專利名稱：高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，特別是指一種高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法。
背景技術：
抗人神經巢蛋白單克隆抗體簡稱Nestin，該產品一直被作為神經干細胞特異性的標志，它是一個中等纖維骨架蛋白，屬于第VI類中間絲蛋白，因其在中樞神經系統發育過程中的瞬時性表達而被克隆，而抗人Nestin單克隆抗體是對人神經干細胞進行鑒定最特異的方法，完全符合分子免疫學原理。隨著分子生物學和基因治療技術的飛快發展，采用神經干細胞移植治療脊髓損傷(SCI)已被公認為最新、最有前途的治療方法之一。由于國內外科研機構將主要精力放在神經干細胞的體外培養、擴增、移植方面，因此，神經干細胞檢測體系的建立尤為重要。單克隆抗體技術目前已被國家級重點實驗室所掌握，但要想獲得高效價、高特異性的單克隆抗體在現有技術中尚未見到報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法。
本發明的整體技術構思是利用細胞融合、亞克隆及多例多種組織和細胞的特異性篩選技術，獲得高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體，由于此單抗效價高、特異性好，可直接應用于基礎醫學研究，或制成多種體外診斷試劑盒進行神經干細胞的鑒定和神經干細胞移植后的療效評價。
高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，它包括如下工藝步驟(1)動物免疫將高純度的人神經巢蛋白1-10ml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度人神經巢蛋白，用酶聯免疫吸附實驗方法測定其抗血清；(2)分離脾細胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后的Sp2/0細胞調整為細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞并制成細胞懸液；(3)細胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞懸液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美國Sigma公司出品)使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中滴加培養液，以HAT選擇性培養基(美國海克隆公司出品)進行細胞培養；(4)篩選雜交瘤細胞待融合的細胞培養至第5-10天時，吸取96孔培養板的孔中出現克隆細胞簇的培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經有限稀釋進行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞擴大培養，然后進行抗原特異性免疫組織化學原位測定，選高效價，高特異性的細胞株再擴大培養并凍存；(5)單克隆抗體特異性篩選選經酶聯免疫吸附實驗檢測抗體效價大于1∶10000的陽性孔的上清，與多種成人正常組織、腫瘤組織、人胚胎組織及人體外培養細胞株進行免疫組化特異性篩選；(6)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀(美國通用公司制造)將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，1.44(吸光單位)濃度為1-10mg/ml。
本發明的具體工藝步驟和各步驟中的工藝參數是步驟(1)將將高純度的人神經巢蛋白1-10ml加等量的完全福氏佐劑并經充分乳化，與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～22周，每只腹腔注射0.2-0.5ml，隔周免疫一次，第三次免疫后第三天抽取外周血；測定抗血清。
步驟(1)進行完畢后采用酶聯免疫吸附實驗方法測定抗血清，該方法由如下操作步驟組成a、包被以50mmol/L、pH＝9的碳酸鹽緩沖液將步驟(1)中的高純度人神經巢蛋白1∶500稀釋，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4℃保存備用；b、封閉每孔加入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液200μl洗滌、內含1％山羊血清；
c、加樣每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl(1∶5000-10000稀釋)，每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩沖液)，洗滌；d、加入酶標二抗每孔100-200μl，洗滌；e、顯色每孔加入底物50-100μl；f、比色以空白調零，405nm波長測定光密度(O.D)；g、結果判斷P/N＝測定標本O.D均值/陰性血清O.D均值，P/N≥2.1為陽性。
步驟c中的工藝條件為每孔加入1∶5000-10000稀釋后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl，每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩沖液)，溫度為37℃、時間為1小時，洗滌3次。
步驟e中的工藝條件為室溫、時間為10分鐘，然后使用終止液終止反應，經酶標儀在波長450nm處讀取光密度值。
步驟(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后15小時的Sp2/0細胞調整為1-9×105/ml細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞1-9×106/ml。
步驟(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的比值按1∶10-100的比例混合，30-60秒內逐漸加入濃度為45％的聚乙二醇溶液(分子量＝4000)，靜止90-120秒，使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1分鐘滴加4.5ml 1640培養液；間隔2分鐘滴加5ml 1640培養液(美國海克隆公司出品)，然后加1640培養液至50ml，1500rpm/分鐘離心10分鐘，以HAT選擇性培養基(美國海克隆公司出品)按20-50％的孔為1個細胞/孔進行細胞培養。
步驟(4)中是將細胞培養至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，然后進行抗原特異的免疫組織化學測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。
步驟(5)中選用的成人正常組織和人胚胎組織包括主要臟器和神經組織，腫瘤組織包括常見和多發腫瘤組織，與以上各種組織和細胞的陽性表達低于5％，與98％以上的從胚胎中分離的神經干細胞呈陽性表達。
步驟(6)中選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將5×105雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周后有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集10-15ml的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，吸光單位＝1.44時濃度為1-10mg/ml。
本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于所獲得的抗人神經巢單克隆抗體效價高、特異性非常好。可直接標記多種示蹤物，借助目前先進的檢測儀器如流式細胞儀、化學發光檢測儀、磁性分選儀等進行神經干細胞的陽選。
本發明所公開的方法是將高純度人神經巢蛋白經免疫動物、細胞融合、克隆化培養、以及大量的組織細胞原位特異性篩選從而獲得高效價、高特異性的抗人Nesting單克隆抗體，此抗體可直接應用于臨床檢測和基礎研究。單克隆抗體在生物學和醫學研究領域中具有極大的應用價值，是親和層析中重要的配體，是免疫組化中主要的抗體，是免疫檢驗中的新型試劑，是生物治療的導向武器。作為神經干細胞的檢測試劑，抗人神經巢蛋白單克隆抗體可以充分發揮其優勢。單克隆抗體的特異性強，可將抗原抗體反應的特異性大大提高，減少了可能的交叉反應，使試驗結果可信度更大。單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應結果便于質量控制，利于標準化和規范化。
其各項指標如下1、免疫BLAB/C鼠的抗血清酶聯免疫吸附實驗效價大于1∶50002、陽性克隆孔酶聯免疫吸附實驗效價大于1∶100003、陽性克隆孔腹水酶聯免疫吸附實驗效價大于1∶500004、陽性克隆孔特異性表達與人神經干細胞呈陽性表達，與其它組織細胞呈陰性表達如下人體外原代培養細胞
人體外培養細胞系
注陰性(-)陽性(+)成人正常組織
人胚胎組織
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明做進一步描述高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，它包括如下工藝步驟(1)動物免疫將高純度的人神經巢蛋白1ml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度人神經巢蛋白，用酶聯免疫吸附實驗方法測定其抗血清；(2)分離脾細胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后的Sp2/0細胞調整為細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞并制成細胞懸液；(3)細胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞懸液按1∶10比例混合，加入聚乙二醇(美國Sigma公司出品)使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中滴加培養液，以HAT選擇性培養基(美國海克隆公司出品)進行細胞培養；(4)篩選雜交瘤細胞待融合的細胞培養至第5-10天時，吸取96孔培養板的孔中出現克隆細胞簇的培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經有限稀釋進行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞擴大培養，然后進行抗原特異性免疫組織化學原位測定，選高效價，高特異性的細胞株再擴大培養并凍存；(5)單克隆抗體特異性篩選選經酶聯免疫吸附實驗檢測抗體效價大于1∶10000的陽性孔的上清，與多種成人正常組織、腫瘤組織、人胚胎組織及人體外培養細胞株進行免疫組化特異性篩選；(6)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀(美國通用公司制造)將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，1.44(吸光單位)濃度為1-10mg/ml。
步驟(1)將高純度的人神經巢蛋白1ml加等量的完全福氏佐劑并經充分乳化，與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～22周，每只腹腔注射0.2-0.5ml，隔周免疫一次，第三次免疫后第三天抽取外周血；測定抗血清。
步驟(1)進行完畢后采用酶聯免疫吸附實驗方法測定抗血清，該方法由如下操作步驟組成a、包被以50mmol/L、pH＝9的碳酸鹽緩沖液將步驟(1)中的高純度人神經巢蛋白1∶500稀釋，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4℃保存備用；b、封閉每孔加入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液200μl洗滌、內含1％山羊血清；c、加樣每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl(1∶5000稀釋)，每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩沖液)，洗滌；d、加入酶標二抗每孔100μl，洗滌；e、顯色每孔加入底物100μl；f、比色以空白調零，405nm波長測定光密度(O.D)；g、結果判斷P/N＝測定標本O.D均值/陰性血清O.D均值，P/N≥2.1為陽性。
步驟c中的工藝條件為每孔加入1∶5000稀釋后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50μl，每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩沖液)，溫度為37℃、時間為1小時，洗滌3次。
步驟e中的工藝條件為室溫、時間為10分鐘，然后使用終止液終止反應，經酶標儀在波長450nm處讀取光密度值。
步驟(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后15小時的Sp2/0細胞調整為9×105/ml細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞9×105/ml。
步驟(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的比值按1∶10的比例混合，30秒內逐漸加入濃度為45％的聚乙二醇溶液(分子量＝4000)，靜止90秒，使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1分鐘滴加4.5ml 1640培養液；間隔2分鐘滴加5ml 1640培養液(美國海克隆公司出品)，然后加1640培養液至50ml，1500rpm/分鐘離心10分鐘，以HAT選擇性培養基(美國海克隆公司出品)按36％的孔為1個細胞/孔進行細胞培養。
步驟(4)中是將細胞培養至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，然后進行抗原特異的免疫組織化學測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。
步驟(5)中選用的成人正常組織和人胚胎組織包括主要臟器和神經組織，腫瘤組織包括常見和多發腫瘤組織，與以上各種組織和細胞的陽性表達低于5％，與98％以上的從胚胎中分離的神經干細胞呈陽性表達。
步驟(6)中選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將5×105雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周后有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，吸光單位＝1.44時濃度為1mg/ml。
此抗人神經巢單克隆抗體經56例體外培養的神經干細胞進行免疫組化原位表達均為陽性，與多種多例數的組織和細胞進行免疫組化原位表達陽性率低于5％。表明此單抗特異性很高，適合提供給臨床進行神經干細胞移植的鑒定和療效評價，也可制成免疫組化或酶聯免疫吸附實驗試劑盒開展醫學基礎研究。
權利要求
1.高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于它包括如下工藝步驟(1)動物免疫將高純度的人神經巢蛋白1-10ml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度人神經巢蛋白，用酶聯免疫吸附實驗方法測定其抗血清；(2)分離脾細胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后的Sp2/0細胞調整為細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞并制成細胞懸液；(3)細胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞懸液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中滴加培養液，以HAT選擇性培養基進行細胞培養；(4)篩選雜交瘤細胞待融合的細胞培養至第5-10天時，吸取96孔培養板的孔中出現克隆細胞簇的培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經有限稀釋進行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞擴大培養，然后進行抗原特異性免疫組織化學原位測定，選高效價，高特異性的細胞株再擴大培養并凍存；(5)單克隆抗體特異性篩選選經酶聯免疫吸附實驗檢測抗體效價大于1∶10000的陽性孔的上清，與多種成人正常組織、腫瘤組織、人胚胎組織及人體外培養細胞株進行免疫組化特異性篩選；(6)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，吸光單位為1.44時濃度為1-10mg/ml。
2.根據權利要求1所述的高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)將將高純度的人神經巢蛋白1-10ml加等量的完全福氏佐劑并經充分乳化，與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～22周，每只腹腔注射0.2-0.5ml，隔周免疫一次，第三次免疫后第三天抽取外周血；測定抗血清。
3.根據權利要求1或2所述的高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)進行完畢后采用酶聯免疫吸附實驗方法測定抗血清，該方法由如下操作步驟組成a、包被以50mmol/L、pH＝9的碳酸鹽緩沖液將步驟(1)中的高純度人神經巢蛋白1∶500稀釋，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4℃保存備用；b、封閉每孔加入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液200μl洗滌、內含1％山羊血清；c、加樣每孔加入稀釋5000-10000倍的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl，每板設一正常對照、陽性對照及磷酸鹽緩沖液空白，洗滌；d、加入酶標二抗每孔100-200μl，洗滌；e、顯色每孔加入底物50-100μl；f、比色以空白調零，405nm波長測定光密度O.D；g、結果判斷P/N＝測定標本O.D均值/陰性血清O.D均值，P/N≥2.1為陽性。
4.根據權利要求3所述的高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟c中的工藝條件為每孔加入1∶5000-10000稀釋后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl，每板設一正常對照、陽性對照及磷酸鹽緩沖液空白，溫度為37℃、時間為1小時，洗滌3次。
5.根據權利要求3所述的高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟e中的工藝條件為室溫、時間為10分鐘，然后使用終止液終止反應，經酶標儀在波長450nm處讀取光密度值。
6.根據權利要求1所述的高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后15小時的Sp2/0細胞調整為1-9×105/ml細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞1-9×106/ml。
7.根據權利要求1所述的高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的比值按1∶10-100的比例混合，30-60秒內逐漸加入分子量＝4000、濃度為45％的聚乙二醇，靜止90-120秒，使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1分鐘滴加4.5ml1640培養液；間隔2分鐘滴加5ml1640培養液，然后加1640培養液至50ml，1500rpm/分鐘離心10分鐘，以HAT選擇性培養基按20-50％的孔為1個細胞/孔進行細胞培養。
8.根據權利要求1所述的高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)中是將細胞培養至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，然后進行抗原特異的免疫組織化學測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。
9.根據權利要求1所述的高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)中選用的成人正常組織和人胚胎組織包括主要臟器和神經組織，腫瘤組織包括常見和多發腫瘤組織，與以上各種組織和細胞的陽性表達低于5％，與98％以上的從胚胎中分離的神經干細胞呈陽性表達。
10.根據權利要求1所述的高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟(6)中選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將5×105雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周后有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集10-15ml的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，吸光單位＝1.44時濃度為1-10mg/ml。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域，特別是指一種高效價、高特異性抗人神經巢蛋白單克隆抗體的制備方法。動物免疫、分離脾細胞、細胞融合、篩選雜交腫瘤細胞、單克隆抗體特異性篩選、單克隆抗體純化保存等工藝步驟，本發明解決了現有技術存在的高效價、高特異性的單克隆抗體在現有技術中尚屬空白的問題。可直接應用于臨床檢測和基礎研究，在生物學和醫學研究領域中具有極高的應用價值，單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應結果便于質量控制，利于標準化和規范化。
文檔編號C12N5/18GK1903879SQ200610012998
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月1日 優先權日2006年8月1日
發明者李彬 申請人:李彬