專利名稱：喹唑啉生物堿類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及用黃灰青霉真菌SP-19，enicillium auratiogriseum SP-19)(保藏編號是CCTCC M205048)制備喹唑啉生物堿類化合物的方法；本發明還涉及該類化合物在制備細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術：
有關喹唑啉生物堿類化合物的研究報道只有3篇，該類化合物首次是由英國人也是從黃灰青霉真菌(Penicillium auratiogriseum)分離得到Anacine，但當時結構定的不對(Boyes-Korkis，J.M.；Gurney，K.A.；Penn，J；et al.Anacine，a new benzodiazepine metabolite of Penicilliumaurantiogriseum produced with other alkaloids in submerged fermentation.J.Nat.Prod.1993，56(10)，1707-1717)；繼而由Larsen等修正了Anacine的結構，(Larsen，T.O；Franzyk，H；Jensen，S.R.UV-guided isolation of verrucines A and B，novel quinazolines fromPenicillium verrucosum structurally related to anacine from Penicillium aurantiogriseum.J.Nat.Prod.1999，62(11)，1578-1580)；最后由Wang等人合成了該化合物，從而進一步證實其結構的正確(Wang，H；Sim，M.M.Total Solid Phase Syntheses of the Quinazoline AlkaloidsVerrucines A and B and Anacine.J.Nat.Prod.2001，64(12)，1497-1501)；關于該化合物的活性未見任何報道。本發明人研究發現黃灰青霉真菌SP-19(Penicillium auratiogriseum SP-19)(保藏編號是CCTCC M205048)液體發酵產物經超聲破碎后的粗提物有很好的細胞周期抑制活性，遂對其活性成分進行了研究，結果發現了3個新的喹唑啉生物堿類化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見任何對這3個化合物的化學結構及細胞增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此有關的藥物。

發明內容
本發明旨在提供一種結構獨特的具有細胞增殖抑制以及直接殺傷癌細胞等抗腫瘤活性的新化合物。
本發明的目的還在于提供一類新化合物的制備方法及其新化合物在制備腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
本發明首次從黃灰青霉真菌SP-19(Penicillium auratiogriseum SP-19)發酵物中發現了結構新穎的喹唑啉生物堿類化合物，如式I、式II所示
式I 式II其結構特征是式I、式II化合物的基本骨架為喹唑啉，其中R1為氫、烴基、羥基或酰基，R2、R3為氫、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
優選的本發明化合物是所述的式I化合物1和化合物2的R1、R2均為氫，化合物1的R3為羥基，化合物2的R3為甲氧基；式II化合物3的R1、R2均為氫。
上述發明中最優選的化合物是由海洋來源的黃灰青霉真菌SP-19(Penicilliumauratiogriseum SP-19)的液體發酵物經硅膠柱層析，以石油醚、石油醚-氯仿、氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫。氯仿-甲醇95∶5的洗脫物，再經Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)，再經制備HPLC，以甲醇-水70∶30洗脫得式I、式II化合物。
本發明采用MTT法測試了式I、式II化合物對P388、HL60、BEL-7402和A549細胞株的抗腫瘤活性。實驗證實，式I、式II化合物對這四種腫瘤細胞均有增殖抑制作用。
因此本發明的式I、式II化合物可用作細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑。
式I、式II化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。
式I、式II化合物還可作為抑制細胞增殖的低分子生物探針用于生命科學研究，作為探針應用時，式I、式II化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應用。
本發明的式I、式II化合物可通過微生物發酵培養，然后從發酵物中分離純化而得到；也可由上述優選化合物經本領域技術人員熟知的化學修飾方法合成獲得。
需要特別說明的是，經發酵微生物制取本發明式I、式II化合物的方法可采用其它任何能生產該類化合物的微生物，只要能生產該類化合物的微生物均可作為生產菌用于制備式I、式II化合物。
黃灰青霉真菌SP-19(Penicillium auratiogriseum SP-19)株由從青島近海羽毛山海綿[Mycale plumosa(CarTer)]中分離得到，并經分類學研究鑒定為黃灰青霉真菌SP-19(Penicillium auratiogriseum SP-19)。該菌株已于2005年5月26日保藏在中國典型培養物保藏中心(保藏編號CCTCC M205048)。該菌株具有如下微生物菌學特征菌落在查氏培養基上生長適度，25-28℃12天，直徑37-40毫米，質地絨狀至顆粒狀，邊緣灰綠色，中部黃褐色，反面淡黃綠色。分生孢子梗發生于基質菌絲和孢梗束，孢梗莖12-500×3.0-4.0微米，壁粗糙；帚狀枝三輪生，每個帚狀枝有副枝2-3個，14-25×3.0-4.0微米，壁粗糙；梗基每輪4-6(8)個，8-12×2.5-3.0微米；分生孢子球形或近球形，3.0-4.0微米，光滑，分生孢子鏈呈長柱狀。
需要特別說明的是，經發酵微生物制取本發明式I化合物的方法可采用其它任何能生產喹唑啉生物堿類化合物的微生物，只要能生產該類化合物的微生物均可用作產素菌用于制備式I化合物。
具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物的化學結構是(結構式中的阿拉伯數字是化學結構中碳原子的標位)式I、式II化合物，其中R1為氫、烴基、羥基或酰基，R2，R3為氫，氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
式I式II其中式I化合物1和化合物2的R1、R2均為氫，化合物1的R3為羥基，化合物2的R3為甲氧基；式II化合物3的R1、R3均為氫。
實施例1化合物1、2、3的發酵生產及分離精制1 發酵生產生產菌的發酵培養按培養微生物的常規方法，取黃灰青霉真菌SP-19(Penicilliumauratiogriseum SP-19)(保藏編號為CCTCC M205048)適量，接種到PDA斜面培養基上，在28攝氏度培養箱中培養5天。
取斜面培養5天的黃灰青霉真菌SP-19(Penicillium auratiogriseum SP-19)適量，接種到裝有150mL培養液[培養基組成(％)Sorbitol 2％、maltose 2％、glutamine 1％、KH2PO40.05％、MgSO47H2O 0.03％、tryptophan 0.05％、Yeast ext.0.3％、pH 6.5]的500mL錐型瓶中，在28℃、120轉/分鐘條件下搖床培養48小時，獲得種子培養液。將該種子培養液按5％接種量分別接種于裝有200毫升生產培養液(培養基組成同上)的500mL三角燒瓶中，裝載于28℃、120轉/分鐘搖床上，進行為期9天的生產發酵，獲得菌絲體和發酵液。
2 浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發酵液減壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發酵液的浸膏，共20克。
3 化合物的分離精制浸膏(20克)甲醇溶解后，加60克200-300目硅膠H(青島海洋化工集團公司產品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以石油醚、石油醚-氯仿、氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，分為10個流份。組分4(1.5克，氯仿-甲醇95∶5洗脫物)，經Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)，再經HPLC，以甲醇-水70∶30洗脫得化合物1(22mg)、2(16mg)和3(9mg)。
化合物1白色無定型粉末，[α]D17+172°(c1.8，CH3OH)；HRESIMS397.1267[M+K]+，UVλmax(CH3OH)nm(logε)280(4.60)，311(4.28)；IR ν(KBr，cm-1)3217，2958，1632，1606，1471，1388，1162，773，674；1H及13C NMR數據見表1。


化合物2白色無定型粉末，[α]D17+718°(c 13.9，CHCl3)；HRESIMS373.1862[M+H]+，UVλmax(CH3OH)nm(logε)282(3.90)，311(3.71)；IRν(KBr，cm-1)3196，2958，1633，1605，1471，1387，1321，1155，1043，771，673；1H及13C NMR數據見表2。

化合物3白色無定型粉末，白色無定型粉末，[α]D17+44°(c 1.6，CHCl3)；HRESIMS341.1617[M+H]+，UVλmax(CH3OH)nm(logε)314(4.48)；IRν(KBr，cm-1)3197，2959，2919，2859，1634，1607，1582，1561，1460，1392，1321，764，665；1H及13C NMR數據見表2。


實施例2 抗腫瘤活性的測試1 實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的純品化合物1、2、3。準確稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供活性測試。
細胞系及細胞的繼代培養活性測試采用P388、HL60、BEL-7402和A549細胞系。各種細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養基，在37℃通入5％二氧化碳的培養箱中繼代培養。
細胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)本發明采用MTT法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性。活細胞線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑為藍紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通過酶標儀測定其吸收度求得。由于formazan的量與活細胞數成正比，所以可根據吸收度求出活細胞的數目，從而了解藥物抑制或殺傷腫瘤細胞的能力。
活性測試時，取對數生長期的P388、HL60、BEL-7402和A549細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基配制成密度為每毫升5×104個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，在37℃下培養24小時后，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，繼續培養72小時。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培養4小時，移出150μL培養液后加入150μL DMSO溶解formazan，在540nm處測定其吸收度。按照IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
2 實驗結果化合物1、2、3的細胞增殖抑制活性分別示于表4、5、6



3 結論化合物1、2、3對包括人在內的哺乳動物來源的癌細胞具有抗腫瘤作用。因此，本發明的式I、式II化合物可作為抗腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為細胞增殖抑制的低分子生物探針用于探索生命現象本質的生命科學實驗研究中。
權利要求
1.式I或式II化合物，其中R1為氫、烴基、羥基或酰基，R2、R3為氫、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。 式I 式II
2.權利要求1所述的式I化合物，其中化合物1的R1、R2均為氫，R3為羥基，化合物2的R1，R2均為氫，R3為甲氧基。
3.權利要求1所述的式II化合物，其中化合物3的R1，R2均為氫。
4.權利要求2或3所述式I或II化合物的制備方法，其特征是發酵培養黃灰青霉真菌SP-19(Penicillium auratiogriseum SP-19)，獲取含有上述式I、II化合物的發酵物，然后從發酵物中分離純化出式I化合物1和化合物2、式II化合物3。
5.權利要求4所述的制備方法，其中將所述發酵物經硅膠柱層析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，氯仿-甲醇95∶5的洗脫物，再經Sephadex LH-20柱層析，氯仿-甲醇1∶1洗脫產物再經制備HPLC分離純化，以甲醇-水70∶30洗脫分別得到化合物1、化合物2和化合物3。
6.權利要求5所述式I、II化合物的制備方法，其中所述喹唑啉生物堿類化合物的生產菌是黃灰青霉真菌SP-19(Penicillium auratiogriseum SP-19)CCTCC M205048。
7.權利要求1所述的式I、II化合物在制備細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑中的用途。
8.權利要求1所述的式I、II化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
9.黃灰青霉真菌SP-19(Penicillium auratiogriseum SP-19)，其保藏號為CCTCCM205048。
10.權利要求9所述的菌株用于生產權利要求1所述的式I、II化合物的用途。
全文摘要
本發明涉及喹唑啉生物堿類化合物及其制備方法和用途。本發明用從海洋樣品中分離得到的黃灰青霉真菌SP－19(Penicillium auratiogriseum SP－19)生產出結構新穎的上述類型的化合物。經實驗證實，該類化合物可作為細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號C12N1/14GK1830979SQ20051007988
公開日2006年9月13日 申請日期2005年7月1日 優先權日2005年7月1日
發明者顧謙群, 辛志宏, 朱偉明, 方玉春, 朱天驕, 劉紅兵, 段琳 申請人:中國海洋大學