節pH 4.0后裝于7L罐中。120～125℃滅菌25min。將生長良好的種子培養液按5％(v/v)的接種量(225ml)連同葡萄糖接入到上述發酵培養基中。初始轉速為200r/min，通氣量為100L/h，罐壓為0.1Mpa，26℃培養，過程中通過調節轉速，通氣量，罐壓來維持溶解氧在30％左右。培養24h，殘糖濃度為14g/L時即可得到適合轉化的發酵培養物。采用干粉投料，要求底物粒度在10-20μ，投料前于60℃烘箱中烘4h之后投料。投90g底物坎利酮。投料后通過補加20％(w/v)NaOH溶液調節pH至6.0，轉化過程中通過補加NaOH或HCl維持pH在6.0左右。轉化過程中維持溶解氧在20％左右。轉化70h之后，取樣通過TLC和HPLC檢測轉化率，TLC分析時選用展開系統為氯仿∶乙酸乙酯＝3∶2(v/v)。HPLC分析時選用70％甲醇水(v/v)作為流動相。檢測波長為280nm，選用C18柱。待轉化率高于90％之后放罐。
實施例3生產菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，該菌在PDA斜面(葡萄糖土豆汁斜面培養基)上置于28℃恒溫培養7天生成黃色孢子。覆蓋在PDA斜面上，顏色為灰黃色，于斜面背面可以觀察到紅色色素。然后轉接在YPDA斜面上，28℃培養7天，可生成金黃色孢子。于4℃冰箱中保藏，保藏20天后使用。將5ml2％吐溫80溶液加入生產斜面中，洗下孢子，計數調整孢子懸液濃度為6×108個/100ml。
種子培養基由碳源、氮源組成，即葡萄糖 16g/L；蛋白胨 22g/L；酵母膏 15g/L；pH 5.0；用10％H3PO4(w/v)調節pH＝5，120～125℃滅菌15min。每100ml種子培養基接入1ml孢子懸液(6×108個孢子)，在搖床轉速200r/min下，28℃培養20h即得到適于接種的種子培養物。
發酵培養基組成葡萄糖 16g/L；蛋白胨 17g/L；酵母膏 22g/L；KH2PO44g/L；pH 5.5；7L發酵罐裝液量為4.5L。用10％HCl(w/v)調節pH，120～125℃滅菌20min。將生長良好的種子培養液按5％(v/v)的接種量(225ml)接入到上述發酵培養基中。初始轉速為150r/min，通氣量為80L/h，罐壓為0.1Mpa，26℃培養，過程中通過調節轉速，通氣量，罐壓來維持溶解氧在30％左右。培養20h，殘糖濃度為13g/L時即可得到適合轉化的發酵培養物。采用干粉投料，要求底物粒度在20-30μ，投料前于70℃烘箱中烘4h之后投料。投90g底物坎利酮。轉化過程中維持溶解氧在20％左右。轉化70h之后，取樣通過TLC和HPLC檢測轉化率，選用展開系統為氯仿∶乙酸乙酯＝4∶1(v/v)。HPLC分析時選用85％甲醇水(v/v)作為流動相。檢測波長為280nm，選用C18柱。待轉化率高于90％之后放罐。
權利要求
1.微生物分批發酵轉化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于以赭曲霉(AS 3.4411)為生產菌種，坎利酮為底物，經過產孢和生產斜面制備、孢子懸液制備、一級種子培養、二級發酵培養、底物轉化的分批發酵技術最終得到目標產物，具體方法如下(1)產孢和生產用斜面制備生產菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，將該菌置于葡萄糖土豆汁斜面PDA培養基或小米斜面上，25-28℃恒溫培養4-7天生成黃色孢子，覆蓋在斜面上，顏色為灰黃色，于PDA斜面背面可以觀察到紅色色素，然后轉接在酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖斜面培養基YPDA斜面上，25～28℃培養7-10天，可生成金黃色孢子，即生產用斜面，于4℃冰箱中保藏，保藏時間在20天以內；(2)孢子懸液制備將5ml2％吐溫80溶液加入生產斜面中，洗下孢子，計數調整孢子懸液濃度為4-8×108個/100ml；(3)一級種子培養種子培養基由碳源、氮源組成，用10％H3PO4(w/v)調節pH 5.0～6.0，120～125℃滅菌15～25min，每100ml種子培養基接入1ml孢子懸液，在搖床轉速150-200r/min下，25-30℃培養18～24h即得到適于接種的種子培養物；(4)二級發酵培養發酵培養基由碳源、氮源、磷源組成，用10％HCl(w/v)調節pH4.0～6.0，120～125℃滅菌15～25min，將生長良好的種子培養液按2％～5％(v/v)的接種量接入到發酵罐中，在發酵過程中初始轉速為100～200r/min，通氣量為70～100L/h，罐壓為0.05～0.1Mpa，培養溫度25～28℃，通過調節發酵罐的通氣量、轉速和罐壓來控制發酵液中溶氧水平保持在20％～30％，培養18-22小時后，殘糖降至10-14g/L時，即得適宜于轉化的菌體培養液；(5)底物的轉化·發酵采用干粉投料，將底物進行預處理，底物要預先粉碎，要求粒度小于100μ，于50～100℃烘4h，投料量10～20g/L，在轉化過程中通過調節發酵罐的通氣量、轉速和罐壓來控制發酵液中溶氧水平在10～30％，轉化60-70h；·檢測轉化60h之后，通過薄層層析TLC和高效液相HPLC檢測其轉化率，其中TLC方法分析時，選用展開系統為苯∶丙酮＝3～5∶1～4或氯仿∶乙酸乙酯＝2～4∶1～5，HPLC分析時選用C18柱，檢測波長為280nm，選用70-90％甲醇水或乙腈水作為流動相，當轉化率高于90％后放罐。
2.根據權利要求1所述的微生物分批發酵轉化法制備11α羥基坎利酮的方，其特征在于種子培養基由蛋白胨和酵母膏組成復合氮源，葡萄糖作為碳源，其組成含量為葡萄糖16～26g/L；蛋白胨15～23g/L；酵母膏16～24g/L；pH5.0～6.0。
3.根據權利要求1所述的微生物分批發酵轉化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于發酵培養基由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及KH2PO4構成，其組成含量為葡萄糖16～26g/L；蛋白胨15～23g/L；酵母膏16～24g/L；KH2PO41～5g/L；pH4.0～6.0。
4.根據權利要求1所述的微生物分批發酵轉化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于轉化時，底物粉碎粒度為10-20μ。
5.根據權利要求1所述的微生物分批發酵轉化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于轉化時底物烘烤溫度為60℃，轉化時間為60-70h。
6.根據權利要求1-6所述的微生物分批發酵轉化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于轉化時TLC方法分析，選用展開系統為苯∶丙酮＝4∶1(v/v)或氯仿∶乙酸乙酯＝3∶2(v/v)；HPLC分析時選用80％甲醇水(v/v)作為流動相。
全文摘要
微生物分批發酵轉化法制備11α羥基坎利酮的方法，屬于微生物制備技術，涉及一種以赭曲霉為菌種，坎利酮為底物，采取分批發酵技術制備11α羥基坎利酮的方法。本發明解決了微生物間歇補料法制備11α羥基坎利酮生產周期長、工藝復雜，轉化過程中需補加碳源、氮源及抗生素，不僅成本高，而且由于轉化過程中生物量不斷增長，菌體甚至會暴露于空氣中，給生產控制帶來相當難度等問題。其技術方案是以赭曲霉為菌種，坎利酮為底物，經產孢和生產斜面制備、孢子懸液制備、一級種子培養、二級發酵培養、底物轉化的分批發酵技術制得。本發明工藝簡單、轉化時間短、染菌幾率低、轉化率高于90％，從而為大規模工業化生產奠定了基礎，具有較大經濟效益。
文檔編號C12R1/66GK1727494SQ20051001467
公開日2006年2月1日 申請日期2005年7月29日 優先權日2005年7月29日
發明者杜連祥, 路福平, 王敏, 趙玉金, 戚薇, 別松濤 申請人:天津科技大學