專利名稱：可高產糖肽復合物的靈芝真菌及其誘變選育方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說是涉及一種可高產糖肽復合物的靈芝真菌，及其誘變選育方法和用途。
背景技術：
由于多年來在動物飼養和飼料中廣泛和長期使用抗生素、化學合成藥物、激素等促生長保健劑，導致畜禽和水產產品中藥物殘留嚴重、畜禽產品品質下降、細菌耐藥性增強、耐藥菌株增多，因而極大的威脅著人類健康和生態環境。由于抗生素的上述諸多副作用，和近年來消費者對食品安全問題的關注，世界各國都在紛紛禁用或限制抗生素的使用，并加速開發、推廣新型安全高效的綠色飼料添加劑，以減少或替代抗生素等藥物添加劑。
靈芝和靈芝糖肽復合物因其獨特的理化特性和神奇的生物學功能而成為新型綠色飼料添加劑領域的研究熱點。靈芝真菌的生長是孢子→菌絲體→子實體的過程。由于靈芝人工栽培生長周期過長(大于2-3個月)，且靈芝子實體糖肽復合物提取工序復雜，因此成本過高，難以滿足大規模工業生產的需要，從而限制了其在畜牧業中的應用；另一方面，研究發現，同種(株)靈芝真菌的菌絲體與子實體的糖肽復合物的分子量、組成、結構、比例、化學性質及生物學活性相似，因此采用生物發酵方法直接培養靈芝真菌絲體，再分別提取胞內、胞外糖肽復合物具有許多優點。與前者相比，生物發酵法只將靈芝真菌培養到菌絲體階段，且其糖肽復合物后提取工序簡單，生產周期縮短，生產效率得以提高。
在生物發酵生產的過程中，決定生產水平和生產成本高低的主要因素有三個生產菌種、發酵工藝和后提取工藝或后加工工藝，其中，最重要的是生產菌種的特性。從自然界分離出的菌種，由于生產能力低，往往不能滿足工業上的需要。因為在正常生理條件下，微生物依靠其代謝調節系統，菌體趨向于快速生長和繁殖。但是，發酵工業的期望或需要與此相反，需要微生物的代謝產物，如多糖或其它活性成分等，能夠大量積累。為此，采用種種方法來打破菌種的正常代謝，使之失去自我保守性的調節控制，從而大量積累我們所需要的目標代謝產物，如靈芝糖肽復合物。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術制備靈芝糖肽復合物飼料添加劑的成本高而不易于在動物養殖行業推廣使用的缺陷，通過原生質體紫外誘變技術選育一株可高產糖肽復合物的靈芝真菌，使其能經發酵生產出在飼料中添加量低、功能明確，具有提高動物體免疫力、抗病力，促進免疫系統生長發育，提高其奶、肉、蛋產量和生產能力，改善奶、肉、蛋的品質和風味，提高水產動物的生長速度和存活率，能廣泛用于禽、牛、羊、豬、水產和經濟動物，可作為抗生素的替代品等優點的靈芝糖肽復合物飼料添加劑。
本發明的另一目的在于提供一種可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法。
本發明的再一目的在于該可高產糖肽復合物的靈芝真菌用于液體發酵制備糖肽復合物飼料添加劑或免疫強化飼料添加劑等的應用。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供的可高產糖肽復合物的靈芝真菌，其分類命名為靈芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1251。
該靈芝真菌菌絲生長速度快，菌絲體為純白色，產孢子；需避光培養，其培養需Mg2+、K+等微量元素及B族維生素；高產糖肽復合物等生物活性物質。
本發明提供的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其誘變選育步驟如下1)出發菌株CAU55菌絲體的培養以本實驗室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發菌株；將出發菌株CAU55接種于滅菌固體培養基上，25～30℃固體培養5～10天；將培養好的菌株接種于滅菌液體培養基中，28～32℃搖瓶培養3～5天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基中，28～32℃搖瓶發酵培養3～5天，得到出發菌株CAU55菌絲體液，備用；所述的固體培養基為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O0.75～2.5g，瓊脂15～20g；所述的液體培養基為按下述比例配制的葡萄糖20～40g，蛋白胨2～4g，KH2PO40.5～2g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，蒸餾水1000ml；
2)出發菌株CAU55原生質體的制備酶解將步驟1)中培養的出發菌株CAU55菌絲體液于2000～4000r/min離心1～3min；去上清，加滅菌滲透壓穩定劑1～3ml，輕微振蕩后2000～4000r/min離心1～3min，此步驟重復操作2～3次；去上清后，按酶解液(ml)菌絲體重(g)1～4∶1的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，25～30℃培養1～3小時，備用；過濾將酶解好的菌絲體液過濾，再用少量滲透壓穩定劑沖洗濾膜，1000～3000r/min離心1～5min，得到出發菌株CAU55原生質體沉淀；所述滲透壓穩定劑為按下述比例配制的80～130g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用；3)原生質體的紫外誘變和再生培養將步驟2)所得出發菌株CAU55原生質體沉淀制成懸浮液，并調至原生質體個數為104～106個/ml，液層厚度0.2～0.4cm；進行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為15～18W，照射時間為0.5～5min，照射距離25～30cm；照射后立即稀釋涂布在原生質體再生培養基上，27～32℃培養6～10天，進行初篩，挑選10～40個菌絲體生長速度較快的單菌落，進行搖瓶發酵復篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復合物含量，選擇6～10株糖肽復合物高產菌株CAU550N，再分別做傳代穩定性實驗，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復合物產量最高且穩定性好的菌株CAU5501；所述原生質體再生培養基為按下述比例配制的D-纖維二糖10～15g，蛋白胨2～3.5g，酵母浸粉1.5～4g，KH2PO42～3g，MgSO4·7H2O 1.0～2.5g，VB120～50μg，滲透壓穩定劑1000ml；所述傳代穩定性實驗的步驟是將選出的6～10株糖肽復合物高產菌株CAU550N，分別接種到滅菌固體培養基上，25～30℃固體培養5～8天，培養好后再接種到滅菌固體培養基上，25～30℃固體培養5～8天，重復此步驟5～10次，觀察CAU550N的生長速度；將已傳種5～10代的CAU550N接種到液體培養基中，28～32℃搖瓶培養3～5天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基中，進行搖瓶發酵，28～32℃培養3～5天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復合物產量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產性能下降的菌株，保留生長速度快，生產性能優良、穩定的菌株，最后得到可高產糖肽復合物的靈芝真菌CAU5501，其分類命名為靈芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，保藏號為CGMCC No.1251。
本發明提供的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，還包括將得到的高產菌株CAU5501保存在固體培養基II上，4℃保藏，每3個月轉接一次。轉接用于該菌株的正常傳代，以防止菌株退化。
所述固體培養基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O0.75～2.5g，瓊脂15～20g。
本發明提供上述可高產糖肽復合物的靈芝真菌的用途，該可高產糖肽復合物的靈芝真菌可用于液體發酵制備糖肽復合物綠色飼料添加劑，或用于制備微生物飼料添加劑、免疫增強劑等微生物制劑。
與現有技術相比，本發明提供的可高產糖肽復合物的靈芝真菌及其制備方法的優點在于1.將原生質體技術和紫外誘變方法相結合進行處理，可多角度改變微生物的遺傳性能，保證變異菌株的穩定性，并提高誘變效率，易于建立優良再生無性變異株系；2.誘變方法不復雜，操作方便，效果明顯；3.用其發酵制備靈芝糖肽復合物飼料添加劑可明顯縮短生產周期達50％，降低發酵成本，使靈芝糖肽復合物在畜牧業中的應用成為可能；4.誘變選育的高產菌株可用于制備微生物飼料添加劑；5.誘變選育的高產菌株可用于制備飼用免疫增強(強化)劑。
具體實施例方式
實施例1、誘變選育本發明的可高產糖肽復合物的靈芝真菌按照本發明提供的誘變選育方法，誘變選育可高產糖肽復合物的靈芝真菌，其步驟如下1)出發菌株CAU55菌絲體的培養以本實驗室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發菌株；將出發菌株CAU55接種于滅菌固體培養基A上，27℃固體培養10天；將培養好的菌株接種于滅菌液體培養基B中，28℃搖瓶培養4天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基C中，32℃搖瓶發酵培養3天，得到出發菌株CAU55菌絲體液，備用；所述的固體培養基A為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖25g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂15g；所述的液體培養基B、C為按下述比例配制的葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸餾水1000ml；2)出發菌株CAU55原生質體的制備酶解將步驟1)中培養的出發菌株CAU55菌絲體液于滅菌離心管中，4000r/min離心2min；去上清，加滅菌滲透壓穩定劑3ml，輕微振蕩后3000r/min離心2min，此步驟重復操作2次；去上清后，將所得沉淀移至滅菌Eppendorf管中，差數稱重法稱重，記錄菌絲體重量；按酶解液(ml)∶菌絲體重(g)1∶1的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，25℃培養1小時，備用；過濾用滅菌濾器將酶解好的菌絲體液過濾至另一滅菌Eppendorf管中，再用少量滲透壓穩定劑沖洗濾膜，3000r/min離心3min，得到出發菌株CAU55原生質體沉淀；所述滲透壓穩定劑為按下述比例配制的100g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用；3)原生質體的紫外誘變和再生培養將步驟2)所得出發菌株CAU55原生質體沉淀制成懸浮液，并調至原生質體個數為106個/ml，液層厚度0.4cm；進行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為15W，照射時間為3min，照射距離30cm；照射后立即稀釋涂布在原生質體再生培養基D上，27℃培養9天，進行初篩，挑選20個菌絲體生長速度較快的單菌落，進行搖瓶發酵復篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復合物含量，選擇10株糖肽復合物高產菌株CAU550N，再分別做傳代穩定性實驗，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復合物產量最高且穩定性好的菌株CAU5501；所述原生質體再生培養基D為按下述比例配制的D-纖維二糖10g，蛋白胨3g，酵母浸粉2g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1.5g，VB120μg，滲透壓穩定劑1000ml；所述傳代穩定性實驗的步驟是將選出的10株糖肽復合物高產菌株CAU550N，分別接種到滅菌固體培養基A上，25℃固體培養8天，培養好后再接種到滅菌固體培養基A上，25℃固體培養8天，重復此步驟8次，觀察CAU550N的生長速度；將已傳種8代的CAU550N接種到液體培養基B中，28℃搖瓶培養5天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基B中，進行搖瓶發酵，30℃培養3天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復合物產量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產性能下降的菌株，保留生長速度快，生產性能優良、穩定的菌株，最后得到可高產糖肽復合物的靈芝真菌CAU5501。
將得到的高產菌株CAU5501保存在固體培養基II上，4℃保藏，每3個月轉接一次。轉接用于該菌株的正常傳代，以防止菌株退化。
所述固體培養基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖30g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 2g，瓊脂20g。
實施例2、誘變選育本發明的可高產糖肽復合物的靈芝真菌按照本發明提供的誘變選育方法，誘變選育可高產糖肽復合物的靈芝真菌，其步驟如下1)出發菌株CAU55菌絲體的培養以本實驗室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發菌株；將出發菌株CAU55接種于滅菌固體培養基A上，25℃固體培養10天；將培養好的菌株接種于滅菌液體培養基B中，30℃搖瓶培養3天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基C中，30℃搖瓶發酵培養3天，得到出發菌株CAU55菌絲體液，備用；所述的固體培養基A為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂20g；所述的液體培養基B、C為按下述比例配制的葡萄糖20g，蛋白胨2.5g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸餾水1000ml；2)出發菌株CAU55原生質體的制備酶解將步驟1)中培養的出發菌株CAU55菌絲體液于滅菌離心管中，2000r/min離心3min；去上清，加滅菌滲透壓穩定劑2ml，輕微振蕩后2000r/min離心3min，此步驟重復操作2次；去上清后，將所得沉淀移至滅菌Eppendorf管中，差數稱重法稱重，記錄菌絲體重量；按酶解液(ml)菌絲體重(g)2∶1的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，30℃培養1小時，備用；過濾用滅菌濾器將酶解好的菌絲體液過濾至另一滅菌Eppendorf管中，再用少量滲透壓穩定劑沖洗濾膜，3000r/min離心2min，得到出發菌株CAU55原生質體沉淀；所述滲透壓穩定劑為按下述比例配制的130g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用；3)原生質體的紫外誘變和再生培養將步驟2)所得出發菌株CAU55原生質體沉淀制成懸浮液，并調至原生質體個數為105個/ml，液層厚度0.2cm；進行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為15W，照射時間為2.5min，照射距離25cm；照射后立即稀釋涂布在原生質體再生培養基D上，30℃培養6天，進行初篩，挑選40個菌絲體生長速度較快的單菌落，進行搖瓶發酵復篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復合物含量，選擇6株糖肽復合物高產菌株CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501，再分別做傳代穩定性實驗，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復合物產量最高且穩定性好的菌株CAU5501；所述原生質體再生培養基D為按下述比例配制的D-纖維二糖12g，蛋白胨2.0g，酵母浸粉2.5g，KH2PO42.0g，MgSO4·7H2O1.5g，VB150μg，滲透壓穩定劑1000ml；所述傳代穩定性實驗的步驟是將上述步驟選出的6株糖肽復合物高產菌株CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501，分別接種到滅菌固體培養基A上，26℃固體培養6天，培養好后再接種到滅菌固體培養基A上，26℃固體培養6天，重復此步驟10次，觀察CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501的生長速度；將已傳種10代的CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501分別接種到液體培養基B中，30℃搖瓶培養4天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基B中，進行搖瓶發酵，30℃培養5天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復合物產量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產性能下降的菌株，保留生長速度快，生產性能優良、穩定的菌株，最后得到可高產糖肽復合物的靈芝真菌CAU5501。
將此得到的高產菌株CAU5501保存在固體培養基II上，4℃保藏，每3個月轉接一次。轉接用于該菌株的正常傳代，以防止菌株退化。
所述固體培養基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖25g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.75g，瓊脂17g。
實施例3、誘變選育本發明的可高產糖肽復合物的靈芝真菌按照本發明提供的誘變選育方法，誘變選育可高產糖肽復合物的靈芝真菌，其步驟如下1)出發菌株CAU55菌絲體的培養以本實驗室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發菌株；將出發菌株CAU55接種于滅菌固體培養基A上，30℃固體培養10天；將培養好的菌株接種于滅菌液體培養基B中，32℃搖瓶培養4天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基C中，32℃搖瓶發酵培養5天，得到出發菌株CAU55菌絲體液，備用；所述的固體培養基A為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖30g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 2.5g，瓊脂20g；所述的液體培養基B、C為按下述比例配制的葡萄糖40g，蛋白胨4g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸餾水1000ml；2)出發菌株CAU55原生質體的制備酶解將步驟1)中培養的出發菌株CAU55菌絲體液于滅菌離心管中，3000r/min離心1min；去上清，加滅菌滲透壓穩定劑1ml，輕微振蕩后4000r/min離心1min，此步驟重復操作3次；去上清后，將所得沉淀移至滅菌Eppendorf管中，差數稱重法稱重，記錄菌絲體重量；按酶解液(ml)∶菌絲體重(g)4∶1的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，28℃培養3小時，備用；過濾用滅菌濾器將酶解好的菌絲體液過濾至另一滅菌Eppendorf管中，再用少量滲透壓穩定劑沖洗濾膜，1000r/min離心5min，得到出發菌株CAU55原生質體沉淀；所述滲透壓穩定劑為按下述比例配制的80g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用；3)原生質體的紫外誘變和再生培養將步驟2)所得出發菌株CAU55原生質體沉淀制成懸浮液，并調至原生質體個數為104個/ml，液層厚度0.3cm；進行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為18W，照射時間為1min，照射距離25cm；照射后立即稀釋涂布在原生質體再生培養基D上，32℃培養10天，進行初篩，挑選10個菌絲體生長速度較快的單菌落，進行搖瓶發酵復篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復合物含量，選擇6株糖肽復合物高產菌株CAU550N，再分別做傳代穩定性實驗，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復合物產量最高且穩定性好的菌株CAU5501；所述原生質體再生培養基D為按下述比例配制的D-纖維二糖15g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉4g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，VB140μg，滲透壓穩定劑1000ml；所述傳代穩定性實驗的步驟是將選出的6株糖肽復合物高產菌株CAU550N，分別接種到滅菌固體培養基A上，30℃固體培養5天，培養好后再接種到滅菌固體培養基A上，30℃固體培養5天，重復此步驟5次，觀察CAU550N的生長速度；將已傳種5代的CAU550N接種到液體培養基B中，32℃搖瓶培養3天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基B中，進行搖瓶發酵，32℃培養5天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復合物產量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產性能下降的菌株，保留生長速度快，生產性能優良、穩定的菌株，最后得到可高產糖肽復合物的靈芝真菌CAU5501。
將此得到的高產菌株CAU5501保存在固體培養基II上，4℃保藏，每3個月轉接一次。轉接用于該菌株的正常傳代，以防止菌株退化。
所述固體培養基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 0.75g，瓊脂15g。
對上述三個實施例所得可高產糖肽復合物的靈芝真菌CAU5501的菌絲生長速度、產糖肽復合物能力進行測試，實施例2所得可高產糖肽復合物的靈芝真菌菌絲生長速度最快，為7.34cm/7d，其產胞外糖肽復合物能力也最強，為2.45mg/ml。將實施例2所得可高產糖肽復合物的靈芝真菌CAU5501于2004年11月22日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，分類命名為靈芝Ganoderma Lucidum，其保藏號為CGMCC No.1251。
菌絲生長速度是衡量靈芝真菌株生長性能的有效指標，也是縮短生產周期的關鍵。菌絲生長速度＝斜面培養基菌絲生長長度/天數(所述天數為7天)。實施例2中各步驟突變株與母株的菌絲生長速度列于表1。
表1、出發菌株與誘變株的菌絲生長速度和胞外糖肽復合物產量的比較

靈芝胞外糖肽復合物產量(mg/ml)，與靈芝糖肽復合物總產量呈正相關，是衡量靈芝真菌生產性能的重要指標，也是衡量靈芝糖肽復合物總產量的關鍵指標。測定時先利用多糖類化合物不溶于有機溶劑(乙醇)的原理將其沉淀，再利用苯酚-硫酸試劑可與多糖或糖肽中的己糖起顯色反應的原理，使其充分反應，由于己糖在490nm處有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關系，因此，根據其吸收值可得胞外糖肽復合物的產量。
苯酚-硫酸顯色法測定靈芝胞外糖肽復合物產量的方法如下標準曲線的繪制首先配制標準葡萄糖溶液，其濃度為3mg/ml，搖勻備用；然后嚴格按下表2所列加樣量順序加樣。
表2、葡萄糖、5％苯酚、濃硫酸的加樣量

按表2在編號試管中加入葡萄糖溶液和蒸餾水，再加5％苯酚溶液1ml，混勻后緩慢滴加濃硫酸4ml，振蕩混勻，冷卻至室溫，放置20分鐘，以第一管調零點，在490波長處測定吸收度。以葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光度值(OD值)為縱坐標，繪制標準曲線。
樣品胞外糖肽復合物含量的測定取用乙醇處理好的樣品液3ml，4000r/m下離心20分鐘，沉淀用1ml蒸餾水溶解，再加入5％苯酚溶液1ml，混勻后緩慢滴加濃硫酸4ml，振蕩混勻，冷卻至室溫，放置20分鐘，490波長處測OD值，根據標準曲線得其胞外糖肽復合物含量。實施例2中各步驟突變株與母株的產胞外糖肽復合物的能力比較列于表1。
實施例4、利用本發明的可高產糖肽復合物的靈芝真菌作為液體發酵制備糖肽復合物飼料添加劑利用本發明的可高產糖肽復合物的靈芝真菌作為液體發酵制備糖肽復合物飼料添加劑的具體用法如下1)制備種子液將本發明的實施例2制得的可高產糖肽復合物的靈芝真菌(Ganoderma Lucidum)接入滅菌后的液體培養基中，于28～32℃培養3～5天，得到種子液；所述液體培養基按以下比例配制葡萄糖20～40g，蛋白胨2～4g，KH2PO40.5～2g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，蒸餾水1000ml。
2)發酵制備糖肽復合物飼料添加劑將發酵底物粉碎到40～120目后放入發酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量與發酵底物的重量份配比為100∶3～20，所加入碳源的含碳量與發酵底物的含氮量的重量份配比為10～80∶1，將發酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃滅菌10～30分鐘，冷卻到25℃，再加入上述步驟制備的種子液，種子液和發酵液的體積比為0.3～15∶100，混合均勻后在25～32℃，以0.5～2.5vvm的速度通入無菌空氣，以80～200rpm速度攪拌發酵3～7天，得到糖肽復合物發酵液，于140～145℃滅菌2～8秒，得到液態糖肽類飼料添加劑；還可將該糖肽復合物飼料添加劑進行超濾、濃縮、干燥等，得到粉狀糖肽類飼料添加劑；另外，通過發酵工業的后提取工藝(浸提、醇沉等)，可將發酵液和菌絲體分別提取胞外、胞內糖肽復合物，得到精制糖肽類飼料添加劑——糖肽復合物飼料添加劑。
所述的發酵底物(即碳源)為選自玉米面、酒糟、麩皮、紅糖、食用白糖、玉米糖漿、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜中的一種或幾種的混合物；所述的氮源為選自大豆蛋白、谷蛋白中的一種或幾種的混合物；所述的大豆蛋白包括大豆分離蛋白、豆粕、豆餅、大豆；所述的谷蛋白包括玉米蛋白、玉米蛋白粉和小麥蛋白。
制備的糖肽類飼料添加劑具有多種用途1)該糖肽類飼料添加劑可提高畜禽的抗體水平和細胞免疫功能，增強免疫力和抗病力，減少病死率。
2)該糖肽類飼料添加劑能明顯刺激動物免疫器官的生長發育，提高動物的健康水平。
3)該糖肽類飼料添加劑無毒、無殘留，具有抑制有害菌和消炎的作用，可作為抗生素替代產品，用于調節家畜、家禽腸道微生物區系平衡。
4)該糖肽類飼料添加劑有調節營養物質代謝，降血脂、膽固醇，降血糖的作用，提高畜產品品質。
5)該糖肽類飼料添加劑能提高動物的生產性能，如提高生長速度、節約飼料、降低生產成本等。
實施例5、實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑對肉仔雞生產性能的影響。
將1日齡公母混合的健康愛維因肉雞500只，隨機分成5個處理，每個處理100只，每個處理分為5個重復，每個重復20只雞。5個處理分別為A組，空白對照組，僅飼喂肉仔雞基礎日糧；B組，抗生素組，除飼喂肉仔雞基礎日糧外，每噸飼料添加3.2g安來霉素(常用量)；C組，靈芝糖肽復合物飼料添加劑組，除飼喂肉仔雞基礎日糧外，每噸飼料添加1kg實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑，其中有效成分2.5g/t飼料；D組，靈芝糖肽復合物飼料添加劑組，除飼喂肉仔雞基礎日糧外，每噸飼料添加3kg實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑，其中有效成分7.5g/t飼料；E組，靈芝糖肽復合物飼料添加劑組，除飼喂肉仔雞基礎日糧外，每噸飼料添加5kg實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑，其中有效成分12.5g/t飼料。
糖肽復合物對肉仔雞生產性能的影響結果列于表3。
表3、糖肽復合物飼料添加劑在肉仔雞生產性能的影響 注同行數字右肩標有不同大寫字母(A、B、C)者為差異達極顯著(P＜0.01)，同行數字右肩標有不同小寫字母者(a，b，c)為差異顯著(P＜0.05)，有相同字母者或無字母標注者為差異不顯著(p＞0.05)。A、B、C、a，b，c為統計學上顯著性檢驗的表示方法。
從表3可以看出，在1～4周和1～7周，D組的日增重效果最好，在1～4周D組的日增重和其它組存在極顯著差異(P＜0.01)。在整個飼養周期(1～7周)中，隨著糖肽復合物添加量的增加，肉仔雞日增重先上升后下降，D組的日增重是峰值和其它組差異顯著(P＜0.05)；且隨著糖肽復合物添加量的增加，肉仔雞生長的料肉比先下降后上升，D組的料肉比最小，但與其它組相比差異不顯著(p＞0.05)。從表中可以看出D組(7.5g/t糖肽復合物添加組)和B組(抗生素組)相比，日增重相似，但料肉比較低，說明D組效果好于B組。總之，本試驗表明，在肉仔雞飼料中添加糖肽復合物飼料添加劑可提高家禽日增重，降低料肉比，提高生產性能，降低生產成本。
實施例6、實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑在養豬生產中應用為檢驗本發明的產品的功效和在養豬業上的應用效果，以及代替抗生素的可行性。試驗選取體重接近健康的35日齡斷奶仔豬(公母各半)180頭分為5個處理，每個處理(組)36頭豬，每個處理6個重復，每個重復6頭豬，均為3公3母，試驗期8周(2個月)，試驗結果列于表4。5個處理如下所示空白對照組不添加任何添加劑，僅飼喂豬基礎日糧；抗生素對照組粉劑金霉素100mg/kg，均勻混合于基礎日糧中；靈芝糖肽復合物1組5mg/kg實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑，均勻混合于基礎日糧中；靈芝糖肽復合物2組10mg/kg實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑，均勻混合于基礎日糧中；靈芝糖肽復合物3組15mg/kg實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑，均勻混合于基礎日糧中。
表4、在養豬生產中的使用效果

從表5可以看出，添加了實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑的3個組的平均日增重和飼料轉化效率均好于空白對照組，可明顯提高豬只的生產性能，即日增重和飼料轉化效率。其中靈芝糖肽復合物2組(有效成分120mg/kg飼料)的平均日增重和飼料轉化效率顯著好于空白對照組及抗生素組，完全可以替代抗生素。
實施例7、使用實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑作為免疫強化飼料添加劑對肉雞肉免疫器官的影響(見表5)。
表5、靈芝糖肽復合物添加劑對肉雞免疫器官生長發育的影響 注1)免疫器官指數指免疫器官(胸腺、脾臟、法氏囊等)重量與動物體重量的比值；上表BW指肉雞體重。2)同行數字右肩標有不同大寫字母(A、B、C)者為差異達極顯著(P＜0.01)，同行數字右肩標有不同小寫字母者(a，b，c)為差異顯著(P＜0.05)，有相同字母者或無字母標注者為差異不顯著(p＞0.05)。A、B、C、a，b，c為統計學上顯著性檢驗的表示方法。
從表5可以看出，隨著靈芝糖肽復合物添加量的增加，肉雞免疫器官胸腺、脾臟增重上升，但未形成顯著差異(p＞0.05)。隨著靈芝糖肽復合物添加量的增加，肉雞法氏囊增重上升，且差異顯著(P＜0.05)；糖肽復合物組與抗生素組間的法氏囊增重差異不顯著(p＞0.05)，但各糖肽復合物添加組與空白對照組的差異均極顯著(P＜0.01)。總之，本試驗表明，在禽飼料中添加實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑，可促使家禽免疫器官增重、提高抗體滴度，增強其免疫力；且可完全替代抗生素，以消除抗生素的藥物殘留及毒副作用。
實施例8、實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑對雞的牛血清白蛋白(BSA)抗體效價的影響為檢測本發明實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑對肉雞對牛血清白蛋白(BSA)特異性抗體效價的影響，將肉仔雞分為5個組，每個組分成5個重復，每個重復20只雞，試驗期為7周。試驗設計見表6，基礎日糧配比及營養水平見表7。分別于35日齡、42日齡給肉雞左右腿肌各注射牛血清白蛋白0.5ml(牛血清白蛋白濃度為2.5mg/kg)。
表6、肉雞飼養試驗設計

表7、肉仔雞日糧配方及營養水平

注預混料向每千克全價料提供Cu 6mg，Fe 75mg，Zn 75mg，Mn 80mg，Se 0.2mg，10.4mg，沸石粉1mg，膽堿3mg。維生素A 6000IU，維生素D3 2000IU，維生素E 12IU，維生素K3 2mg，生物素0.05mg，葉酸0.4mg，煙酸32mg，泛酸7mg，維生素B1 1mg，維生素B2 5mg，維生素B6 1mg，維生素B12 10ug。
于28日齡、49日齡每組組取12只雞心臟采血，然后3000rpm離心10min分離血清，凍存于-20℃冰箱中，用酶聯免疫方法(ELISA)檢測BSA抗體效價，結果以OD值表示，見表8。
表8、添加糖肽復合物對28日齡肉仔雞BSA抗體效價的影響

注同行數字右肩標有不同大寫字母(A、B、C)者為差異達極顯著(P＜0.01)，同行數字右肩標有不同小寫字母者(a，b，c)為差異顯著(P＜0.05)，有相同字母者或無字母標注者為差異不顯著(p＞0.05)。A、B、C、a，b，c為統計學上顯著性檢驗的表示方法。
從表8可以看出，隨著實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑添加量的增加，肉雞體內牛血清白蛋白抗體效價上升，死亡率下降，E組與其他各組相比差異顯著(P＜0.05)。此外，添加糖復合物組的肉仔雞的抗體效價明顯高于空白對照組和抗生素組，特別是E組更為顯著。說明實施例4制得的糖肽復合物飼料添加劑可明顯提高肉仔雞的抗體效價(抗體效價是衡量機體抵抗病原能力的重要指標，抗體效價高即表明機體的抗病力強)，并明顯降低死亡率。
權利要求
1.一種可高產糖肽復合物的靈芝真菌，其分類命名為靈芝真菌GanodermaLucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1251。
2.一種權利要求1所述的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其誘變選育步驟如下1)出發菌株CAU55菌絲體的培養以本實驗室于4℃保存，購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發菌株；將出發菌株CAU55接種于滅菌固體培養基上，25～30℃固體培養5～10天；將培養好的菌株接種于滅菌液體培養基中，28～32℃搖瓶培養3～5天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基中，28～32℃搖瓶發酵培養3～5天，得到出發菌株CAU55菌絲體液，備用；2)出發菌株CAU55原生質體的制備酶解將步驟1)中培養的出發菌株CAU55菌絲體液離心，去上清，加滅菌滲透壓穩定劑1～3ml，振蕩后離心，此步驟重復操作2～3次；去上清后，按酶解液菌絲體重1～4ml∶1g的比例，在菌絲體沉淀中加入濾菌后的酶解液，充分振蕩，25～30℃培養1～3小時，備用；過濾將酶解好的菌絲體液過濾，得到出發菌株CAU55原生質體沉淀；3)原生質體的紫外誘變和再生培養將步驟2)所得出發菌株CAU55原生質體沉淀制成懸浮液，并調至原生質體個數為104～106個/ml，液層厚度0.2～0.4cm；進行紫外線誘變，紫外線誘變所用紫外燈功率為15～18W，照射時間為0.5～5min，照射距離25～30cm；照射后立即稀釋涂布在原生質體再生培養基上，27～32℃培養6～10天，進行初篩，挑選10～40個菌絲體生長速度較快的單菌落，進行搖瓶發酵復篩，用苯酚-硫酸法測定其糖肽復合物含量，選擇6～10株糖肽復合物高產菌株CAU550N，再分別做傳代穩定性實驗，選出一株菌絲生長速度最快，糖肽復合物產量最高且穩定性好的菌株，即為本發明的可高產糖肽復合物的靈芝真菌CAU5501，其分類命名為靈芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，保藏號為CGMCC No.1251。
3.如權利要求2所述的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟1)的固體培養基為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O 0.75～2.5g，瓊脂15～20g。
4.如權利要求2所述的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟1)的液體培養基為按下述比例配制的葡萄糖20～40g，蛋白胨2～4g，KH2PO40.5～2g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，蒸餾水1000ml。
5.如權利要求2所述的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟2)的滲透壓穩定劑為按下述比例配制的80～130g葡萄糖溶于1000ml蒸餾水中，滅菌備用。
6.如權利要求2所述的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟3)的原生質體再生培養基為按下述比例配制的D-纖維二糖10～15g，蛋白胨2～3.5g，酵母浸粉1.5～4g，KH2PO42～3g，MgSO4·7H2O 1.0～2.5g，VB120～50μg，滲透壓穩定劑1000ml。
7.如權利要求2所述的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述步驟3)的傳代穩定性實驗的步驟是將選出的6～10株糖肽復合物高產菌株CAU550N，分別接種到滅菌固體培養基上，25～30℃固體培養5～8天，培養好后再接種到滅菌固體培養基上，25～30℃固體培養5～8天，重復此步驟5～10次，觀察CAU550N的生長速度；將已傳種5～10代的CAU550N接種到液體培養基中，28～32℃搖瓶培養3～5天，再將培養好的種子液接種于滅菌液體培養基中，進行搖瓶發酵，28～32℃培養3～5天，得菌絲體液，分別測定它們的糖肽復合物產量，剔除菌種退化，生長速度下降或生產性能下降的菌株，保留生長速度快，生產性能優良、穩定的菌株，最后得到可高產糖肽復合物的靈芝真菌CAU5501。
8.如權利要求2所述的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于該方法還包括將得到的高產菌株CAU5501保存在固體培養基II上，4℃保藏，每3個月轉接一次。
9.如權利要求8所述的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的誘變選育方法，其特征在于所述固體培養基II為按下述比例配制的馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O 0.75～2.5g，瓊脂15～20g。
10.一種權利要求1所述的可高產糖肽復合物的靈芝真菌的用途，該可高產糖肽復合物的靈芝真菌可用于液體發酵制備糖肽復合物飼料添加劑，或用于制備微生物飼料添加劑和免疫增強劑。
全文摘要
本發明涉及一種可高產糖肽復合物的靈芝真菌，及其誘變選育方法和用途。該靈芝真菌其分類命名為靈芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1251。其誘變選育步驟包括以購自《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，菌種保藏號為CGMCC 5.533的靈芝真菌CAU55作為出發菌株，依次于固體培養基、液體培養基上培養，得到出發菌株CAU55菌絲體液；將此菌絲體液酶解、過濾，得到出發菌株CAU55原生質體沉淀；再將此原生質體進行紫外誘變和再生培養，最后得到可高產糖肽復合物的靈芝真菌CAU5501。該可高產糖肽復合物的靈芝真菌可用于液體發酵制備糖肽復合物飼料添加劑，或用于制備益生素、免疫增強劑等微生制劑。
文檔編號C12N1/14GK1854288SQ20051006611
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月21日 優先權日2005年4月21日
發明者張日俊, 鉏曉艷, 王錚 申請人:中國農業大學