專利名稱：檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法
技術領域：
本發明涉及在血液(包括全血、血漿及血清)中對幽門螺桿菌(H.pylori)抗原及其抗原片段的發現。發現于血液中的幽門螺桿菌抗原包括但不限于幽門螺桿菌DNA、RNA或其片段、或者幽門螺桿菌蛋白/肽或其其它抗原組分。幽門螺桿菌DNA或其片段由聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、DNA雜交、分支DNA信號放大檢測或其它信號放大方法進行檢測。其幽門螺桿菌RNA由PCR、雜交或其它信號放大檢測方法檢測。幽門螺桿菌蛋白或肽或其其它抗原組分由免疫檢測或免疫印跡實驗用對幽門螺桿菌的親和純化抗體來檢測。本發明還涉及通過檢測血液中的幽門螺桿菌抗原來診斷幽門螺桿菌感染。
背景技術：
幽門螺桿菌(H.pylori)是革蘭氏陰性細菌，其侵染胃粘膜并且是多數消化性潰瘍病(PUD)的誘因。至今為止，潰瘍及其它形式的消化不良被認為與應激反應水平或飲食習慣有關。最近，醫學界已確認幽門螺桿菌是某些形式的胃疾病包括潰瘍和胃癌的誘發劑。根除幽門螺桿菌促進了潰瘍的愈合并大大降低了癌癥和PUD的發病率。
幽門螺桿菌引起大部分胃和十二指腸潰瘍以及消化性潰瘍病(PUD)。幽門螺桿菌和PUD的聯系最先由澳大利亞醫生Warren和Marshall于1984年發現(Lancet I1311-1344)。現在，幽門螺桿菌感染被看作是胃炎的最常見病因，且從病因學角度講，其與胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腺癌和原發B細胞淋巴瘤有關。
現已證實，PUD是可治愈的，且相當容易。多數PUD的病因是幽門螺桿菌感染。但是，幽門螺桿菌感染不能常規診斷，這可能是因為檢測幽門螺桿菌的方法(即侵入性活組織檢查)不能使醫生特別是主治醫師滿意。因此，主治醫師傾向于用抗分泌劑來治療病發的患者。
醫生需要一種簡單、準確且廉價的診斷幽門螺桿菌感染的方法，以便使他們知道何時治療病人以及何時將病人引見給胃腸病學家。但是，目前的幽門螺桿菌檢測，可以歸類為侵入性檢查和非侵入性檢查，它們都不能令人十分滿意。
侵入性檢查需要先使用內窺鏡然后進行活組織檢查。對由活組織檢查方法獲得的組織樣本，再通過培養、組織學或快速尿素酶實驗進行分析。
雖然對活組織檢查樣本的培養為幽門螺桿菌檢驗提供了最可靠的結果，但是在較好的實驗室中報告的成功率僅在70％至80％之間(Han，S.W.等，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.(1995)，14349-352)。對特殊染色的活組織檢查樣本的檢查可以為急性或慢性炎性粘膜細胞和損傷提供直接的證據。但是，這需要內窺鏡醫生和病理醫生的合作(Genta，R.M.等，Hum.Pathol.(1994)，25221-226)。快速脲酶檢驗檢測由幽門螺桿菌脲酶產生的氨引起的pH升高，該脲酶將脲分解為氨和二氧化碳。但是，其需要高密度的細菌，且降低該細菌量的任何事件都會造成假陰性結果(Cutler，A.F，Am.J.Med.(1996)，10035S-39S)。
自1990年以來，已開發了一些非侵入性檢驗方法來檢查幽門螺桿菌感染的存在。例如，尿素呼吸實驗是基于此生物體的脲酶活性，該脲酶將用13C或14C標記的脲分解為非放射性13CO2或放射性14CO2。此脲呼吸實驗被廣泛推薦用來證實在治療4周后對幽門螺桿菌的根除。
美國專利5,716,791、5,871,942和5,932,430公開了用多克隆抗體檢測糞便樣本中幽門螺桿菌抗原的免疫檢測方法，其中多克隆抗體得自用幽門螺桿菌細胞(即ATCC株43504)致敏的動物。此抗體通過DEAE(二乙基氨基乙基纖維素)柱純化。雖然此糞便抗原檢驗據報告是令人滿意的，但是發現糞便樣本的收集和處理是困難且令人不快的。很多患者不愿意給醫生提供糞便樣本，是由于令人不快的氣味和缺乏方便的收集器具。
用ELISA對血清幽門螺桿菌抗體進行血清檢驗是另一種廣泛使用的實驗。最新技術的實例見美國專利5262156和EP0329570。已鑒定了幾種主要的抗原并用于檢查幽門螺桿菌抗體的免疫檢測方法中。但是，這些檢測方法不具血清診斷要求的特異性和靈敏性(Newell，D.G.等，Serodian.Immunother.Infec.Dis.，(1989)，31-6)。問題之一是由交叉反應造成的。這是由于幽門螺桿菌中的顯性抗原(例如，分子量為60Da的假設的鞭毛蛋白)對幽門螺桿菌來說不是特異性的。一些這樣的抗原發現于其它細菌如C.jeuni和C.coli。在設計幽門螺桿菌免疫檢測中遇到的第二個問題是株變異。在幽門螺桿菌的不同株中已觀察到了抗原的實質不同。這些問題妨礙了用單一抗原設計檢測方法。對幽門螺桿菌抗體檢測的特異性和靈敏性已進行了改進，即使用得自不同幽門螺桿菌株的抗原混合物，該混合物富含某些抗原片段。一種檢測血清中幽門螺桿菌抗體的ELISA試劑已市售。此檢測使用細菌的全細胞裂解物作為抗原。
使用以抗原檢測血清中幽門螺桿菌抗體存在的ELISA還有其它缺點。具體地講，在感染已經治療后的較長時間內(一些情況中長達12個月)人血清中此抗體滴度仍保持高水平。于是，用此ELISA得到的陽性結果并不一定說明該患者目前被感染并需要對幽門螺桿菌感染進行治療。當面對陽性ELISA時，在開始抗生素治療前，治療醫生常要求胃活組織檢查以證實該細菌的存在。因此，基于抗原的ELISA不能排除對侵入性方法的需要。
因此，本發明的目的是設計對幽門螺桿菌感染的非侵入性的和高準確度的診斷方法。在研究期間，發現了血液中的幽門螺桿菌抗原，它們是以DNA或其片段，或蛋白/肽或其其它抗原組分的形式存在于血液(包括全血、血漿和血清)中。因此，設計了檢測這些幽門螺桿菌抗原的特殊方法，以提供幽門螺桿菌抗原片段存在于血液中的證據。這些方法包括但不限于聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)和DNA雜交，用得自幽門螺桿菌菌株的、對幽門螺桿菌具特異性的引物或寡核苷酸及/或DNA探針，來檢測幽門螺桿菌的核酸片段。此外，還開發了免疫檢測和免疫印跡實驗，用針對幽門螺桿菌的親和純化抗體來檢測幽門螺桿菌的蛋白/肽或任何抗原組分。
目前，尚沒有關于血液中存在幽門螺桿菌抗原的報道。本發明第一個證明了幽門螺桿菌抗原不僅存在于血液中，并且還可以通過下面部分給出的方法檢測。

發明內容
本發明提供了存在于患者血液中的幽門螺桿菌抗原，并可以提供聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、DNA雜交、RNA雜交、分支DNA檢測、免疫印跡及免疫檢測方法進行檢測。本發明還提供了通過檢測血液中的幽門螺桿菌抗原來診斷幽門螺桿菌感染的方法。
根據本發明所提供的一種檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是用得自幽門螺桿菌菌株的、對幽門螺桿菌具特異性的引物或寡核苷酸及/或DNA探針，來檢測幽門螺桿菌的核酸片段。例如，可以通過聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)及雜交(優選點狀DNA雜交)方法或其它擴增方法檢測。
本發明中使用的術語“抗原”廣義地包括了在適當條件下能直接或間接引起特異性免疫反應且與該反應的產物反應(即與特異性抗體或特異性致敏的T淋巴細胞反應，或二者兼而有之)的任何物質。這些物質的實例包括但不限于蛋白/肽、多糖、脂類和多或寡核苷酸。
在血液中可以檢測的幽門螺桿菌抗原具有特定的兩種類型。第一類涉及多核苷酸或寡核苷酸，它們是幽門螺桿菌的染色體DNA、RNA或其片段。此類幽門螺桿菌可以通過聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)及雜交(優選點狀DNA雜交)方法或其它擴增方法檢測。
本發明的PCR方法需要使用特異性檢測幽門螺桿菌的一對引物。本文中術語“引物”指寡核苷酸，不論是天然的還是合成的，當置于引起與核苷酸鏈互補的引物產物合成的條件下，即適當溫度下在四個不同核苷酸三磷酸鹽和適當的酶存在下，其能作為核酸合成的引發點。本文中術語“寡核苷酸”定義為由兩個或多個(優選三個以上)脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸組成的分子。其實際大小將依賴于多種因素，其依次依賴于該寡核苷酸的最終功能或用途。該寡核苷酸可以得自合成或克隆。
該引物的制備是根據在幽門螺桿菌菌株如ATCC株43504、43571、43629和49053的共有序列片段中發現的保守序列。優選的引物范圍是長15至25堿基對(bps)，最優選的是約20bps。當兩種引物(正向引物和反向引物)長度相同并且同樣的核苷酸組分基本相同時，可以獲得較好的擴增。優選的用于PCR的血液樣本是血漿。
本發明提供的LCR方法需要使用一種DNA連接酶和對幽門螺桿菌特異性的兩套寡核苷酸。優選的DNA連接酶是Pfu DNA連接酶，其是從Pyrococcus furiosus中分離的熱穩定DNA連接酶，并可以商購。LCR用的兩套寡核苷酸優選比PCR的引物長。如象PCR引物一樣，LCR寡核苷酸得自幽門螺桿菌菌株，如ATCC株43504、43571、43629和49053的共有序列片段中的保守序列。
LCR的完成，是通過含靶序列的DNA模板的熱變性的重復循環，以獨特的方式將第一套針對靶DNA序列的兩個相鄰的寡核苷酸探針退火，而第二套互補寡核苷酸探針和與靶DNA序列相反的序列進行雜交。本文中術語“靶序列”指發現于血樣中的“染色體DNA或其片段”。此后，DNA連接酶可以共價連接每對相鄰的探針，只要這兩個相鄰探針在連接上完全互補。
雜交方法需要制備幽門螺桿菌DNA探針。此幽門螺桿菌DNA探針通過從幽門螺桿菌核酸瓊脂糖凝膠電泳后萃取物中切割并萃取DNA片段來制備。此探針一般具有至少約25個堿基，通常至少有約30個堿基，并可以多達約10000個堿基或更多，通常不超過約5000個堿基。然后，將此DNA片段用限制酶消化，并與宿主連接以形成重組質粒構建，其可以轉染真核和原核宿主細胞。在這些宿主細胞中此DNA片段可以增殖并再分離。然后，可以將增殖后的DNA片段用放射性同位素(如32P、3H、14C等等)標記或熒光物質標記(如用地高辛配基及生物素標記DNA探針與熒光檢測方法結合)并用作DNA探針。
此雜交方法通過用變性試劑處理血液，優選是血清，的核酸樣本，以使存在于固相載體如硝酸纖維素濾膜的DNA變性而進行。優選的變性試劑包括但不限于堿性溶液、有機試劑(例如，醇、酰胺、胺、脲、苯酚及亞砜)或某些無機離子(例如，硫氰酸根和高氯酸根)或通過升溫來實現。然后，將標記的DNA探針加入到變性的DNA點狀膜中。然后，檢測該膜中存在的DNA雜交體的標記特性。如果該標記是放射性的，該膜可以用于X-射線膠片，如果標記是熒光性的，該膜可以用熒光顯微鏡直接觀察。
第二類抗原涉及血液中的幽門螺桿菌蛋白和/或肽，或含抗原表位的任何物質，其可以通過免疫印跡或免疫測定法來檢測，優選使用抗幽門螺桿菌抗原的親和純化的抗體。一級或二級抗體都可能是檢測或測定血液中幽門螺桿菌抗原所需要的，這依賴于檢測中所用方法的種類。一級抗體是針對抗原(在該情況下是幽門螺桿菌抗原)產生的抗體。二級抗體是針對一級抗體的免疫球蛋白產生的種屬抗體(如羊抗-兔IgG)。優選用于檢測的血樣是血清。
免疫印跡法通過先用SDS-PAGE分析血樣。電泳后，將蛋白質/肽帶轉移至硝酸纖維素膜上，然后將其與足量的幽門螺桿菌抗體孵育。產生抗幽門螺桿菌的、針對動物種屬的免疫球蛋白的一種酶標二級抗體可以加入到硝酸纖維素膜上。此方法優選的酶是堿性磷酸酶，其中該反應可以通過加入5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯檢測。用于此方法中的另一個優選的酶標記物是辣根過氧化物酶，其可以通過加入4-氯-1-萘酚或3，3′-二氨基聯苯胺以產生有色的、不溶的產物以便于觀察檢測。
免疫檢定方法包括但不限于基礎夾心檢定(basic sandwich assay)、三聯夾心檢定(triple sandwich assay)和免疫色譜檢定。
在基礎夾心檢定中，需要兩個一級抗體，其中一個與固體載體結合而另一個用檢測試劑標記。該三聯夾心檢定需要聯合使用兩個抗幽門螺桿菌的一級抗體(即，第一抗體和第二抗體)和一個抗動物種屬IgG的二級抗體，此二級抗體用檢測試劑標記。所述一級抗體中只有一個需要結合至固體載體上，該動物種屬產生未結合的一級抗體，最終形成抗抗體-抗原-抗體復合物的復合物。
夾心檢定的固體載體可以是塑料珠、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯等。檢測試劑可以是酶標記物(如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)、熒光或發光試劑(如熒光黃，羅明丹，或銪，魯米諾或吖啶顏料(acridium))、放射性同位素標記(如I125)，或者有色顆粒(如金、銀、藍色乳液或硒)。
基礎夾心和三聯夾心免疫檢定都需要第一個一級抗體與幽門螺桿菌的相互作用以形成抗原-抗體復合物，然后用第二個抗幽門螺桿菌的抗體與此抗原-抗體復合物接觸。
此免疫色譜實驗也需要聯合使用兩個抗幽門螺桿菌的一級抗體。與基礎和三聯夾心檢定相比，第一個抗體(即第一個與生物樣本接觸的抗體)用有色顆粒標記，第二個抗體結合固體載體如硝酸纖維素(硝酸纖維素衍生物)膜、尼龍膜、聚酯膜、過濾紙、瓊脂糖或交聯葡萄糖凝膠。用于此免疫色譜檢定的優選的固體載體是硝酸纖維素膜。選擇性地，在樣本加入點反方向的色譜帶的末端附近，可將產生第一抗體的抗動物種屬的二級抗體加入和/或結合至此固體載體上。此二級抗體用作在色譜進行的末端捕獲未結合的有色顆粒作為對照。因此，如果此樣本不含有幽門螺桿菌抗原，有色顆粒標記的第一種抗體將走過第二種抗體而不結合，因為沒有抗體-抗原-抗體復合物形成。但是，因為二級抗體是抗產生第一種抗體的動物的IgG的，當第一抗體走過時其將結合該第一種抗體，不論此第一種抗體是否已與樣本形成復合物。第一種抗體和二級抗體的結合表明色譜進行到了終點。
與血清樣本有關的問題之一是感染幽門螺桿菌的患者經常在血清中帶有其自身的幽門螺桿菌抗體。這些血清幽門螺桿菌抗體可以與血清幽門螺桿菌抗原形成免疫復合物，這會對本發明的免疫檢定的準確性造成影響。解離此幽門螺桿菌免疫復合物的方法，包括但不限于，用解離試劑解離此復合物，或在樣本解離條件下進行檢定。
該解離試劑的實例，包括但不限于，高濃度鹽(例如，至少1M的氯化鈉或氯化鉀)、洗滌劑(如，至少1％的十二烷基苯磺酸鈉(SDS)、吐溫20、辛基葡糖苷、脫氧膽酸鹽或Triton X-100)、離液劑(例如，鹽酸胍、脲或KSCN)、有機溶劑(例如，二惡烷或乙二醇)、酶(例如，蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶，V8蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶)或脂酶(例如，得自牛奶的脂蛋白脂酶，及得自皺摺假絲酵母的脂酶)。樣本解離條件的實例包括但不限于高pH(例如，pH≥9)或低pH(例如，pH≤3)，以及/或升高溫度(例如，至少50℃)。
雖然已報告了一些嘗試，它們為感染幽門螺桿菌的患者提供了定量及定性的檢測，但是沒有一個是直接檢測血樣中的幽門螺桿菌。其主要原因是還沒有研究人員假定幽門螺桿菌抗原可以發現于血流中。
但是，在表(即，表1-3)中，如后面的實施例9(表1)及11(表2和3)所示的種種證據將表明在幽門螺桿菌感染患者的血清樣本中可以并已經發現了幽門螺桿菌抗原。
基于這些發現，本發明的目的是利用血液中可檢測的幽門螺桿菌抗原作為診斷幽門螺桿菌感染的工具。該診斷方法可以用來檢測不同類型的幽門螺桿菌抗原，其包括但不限于聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、分支DNA擴增檢定、雜交檢定、免疫印跡、免疫沉淀、流式細胞計量術、免疫電泳及免疫檢定(例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)及免疫色譜)。
PCR是高效率擴增特定DNA序列的技術。用聚合酶，例如熱穩定酶Taq聚合酶變性的重復、引物退火和延伸，導致所需DNA序列的指數級增加。每種DNA序列可以用瓊脂糖凝膠電泳分離，并接著進行核苷酸測序。PCR用血樣優選的類型是血漿，這是因為如果發生溶血，得自紅細胞血紅蛋白的血紅素分子可能干擾PCR擴增。
連接酶鏈反應(LCR)是一種DNA擴增技術，其可以用于檢測已知核苷酸序列的痕量水平。LCR包括循環的兩步反應(1)高溫解鏈步驟，其中雙鏈靶DNA解鏈變為單鏈，及(2)冷卻步驟，其中兩套相鄰的、互補寡核苷酸退火為單鏈靶分子并與DNA連接酶連接在一起。從第一個循環中連接的產物作為下一循環的連接反應的模板，LCR導致連接產物的指數級擴增，其方式類似于PCR反應中模板的指數級擴增。
PCR和LCR都需要發現幽門螺桿菌特異性引物或寡核苷酸以引發此核苷酸鏈反應。因為在基因水平幽門螺桿菌菌株是高度多樣性的(Fujimoto等，J.Clin.Microbiol.，(1994)，32331-334)，而個體可以被一種以上菌株感染，因此，根據在多種幽門螺桿菌菌株中發現的共有序列片段的保守序列設計引物或寡核苷酸，這是一種解決問題的手段。
已發現得自ATCC菌株43504的幽門螺桿菌細胞特別有利于制備抗糞便中幽門螺桿菌的一級抗體(見美國專利5716791)。這是因為用得自菌株43504的細胞致敏產生的抗體可以跨地域和跨飲食組檢測此生物體。其它幽門螺桿菌菌株，如ATCC43571、43629、49053已顯示了相似的抗原性。因此，在這些菌株中尋找共有序列的片段是有價值的。這可以如下進行通過用相同的限制酶(一種或多種)將得自上述幽門螺桿菌菌株的提取核酸消化，接著將消化了的幽門螺桿菌核酸片段進行瓊脂糖凝膠電泳。此共有序列片段可以切除并提取。可以分析共有序列片段的核苷酸序列。然后，可將此共有序列片段的保守序列用于設計PCR或LCR用引物或寡核苷酸。
除了PCR或LCR，可以用核酸雜交探針檢測血樣中幽門螺桿菌抗原的存在。優選核酸雜交探針不超過約5000個堿基。此探針序列優選至少基本上與幽門螺桿菌菌株間的共有序列片段的核苷酸序列互補。除了在多種幽門螺桿菌菌株中發現的共有序列片段外，該探針可以得自信使RNA、cDNA，后者通過用逆轉錄酶將信使RNA逆轉錄或通過基因組裂解獲得。對所需探針進行分離和定性后，探針的DNA片段可以在宿主細胞中克隆或增殖。然后，此增殖的探針可以用原子或無機基團標記，此標記最常用放射性核素，但是也可以用重金屬或熒光物質。使用可以特異性結合與幽門螺桿菌抗原的單鏈DNA雜交的探針的抗體，是可行的。在此實例中，該抗體被標記以便檢測。用于探針的同樣類型的標記物也可以按照已知技術與此抗體結合。
放射性標記物如32P、3H、14C等可以用于標記探針，雖然其它放射性標記物也可以使用，只要它們能提供具有足夠半衰期的適宜的信號。其它標記物包括配體，其可以作為標記抗體熒光劑的特異結合單元、化學發光劑、酶、可以作為標記配體特異結合對的抗體等。在免疫檢定中也可以使用多種標記物。標記物的選擇是由標記物對雜交的速率及探針結合樣本DNA的影響決定的。需要該探針為檢測DNA雜交用量提供足夠的靈敏性。其它考慮包括探針的易于合成、易于機械操作、能自動化、方便等。
該標記物結合探針的方式隨該標記物的本質而變化。對于放射性標記物，可以使用多種技術。常用的是用α-32P-dNTP進行切口平移，或用堿性磷酸酶進行末端磷酸水解，接著使用γ-32P-NTP和T4多核苷酸激酶進行放射性32P標記。或者，可以合成核苷酸，其中存在的一個或多個元素被放射性同位素替換，例如，用氚代替氫。
作為標記物的有利的酶包括水解酶，特別是酯酶和糖苷酶或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹胺及其衍生物、丹酰、7-羥基香豆素等。化學發光劑包括螢蟲素及2，3-二氫酞嗪二酮類，例如，魯米諾。
該雜交一般使用附于水不溶性多孔載體的針對DNA樣本的探針進行。此DNA樣本被變性以使單鏈核酸被固定。對于裂解來說，化學裂解是便于使用的，通常用稀堿溶液，例如，0.1至1M的氫氧化鈉。該堿還可以用來使DNA變性。其它變性試劑包括但不限于有機溶劑如醇、酰胺、胺、脲酶、苯酚和亞砜，或某些無機離子如硫氰酸根及高氯酸根，還可以通過升高溫度實現。
也可以通過免疫方法用抗幽門螺桿菌的親和純化抗體檢測血液幽門螺桿菌，該方法包括但不限于免疫印跡法及免疫檢定(如基礎夾心免疫檢定、三聯夾心免疫檢定及免疫色譜)。
免疫印跡法需經過聚丙烯酰胺凝膠電泳將血樣分級分離，然后將分離后的蛋白/肽帶轉移至硝酸纖維素膜上，再將分離的蛋白/肽帶與抗幽門螺桿菌一級抗體作用以形成抗原-抗體復合物。然后，加入用檢測試劑標記的抗一級抗體的二級抗體以顯示該檢測反應。
基礎和三聯夾心免疫檢定都需要至少三個要素抗幽門螺桿菌抗原的第一種抗體，抗幽門螺桿菌抗原的第二種抗體及檢測樣品(即，血樣)。
第一和第二種抗體(即抗幽門螺桿菌抗原的)優選是多克隆抗體。此抗體可以通過給兔或其它動物如山羊或母牛注射幽門螺桿菌細胞獲得，優選這些細胞通過超聲處理破裂，或通過其它細胞破裂手段破裂，以便暴露多個抗原位點。
總之，通過先注射，接著加強注射以使該反應最大化來制備抗體。為了制備這些抗體，將抗原與輔劑例如弗氏佐劑混合以免疫動物從而加強此免疫反應。所注射抗原的量必須適于產生足量的可檢測抗體。多次注射可以以規律的周期進行以使抗體的產生最佳。注射方案取決于所用動物。給動物放血，先通過檢測該血液抗體的產生量。用試驗性放血和酶免疫測定(EIA)檢測抗體的產生。通過色譜，優選親和柱色譜將抗體純化。
在基礎夾心檢定中，如果第一種抗體結合固體載體，第二種抗體必須用檢測試劑標記，其可以是已知的免疫檢測法中的任何標記物。例如，酶標記物(如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶等)、熒光劑、發光試劑或放射性標記物(如熒光黃，羅明丹，銪，魯米諾或吖啶顏料和放射性同位素如I125等)，或者膠體顆粒(如金和硒等)是可以用于此免疫檢定的標記物。在這些標記物中，最常用的是酶標記物如辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶。具體地講，通過HRP與二氨基聯苯胺、四甲基聯苯胺、4-氯-1-萘酚反應，或通過其它類似的化學反應，在比色測定中可以檢測HRP標記物。此比色測定反應產物可以在板式讀數器、掃描儀、光密度計中檢測或目測。通過比較樣本讀數和含已知量抗原的標準物的讀數，可以測定幽門螺桿菌的量。優選幾個標準物用于“含蓋”被測樣本中的標記物的濃度。
放射性同位素如125I碘或β-發射體如14C碳是另一類常用標記物，其可以通過γ計數器或閃爍計數器檢測。熒光標記物也可以用于標記抗體，以便通過熒光分析測定。
固體載體可以是已知用于免疫檢定的任何固體載體。其可以是如ELISA中用的多孔板，其可以在板式讀數器中讀取數據。或者，它可以是能對液體或溶解于固定相中的樣本進行色譜分析的一種載體。這種載體的實例包括膜如硝酸纖維素或柱色譜的介質。
具體實施例方式
下列非限制性實施例用來說明對血液中幽門螺桿菌抗原的檢測。
實施例1制備幽門螺桿菌抗原和核酸室溫下將ATCC菌株43504、43571、43629和49053的幽門螺桿菌菌種保存物分別解凍并在5ml布魯氏桿菌肉湯中稀釋。立即將該稀釋后的細菌懸浮液0.2ml涂布于trypticase大豆血液瓊脂盤上，其中加有5％羊血。這些瓊脂盤在微需氧條件下培養讓細菌生長。培養后，將菌落從盤上刮下并用PBS洗滌兩次。然后，將洗滌后的沉淀懸浮于PBS中。
為了從每個幽門螺桿菌菌株中收集抗原，將幽門螺桿菌細胞轉移至冰冷的容器中并用Microson XL200超聲波細胞破裂機進行10分鐘的超聲波處理。然后，在2-8℃將經超聲波處理的細菌懸浮液以25000×g離心30分鐘，保留上清液作為制備幽門螺桿菌抗體的免疫原。
為了從幽門螺桿菌菌株中收集核酸，可以用存在于100mMTris-HCl(pH8.8)的1％SDS將幽門螺桿菌細胞裂解。然后，可以用等體積的苯酚/氯仿將此裂解液提取一次，隨后用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)提取兩次。用氯仿-苯酚提取后，可以用0.6體積的異丙醇室溫下沉淀染色體DNA。以13000×g離心15分鐘，用70％乙醇洗滌此核酸沉淀，并將其溶解于10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0中。
實施例2用PCR擴增技術檢測血液中的幽門螺桿菌用限制酶可將得自幽門螺桿菌菌株的DNA消化。適宜的限制酶包括但不限于HindIII，EcoRI，BamHI，ClaI和XbaI。在瓊脂糖凝膠上所得片段可在Tris-乙酸-EDTA緩沖液中走電泳。用一種購自BoehringerMannheim(德國)的瓊脂糖凝膠提取試劑盒從該瓊脂糖凝膠中提取DNA片段。因為幽門螺桿菌菌株在基因水平是高度多樣性的，故比較每個幽門螺桿菌菌株的DNA片段以找到共有序列片段是有利的。
用雙鏈DNA模板和二脫氧鏈終止方法(如Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)，711342-1346所述)可以在兩個鏈上確定共有序列片段的DNA序列。基于此共有序列片段的保守序列，可以通過下列制造商提供的方案用DNA合成儀合成寡核苷酸引物。用于PCR的引物通常長度為約20bp并優選15-25bp。當兩個引物長度相同并具有基本相同的核苷酸組成時，可以獲得較好的擴增。優選只與此抗原的核酸特異性雜交的PCR引物，因為擴增的存在指示了幽門螺桿菌特異性核苷酸序列的存在。
用常規方法和實驗的常規用量，依據獲得典型核酸的方法，本領域技術人員可獲得DNA編碼的抗原片段。
PCR擴增在含血漿DNA提取物為模板、幽門螺桿菌引物、Dynazyme緩沖液(可購自Finnzymes，Espoo，Finland)、所有四種脫氧核苷酸的混合物及Dynazyme的反應混合物中進行。血漿DNA的提取與提取幽門螺桿菌核酸的方式相同，不同的是在最后增加了讓該提取物通過Microcon 100過濾器的步驟。此最后步驟是為了除去殘留的非生物抑制性物質及多糖復合物，已發現它們是有力的PCR抑制劑，并使DNA無法沉淀。
可以用礦物油將此反應覆蓋并在開始PCR循環前在Perkin-Elmer DNA熱循環儀(Norwalk，CT，USA)中加熱至94℃并保持10分鐘。開始的5個循環參數可以為在94℃變性2分鐘，在42℃退火1分鐘并在72℃延伸1分鐘。隨后可以用下列參數進行30個循環的PCR在94℃變性2分鐘，在59℃退火1分鐘并在72℃延伸1分鐘。在最后一個循環，延伸可以進行10分鐘。可以在4℃下停止PCR反應，并在瓊脂糖凝膠上對PCR產物進行分析。可以估計PCR產物的大小并與在幽門螺桿菌中發現的共有序列片段比較。
其大小等于共有序列片段的大小被視為陽性結果。可以通過Southern印跡雜交法用32P CTP標記的DNA探針(已由此共有序列片段擴增)證實該PCR產物是幽門螺桿菌序列。
或者，可以用限制酶如AluI，HinFI和HaeIII消化此PCR產物及共有序列片段，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析此消化物的消化圖譜。相同的圖譜指示該PCR產物得自幽門螺桿菌序列。
實施例3用LCR擴增檢測血液中的幽門螺桿菌DNA連接酶鏈反應(LCR)檢定需要兩套的兩個寡核苷酸和一個DNA連接酶。第一套寡核苷酸(即Oligo A和Oligo B)是彼此連續的并與靶DNA雙螺旋的一個鏈互補。第二套寡核苷酸(即Oligo C和Oligo D)與第一套是互補的，并因此占據了靶DNA的第二個鏈上的鄰近位點。所有四個寡核苷酸探針可以按照幽門螺桿菌菌株的保守序列設計并在AppliedBiosystems(Foster City，CA)寡核苷酸合成儀中合成并通過PAGE純化。Oligo A和Oligo D可以通過在37℃下在腺苷5′(γ-32P)三磷酸和多核苷酸激酶的存在下，在50mM Tris-HCl(pH 7.5)、7mM氯化鎂和1mM二硫蘇糖醇中孵育30分鐘，在其5′末端進行放射標記。然后，通過在70℃下加熱使該多核苷酸激酶失活。等量的放射標記的寡核苷酸探針A和D，以及寡核苷酸探針B和C可以加入到一個Eppendorf管中，同時加入從血清樣本中提取的DNA模板。每個管含有一種反應緩沖液，該緩沖液由50mM 雙-TrispH 6.5，10mM氯化鎂，10mM氯化銨，10mM氯化鉀，1mM二硫蘇糖醇和1mM NAD組成。然后，可以向每個管中加入適量的礦物油，并將這些管加熱至100℃并保持3分鐘，隨后冷卻至85℃并保持1分鐘，并在55℃下放置，同時加入DNA連接酶。優選的DNA連接酶是Pfu DNA連接酶，其得自Pyrococcus furiosus。然后可以將這些反應管置于DNA熱循環儀(RoboCycler，Stratagene)中并在85℃和50℃循環20、30或40次，每個溫度1分鐘。然后，用95％甲酰胺終止染料將每個反應的一個等分進行1∶1的稀釋。此稀釋后的樣本可以在丙烯酰胺凝膠上進行分析。
實施例4制備幽門螺桿菌DNA探針可以切掉幽門螺桿菌菌株DNA片段(一般至少25個堿基，通常至少約30個堿基，并可以多達約10000個堿基或以上，但是常常不超過約5000個堿基)，并在電泳后從瓊脂糖凝膠中提取。可以用限制酶將此DNA片段消化并與宿主連接以形成重組質粒構建。例如，可以用ClaI將此DNA片段消化并連接進入ClaI消化的Pev-Vrf表達宿主(Crowl等，Gene(1985)，3831-38)。然后，可以將此重組的質粒轉移至宿主細胞中，其可以是原核細胞如E.coli RRI，或真核細胞如NIH 3T3細胞或HeLa細胞。此重組的質粒可以通過在此宿主細胞中復制而增殖。可以按照So等，Infect.Immun.(1978)，21405-411的方法分離此重組質粒。通過用相同的限制酶消化可以從此質粒中釋放幽門螺桿菌的DNA片段。可以通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺電泳證實此釋放的幽門螺桿菌DNA片段。然后，可以用放射性同位素(如32P、3H、14C等)或熒光物質(如使用地高辛基和生物素標記的DNA探針并結合熒光檢測方法)標記此增殖后的DNA片段并用作DNA探針。
實施例5用幽門螺桿菌DNA探針的點雜交制備在水中煮沸或高壓消毒可以將硝酸纖維素膜滅菌。將一個單個的滅菌膜置于瓊脂的表面并用已被處理釋放其DNA的血清點滴。例如，可以用稀堿水溶液(例如0.1至1M氫氧化鈉)將此血清樣本裂解。該堿還可以用來使DNA變性。其它的變性操作包括但不限于升高溫度、使用有機溶劑(如醇、酰胺、胺、脲、苯酚和亞砜)或某種無機離子(如硫氰酸根和高氯酸根)。
將此樣本變性后，在緩沖水溶液(pH一般為約6至8，通常為7)中可以洗滌此濾膜。經裂解、變性并洗滌后，可以將此樣本DNA點滴濾膜在升高的溫度下干燥，一般為約50至70℃，以將樣本DNA固定在此濾膜上。
然后，在溫和的升溫下將此濾膜與不含探針的雜交溶液孵育足夠的時間以將徹底潤濕此濾膜。可以使用多種雜交溶液，其中含約20％至60％，優選30％體積百分比的惰性極性有機溶劑。一種普通的雜交溶液使用約50％甲酰胺、約0.5至1M氯化鈉、約0.05至0.1N枸櫞酸鈉、約0.05至0.2％十二烷基硫酸鈉(SDS)和少量的EDTA、菲可(約300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(約250-500kdal)和血清白蛋白。在此雜交溶液中還可以含有約0.5至5mg/ml的超聲變性的DNA(例如，胎牛胸腺或鮭魚精液)，及選擇性存在的約0.5至2％重量/體積(wt/vol)的甘氨酸。還可以含有其它添加劑，例如約100至1000kdal的硫酸葡聚糖和約8至15wt％的雜交溶液。
標記DNA探針的量變化很大，這依賴于標記物的特性及其是否可以有效地與濾膜結合，以及該雜交的嚴格條件。總之，應使用化學計量基本上過量的探針以提高該探針與固定樣本DNA的結合速度。
室溫下，用含與雜交溶液類似濃度的氯化鈉、枸櫞酸鈉和SDS的第二溶液清洗該濾膜后，現在可以按照標記物的本質檢測此濾膜存在的雙螺旋。當該標記物是放射性的時，將此濾膜干燥并用其使X射線底片曝光。如果此標記物是熒光物質，則可以直接用熒光顯微鏡觀察。
此探針不需要與其雜交的序列完全互補；其中可以存在30％或更多的錯配堿基對。影響DNA雜交體形成的條件是熟知的并由Crosa等，J.Bact.(1973)，115(3)904-911詳述。
實施例6制備抗幽門螺桿菌的兔多克隆抗體新西蘭白兔，先用存在于完全弗氏佐劑中的0.5至1.0mg的幽門螺桿菌抗原，通過肌肉注射進行免疫，再每隔4周用存在于不完全弗氏佐劑中的0.5-1.0mg相同抗原進行加強免疫。在第3次加強免疫后采集血樣進行分析。一旦該抗體滴度到達了約106的所需水平，便開始放血。
將個體的血液先在PBS中稀釋至1×106。然后將100μl的稀釋后兔血清加入到幽門螺桿菌抗原包被孔中。室溫下孵育1小時后，用PBS將此板洗滌4次并加入100μl山羊抗兔IgG-HRP結合物。將此板在室溫下再孵育30分鐘。用PBS洗滌4次后，向每個孔中加入100μl四甲基聯苯胺(TMB)底物以染色，并在450/650nm用微孔讀數器檢測每個孔中的顏色強度。OD450/650必須大于1.0才能用于抗體的制備。
實施例7制備抗體-HRP酶結合物選擇酶辣根過氧化物酶(HRP)來與抗幽門螺桿菌抗體偶聯。此抗體-HRP酶結合物的制備是根據改良的Nakane方法(Nakane等，1978Inimmunoflorescence and related staining techniques，Knapp等編輯，p215-220，Elsivier/North-Holland Biomedical Press，Amsterdam)。
簡言之，先用高碘酸鈉對HRP進行氧化處理。此氧化在碳水合物側鏈上產生醛基。該抗體和氧化后的HRP再在堿性pH下混合，讓該抗體上的氨基與HRP上的醛基反應，形成Schieff堿，并將抗體和HRP之間還原為共價鍵。然后，通過用Sephacryl-S300柱進行凝膠過濾純化抗體-HRP結合物。
此HRP可以與一級抗體如抗幽門螺桿菌的兔抗體，或與二級抗體如抗兔IgG的山羊抗體結合。
實施例8凝膠電泳和免疫印跡分析血清樣本可以通過SDS-PAGE進行分析。電泳后，可以通過改良的銀染色方法(Oakley等，Anal.Biochem.(1980)，105361-363)固定凝膠并分離蛋白。
或者，蛋白質可再通過lamp電印跡1小時轉移至硝酸纖維素紙上。用封閉劑如吐溫20和脫脂牛奶將未占據的結合位點封閉后，向此硝酸纖維素紙中加入足量的實施例6(見上)所述的幽門螺桿菌抗體。然后，可將此硝酸纖維素紙在室溫下孵育1小時。最后，可向此硝酸纖維素紙中加入抗產生幽門螺桿菌抗體的動物種屬免疫球蛋白的二級抗體(如山羊抗兔IgG)的堿性磷酸酶結合物。此反應可以通過加入5-溴-4-氯-3-異丁基磷酸(BCIP)/氮藍四唑(NBT)檢測。
實施例9制備游離形式的血清幽門螺桿菌抗原血清幽門螺桿菌抗原可以游離形式及免疫復合物的形式存在。幽門螺桿菌的游離形式可以通過免疫檢定或任何可以檢測方法容易地檢測。對于那些與血清中幽門螺桿菌抗體形成免疫復合物的抗原，它們只能在從此免疫復合物中解離后檢測。
血清幽門螺桿菌抗原可以游離形式及免疫復合物的形式存在，且幽門螺桿菌的游離形式可以通過本發明的ELISA容易地檢測，但免疫復合物不能容易地通過相同的方法檢測，這個事實示于表1。
表1是血清幽門螺桿菌摻加研究。被測樣本都不含有幽門螺桿菌抗原。盡管血清中不存在幽門螺桿菌，但是血清樣本中可能含有幽門螺桿菌抗體(即“抗體陽性樣本”)，這可能是由于原來的感染造成的，其與不含任何幽門螺桿菌抗體的樣本(即“抗體陰性樣本”)相反。在摻加組中，將已知量的幽門螺桿菌抗原(1×105細菌/ml)，不論是全細菌細胞或細胞裂解液，加入到“抗體陰性”及“抗體陽性”血清樣本中。在“非摻加”組中，不加入幽門螺桿菌抗原。
表1的結果表明在“抗體陰性”樣本中，由OD450/650讀數的增加反映出了幽門螺桿菌抗原的加入。相反，在“抗體陽性”樣本中加入幽門螺桿菌抗原不會將OD450/650讀數增加到與“抗體陰性”樣本中相同的水平。一個可能的解釋是加入的幽門螺桿菌抗原與血清幽門螺桿菌抗體形成了免疫復合物，其干擾ELISA檢測。
為了將血清幽門螺桿菌抗原的免疫復合物解離，可以用解離試劑或在樣本的解離條件下處理該血清樣本。有四種主要的解離試劑，其對解離這些免疫復合物很有效。第一種解離試劑是氯化鈉或氯化鉀的高鹽溶液。優選高鹽溶液的濃度至少是1M。優選的鹽是氯化鉀。第二種解離試劑是含洗滌劑如SDS、吐溫20、辛基葡糖苷、脫氧膽酸鹽或Triton X-100的溶液。這些洗滌劑可以單獨或聯合使用。此洗滌劑優選的濃度大于1％。第三種解離試劑是含離液劑如鹽酸胍、脲和硫氰酸鉀(KSCN)的溶液。這些離液劑的濃度可以大于2M。第四種解離試劑是含有機溶劑如10％二惡烷和40％乙二醇的溶液。
或者，該血清樣本可以在樣本解離的條件下處理，此條件可以是高或低pH，或者升高的溫度。優選的高pH是9或更高。優選的低pH是3或更低。優選的高溫是至少50℃。
表1.血清幽門螺桿菌抗原摻加研究

實施例10兔抗幽門螺桿菌抗體的親和純化A.制備親和柱將1至5克的幽門螺桿菌細胞糊懸浮于12.5ml PBS緩沖液(0.1M磷酸鈉、0.15M氯化鈉，pH7.2)，其中含有辛基葡糖苷，并在室溫下攪拌30分鐘。然后將此懸液在冰浴中以最大的輸出功率超聲波處理10分鐘，每分鐘的超聲波處理有1分鐘的時間間隔。超聲處理后，以25000g離心30分鐘除去不溶物。保留上清液并用PBS將蛋白濃度調節為1-3mg/mL。將在PBS中預平衡的氨基連接臂偶聯凝膠(由Pierce制備)以1-10mg蛋白每ml填充凝膠的比例加入到該上清液中，然后每毫升填充凝膠中加入存在于水中的10-40μl的5M硼氫化鈉。再將此反應漿在4℃下孵育過夜(至少6小時)，同時輕輕混合。孵育后，將此凝膠漿倒入適當大小的色譜柱中并排出過量的液體。然后，用兩個柱體積的偶聯緩沖液洗脫此柱，隨后用兩個柱體積的1M Tris HCl，pH7.4洗脫。將洗脫后的凝膠再懸浮于1個柱體積的1M TrisHCl，pH7.4。再懸浮后，每毫升填充凝膠加入10-40μl的5M硼氫化鈉。室溫下孵育所得懸浮液1小時，同時溫和地攪拌。然后排掉柱中的水，用PBS大量洗滌以除去柱中任何未結合的抗原。
B.通過親和柱純化抗體為了純化兔抗體，向等體積的兔血清中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，以沉淀幽門螺桿菌抗體。室溫下攪拌30分鐘后，離心30分鐘收集沉淀，在PBS中再溶解并用100倍過量的PBS透析。透析后，通過0.2μm過濾器將此溶液過濾，并加樣到此親和柱上。加樣后，用PBS充分洗滌此柱直到洗脫液到達基線。此柱中的抗幽門螺桿菌特異性抗體用3M KSCN水溶液洗脫。收集含免疫球蛋白的餾份并用PBS透析，最少換兩次透析液以除去過量的KSCN。然后，將純化的抗體濃縮至約1.0-2.0mg/ml并在-20℃下保存。
實施例11血清抗原ELISA試驗用標準方法將血清從全血中分離。按照實施例1收集游離的血清樣本。在20μg/ml和1.0μg/ml之間將親和純化的抗體在磷酸緩沖液中作系列稀釋。將每個稀釋液的0.1ml等份加入到Costar Strip Plate中，覆蓋并在室溫下孵育過夜。將此板用PBS洗滌一次并在室溫下用存在于PBS中的1％BSA封閉4小時。除去BSA溶液后，向此抗體包被的微孔條板中加入0.1ml游離形式的血清樣本，覆蓋并室溫下孵育2小時。然后，用PBS/吐溫洗滌液將此板洗滌5次。接著，向每個微孔中加入0.1ml與辣根過氧化物酶結合的兔抗幽門螺桿菌抗體，覆蓋并在室溫下孵育1小時。用PBS/吐溫洗滌液再將此板洗滌5次并在室溫下與0.1ml四甲基聯苯胺孵育10分鐘。在450nm測定顏色的變化。用0.1ml 1N硫酸停止此反應。將獲得最大光密度和最低本底的稀釋液選為最佳稀釋液。
表2和表3代表了在不同的時間用不同患者血清樣本進行的兩個試驗。這些試驗表明了血清ELISA檢測幽門螺桿菌的結果。第一個試驗(表2)包括5個對象。第二個試驗(表3)包括3個對象。結果以OD450/650表示。幽門螺桿菌的存在和定量可以在450nm波長下檢測(650nm表示檢測本底[即該板]的波長)。OD450/650表示了在OD450的讀數減去在OD650的讀數。OD450/650≤0.1的樣本表示陰性結果(即，沒有幽門螺桿菌感染)。
表2.血清ELISA試驗(試驗1)

取梯度稀釋的陽性標準模板(濃度為109-102copies/ul)，，進行熒光定量，總體積20ul，其中17.8ul PCR反應液，2ul梯度樣品(陽性標準模板、淋病奈瑟菌DNA樣品及解脲支原體、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、乳桿菌和大腸桿菌的DNA)，0.2ul Taq酶。反應條件95<p>表4清楚表明，就低本底讀數和高(更靈敏)陽性樣本讀數而言，親和純化的抗體和親和純化的酶結合物產生了最好的結果。親和純化的抗體用于板的兩側而酶結合物作為參考標準(檢測1)。所有的其它檢測結果與參考標準比較。當與參考標準比較時，由于升高的本底(即陰性樣本的較高OD)和陽性樣本的OD降低(檢測3)，DEAE板和DEAE結合物顯示了假陽性結果。用親和板代替DEAE板，陽性信號升高，但是較高的本底仍然存在，這導致了假陽性結果(檢測2)。通過降低DEAE結合物濃度至原來的50％，本底降低但是陽性信號也降低，這樣導致了假陰性結果(檢測4)。
表4.DEAE和親和純化抗體的比較

實施例13免疫色譜檢測免疫色譜檢測裝置有帶有兩個視窗的外部塑料盒“加樣視窗”和“結果觀察視窗”。此“加樣視窗”，向其中加入流動相，其中還含有“標記墊”或含第二種抗體的貯庫，該抗體用檢測試劑如免疫-金標記。將此墊置于加樣點和“結果觀察視窗”的較低邊界之間。“結果觀察視窗”在固定相上，其含有檢驗線，其用一級抗體定位，以及對照線，其用抗第二種抗體的抗體定位。此檢驗線在加樣點和對照線之間。
為了進行檢測，將4-6滴血清加入到該盒的樣本區。該樣本流經含純化的、與免疫-金的紅顏色或其它標記物偶聯的幽門螺桿菌抗體的標記墊。現在含標記的抗體的樣本將移動該檢驗條首先通過檢驗線，然后通過對照線。如此樣本中含有幽門螺桿菌抗原，此抗體將此抗原與紅色免疫-金偶聯，接著將與固定在硝酸纖維素膜上的幽門螺桿菌抗體結合，形成一條線。抗幽門螺桿菌抗體-抗原-抗體復合物被捕獲時，在結果視窗中可以看到一條紅色檢驗線(膜-抗體抗原抗體-紅色免疫-金)。此對照線用山羊抗兔抗體點滴。當該樣本流經(如果一種單克隆抗體用來偶聯有色顆粒，此對照線用山羊抗小鼠點滴)時，幽門螺桿菌-免疫-金-抗體被山羊抗兔線捕獲，以確保正確進行此試驗。
液體樣本，其中可能含有其它流動相，將從較低的部分移至較高的部分(色譜作用)，并且通過頂部吸收墊，所有過量的液體將排向此盒的上部。如果在此樣本中不含抗原，只有對照線在試驗的后期是看見的。如果存在抗原，將見到檢驗線。
經過對本發明的詳細描述并參考優選的實施例，對本領域技術人員來說在不背離本發明范圍的前題下，本發明的改良形式和變化形式是顯而易見的。
權利要求
1.檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是用得自幽門螺桿菌菌株的、對幽門螺桿菌具特異性的引物或寡核苷酸及/或DNA探針，來檢測幽門螺桿菌的核酸片段。
2.權利要求1所述的檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是通過聚合酶鏈反應，用一對特異性檢測幽門螺桿菌的引物檢測的。
3.權利要求2所述的檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述血液是血漿。
4.權利要求2所述的檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述引物對包括得自ATTC菌株43504、43571、43629和49053的幽門螺桿菌菌株的共有核苷酸序列。
5.權利要求1所述的檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是使用第一套和第二套特異性檢測幽門螺桿菌的寡核苷酸通過連接酶鏈反應測定的，其中第一套中的寡核苷酸彼此是連續的，第二套與第一套互補，第二套寡核苷酸彼此是連續的。
6.權利要求5所述的檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述第一套和第二套寡核苷酸含有得自ATTC菌株43504、43571、43629和49053的幽門螺桿菌菌株的共有核苷酸序列。
7.權利要求5所述的檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述連接酶鏈反應是用Pfu DNA連接酶進行的。
8.權利要求1所述的檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其是通過DNA雜交用幽門螺桿菌DNA探針檢測的。
9.權利要求8所述的檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述DNA探針是用放射性同位素或熒光物質標記的。
10.權利要求8所述的檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法，其中所述DNA雜交是在硝酸纖維素膜上制備的點狀DNA雜交。
全文摘要
本發明涉及在被感染個體的血液中發現和檢測幽門螺桿菌(H.pylori)抗原，并提供了檢測血液中幽門螺桿菌抗原的方法。此幽門螺桿菌抗原是幽門螺桿菌細胞的組分，其包括但不限于DNA、RNA、核苷酸、蛋白和肽片段。幽門螺桿菌DNA、RNA及核苷酸片段抗原通過聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)或DNA雜交方法或其它擴增方法檢測。幽門螺桿菌蛋白或肽或其其它抗原組分可通過免疫檢定或免疫印跡法用幽門螺桿菌抗體檢測，該抗體優選是通過親和柱純化的抗體。
文檔編號C12Q1/68GK1680605SQ20051006606
公開日2005年10月12日 申請日期2000年6月19日 優先權日2000年6月19日
發明者伊慶燧 申請人:蘇榮仁