帶有DARPin的雙特異性嵌合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明涉及雙特異性嵌合蛋白，其包括經設計的錨蛋白重復蛋白(DARPin)，以及與所述DARPin相連的IgG抗體，scFv-Fc抗體片段，或其組合；用其治療或預防癌癥的方法，以及相關的方法和組合物。KCLRF-BP-002202009.10.06
【專利說明】帶有DARPin的雙特異性嵌合蛋白
[0001] 發明背景
[0002] 1.發明領域
[0003] 本文涉及含有經設計的錨蛋白重復蛋白（DARPin)的雙特異性嵌合蛋白，以及相 關的方法和組合物。
[0004] 2.相關技術的描述
[0005] 在活細胞中，各種蛋白彼此相互作用，參與各種致病機制。如果有至少兩種這樣的 致病蛋白被同時抑制，相比于僅有單一蛋白被抑制的情況而言，就有更大的可能性來治療 和預防疾病。為此，研發了多種能抑制至少兩種蛋白的抗體。
[0006] 盡管研發出數種雙特異性抗體，其中大多數不能在商業上用作抗體藥物，因為它 們的療效未經臨床驗證或者觀察到了多種副作用。此外，所研發的雙特異性抗體在穩定性 和產量方面有不足，這對于商業應用而言也是障礙。早期研發的具有IgG形式的雙特異性 抗體難以分離和純化，因為在生產過程中輕鏈和重鏈隨機組合，導致大規模生產中的諸多 問題。而且，在非IgG的雙特異性抗體的情形中，與蛋白折疊、藥效學等無關的作為藥物的 穩定性也沒有得到驗證。
[0007] 因此，需要研發在活體內穩定性增強、且作為藥物有改進特性的雙特異性抗體。


【發明內容】

[0008] 本申請提供了雙特異性嵌合蛋白（雙特異性抗體偶聯物），其包括抗體（例如IgG 抗體）和/或抗體片段（例如ScFv-Fc抗體片段）、以及與其相連的經設計的錨蛋白重復蛋 白（DARPin)，本發明還提供了包含所述抗體和可藥用載體的藥物組合物。所述的雙特異性 嵌合蛋白或雙特異性抗體偶聯物可以用作雙特異性抗體。
[0009] 本申請還提供了制備所述雙特異性嵌合蛋白的方法，其通過將DARPin與抗體（例 如IgG抗體）和/或抗體片段（例如ScFv-Fc抗體片段）相連來實現，或通過在細胞中表 達編碼所述雙特異性嵌合蛋白的核酸來實現。
[0010] 本申請還提供了用于治療或預防癌癥的所述雙特異性嵌合蛋白，或者所述雙特異 性嵌合蛋白在治療或預防癌癥方面的用途。
[0011] 此外，本申請還提供了用于增強雙特異性嵌合蛋白的抗癌效力的DARPin，或者 DARPin用于增強雙特異性嵌合蛋白的抗癌效力的用途，是與未連接DARPin的抗體或抗體 片段相比。
[0012] 本申請還提供了相關的組合物和方法，可以從下文的詳述中更清楚地了解。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1圖示了根據一個實施方案用抗EGFRDARPin制備多種雙特異性抗體偶聯物的 過程。
[0014] 圖2圖示了根據一個實施方案用抗EGFRDARPin制備多種雙特異性抗體偶聯物的 過程。
[0015] 圖3圖示了根據一個實施方案制備抗c-Met/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白的過程。
[0016] 圖4圖示了根據一個實施方案的抗C-Met/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白在溶液中展 示的穩定性特性。
[0017] 圖5圖示了根據一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白與EGF在 競爭性ELISA試驗中的競爭。
[0018] 圖6圖示了根據一個實施方案的抗-C-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白在A431 細胞中抑制EGFR磷酸化的程度。
[0019] 圖7圖示了根據一個實施方案的抗-C-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對SNU5 細胞增殖的抑制程度。
[0020] 圖8圖示了根據一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對MKN45 細胞增殖的抑制程度。
[0021] 圖9圖示了根據一個實施方案的抗-C-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對H1993 細胞增殖的抑制程度。
[0022] 圖10圖示了根據一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對A431 細胞增殖的抑制程度。
[0023] 圖11的熒光圖像顯示了根據一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合 蛋白對c-Met和EGFR的內在化。
[0024] 圖12圖示了根據一個實施方案的抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白的 c-Met(上圖）和EGFR(下圖）表達量。
[0025] 圖13圖示了根據一個實施方案制備抗HER2/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白的過程。
[0026] 圖14圖示了根據一個實施方案的抗HER2/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白展示的穩定 性特性。
[0027] 圖15圖示了根據一個實施方案的抗HER2/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白對MKN45 細胞增殖的抑制程度。
[0028] 圖16的熒光圖像顯示了根據一個實施方案的抗HER2/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋 白對HER2和EGFR的內在化。
[0029] 圖17圖示了根據一個實施方案制備抗HER3/抗-EGFR雙特異性嵌合蛋白的過程。
[0030] 圖18圖示了根據一個實施方案的抗HER3/抗EGFR雙特異性嵌合蛋白展示的穩定 性特性
[0031] 圖19圖示了根據一個實施方案制備抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin雙特異 性嵌合蛋白的過程。
[0032] 圖20圖示了根據一個實施方案的抗c-Met/抗-EGFR(E01+E69)DARPin雙特異性 嵌合蛋白展示的穩定性特性。
[0033] 圖2IA至2IG展示了各種DARPin的核苷酸序列。

【具體實施方式】
[0034] 已研發出多種類型和形式的雙特異性抗體，且由于這些抗體結合至少兩種抗原的 能力，可預期其與早已存在的單克隆抗體相比具有出色的治療效果。本文通過將DARPin與 IgG抗體或其片段結合提供了雙特異性嵌合蛋白。
[0035] DARPin(經設計的錨蛋白重復蛋白；見第5章"DesignedAnkyrinRepeat Proteins(DARPins):FromResearchtoTherapy",MethodsinEnzymology,vol503:101~ 134(2012)^"EfficientSelectionofDARPinswithSub-nanomolarAffinitiesusing SRPPhageDisplay"，J.Mol.Biol. (2008) 382, 1211-1227,其全部公開內容引入本文作為 參考）是指具有對靶蛋白的高特異性和高結合親和力的抗體模擬蛋白，其通過基因工程制 備。DARPin起源于天然的錨蛋白，且具有包含至少2個錨蛋白重復基元（例如，包含至少 3、4或5個錨蛋白重復基元）的結構。根據重復基元的數量，DARPin可具有任何適宜的分 子量。例如，包含3、4、或5個錨蛋白重復基元的DARPin可分別具有約10kDa、約14kDa、或 約18kDa的分子量。
[0036] DARPin包括提供結構的核心部分和位于該核心外且結合靶標的靶結合部分。該結 構性核心包括保守的氨基酸序列而該靶結合部分包括根據靶標而相區別的氨基酸序列。
[0037] 下表中總結了DARPin的實例且圖21A-21G圖釋了其核苷酸序列：
[0038]

【權利要求】
1. 一種雙特異性嵌合蛋白，包含： 設計的錨蛋白重復蛋白（DARPin)，和 與DARPin連接的IgG抗體、scFv-Fc抗體片段、或其組合。
2. 依照權利要求1的雙特異性嵌合蛋白，其中所述DARPin是抗EGFR DARPin。
3. 依照權利要求1的雙特異性嵌合蛋白，包含： 抗 EGFR DARPin，和 與所述DARPin連接的抗c-Met IgG抗體、抗c-Met scFv-Fc抗體片段、或其組合。
4. 依照權利要求2或3的雙特異性嵌合蛋白，其中所述抗EGFR DARPin包含SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、或 SEQ ID NO: 112 的一種或多種，任選地，其中任 一種重復2至10次。
5. 依照權利要求3或4的特異性嵌合蛋白，其中所述抗c-Met抗體或抗體片段包含： 選自下組的至少一種重鏈互補決定區（⑶R):(a)⑶R-H1，其包含SEQ ID N0:4的氨基 酸序列；(b)CDR_H2,其包含，SEQ ID NO:5的氨基酸序列，SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或具 有SEQ ID N0:2的8-19個連續氨基酸且包含SEQ ID N0:2第3位到第10位氨基酸殘基的 氨基酸序列；和（c)CDR_H3,其包含，SEQ ID N0:6的氨基酸序列，SEQ ID N0:85的氨基酸序 列，或具有SEQ ID NO: 85的6-13個連續氨基酸且包含SEQ ID NO: 85第1位到第6位氨基 酸殘基的氨基酸序列； 選自下組的至少一種輕鏈互補決定區：（a)⑶R-L1，包含SEQ ID N0:7的氨基酸序列， 〇3)0?-12，包含5￡〇10勵:8的氨基酸序列，和（(3)0)1?-13，其包含，5￡〇10勵:9的氨基酸 序列，SEQ ID NO: 86的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO: 89的9-17個連續氨基酸且包含SEQ ID N0:89第1位到第9位氨基酸殘基的氨基酸序列；或者所述至少一種重鏈互補決定區和 所述至少一種輕鏈互補決定區的組合。
6. 依照權利要求5的雙特異性嵌合蛋白，其中 所述〇?-111包含5￡0 10勵：1、5￡0 10勵：22、5￡0 10勵：23、或5￡0 10勵：24的氨 基酸序列， 所述〇?-112包含5￡0 10勵:2、5￡0 10勵:25、或5￡0 10勵:26的氨基酸序列， 所述〇?-113包含5￡0 10勵：3、5￡0 10勵：27、5￡0 10勵：28、或5￡0 10勵:85的氨 基酸序列；和 所述 CDR-L1 包含 SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、或 SEQ ID NO:106 的氨基酸序列， 所述〇?-12包含5￡0 10勵：11、5￡0 10勵：34、5￡0 10勵：35、或5￡0 10勵：36的氨 基酸序列，和 所述 CDR-L3 包含 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO:86、或 SEQ ID NO:89 的氨基酸序列。
7. 依照權利要求5的雙特異性嵌合蛋白，其中所述抗c-Met抗體或抗體片段包含： 重鏈，包含以下：SEQ ID N0:62的氨基酸序列，從SEQ ID N0:62的第18位至第462位 的氨基酸序列，SEQ ID N0:64的氨基酸序列，從SEQ ID N0:64的第18位至第461位的氨 基酸序列，SEQ ID N0:66的氨基酸序列，或從SEQ ID N0:66的第18位至第460位的氨基 酸序列；和 輕鏈，包含以下：SEQ ID N0:68的氨基酸序列，從SEQ ID N0:68的第21位至第240位 的氨基酸序列，SEQ ID NO:70的氨基酸序列，從SEQ ID NO:70的第21位至第240位的氨 基酸序列，或SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。
8. -種用于預防或治療癌癥的藥物組合物，其包含權利要求2至7中任一項的雙特異 性嵌合蛋白。
9. 一種制備雙特異性嵌合蛋白的方法，包括： 將i)DARPin和ii) IgG抗體、scFv-Fc抗體片段或其組合連接；或 在細胞中表達編碼所述雙特異性嵌合蛋白的核酸。 10?權利要求 9 的方法，其中所述 DARPin 包含 SEQ ID N0:109、SEQ ID N0:110、SEQ ID NO: 111、或SEQ ID NO: 112的一種或多種，任選地，其中任一種重復2至10次。
11. 權利要求9或10的方法，其中所述抗體或抗體片段是抗c-Met抗體或其抗體片段。
12. 權利要求11的方法，其中所述抗c-Met抗體或抗體片段包含： 選自下組的至少一種重鏈互補決定區（⑶R):(a)⑶R-H1，包含SEQ ID N0:4的氨基酸 序列；(b)CDR-H2,其包含，SEQ ID N0:5的氨基酸序列，SEQ ID N0:2的氨基酸序列，或具有 SEQ ID NO: 2的8-19個連續氨基酸且包含SEQ ID NO: 2第3位到第10位氨基酸殘基的氨 基酸序列；和（c)⑶R-H3,其包含，SEQ ID NO:6的氨基酸序列，SEQ ID NO:85的氨基酸序 列，或具有SEQ ID NO: 85的6-13個連續氨基酸且包含SEQ ID NO: 85第1位到第6位氨基 酸殘基的氨基酸序列； 選自下組的至少一種輕鏈互補決定區：(a)⑶R-L1，包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列， 〇3)0?-12，包含5￡〇10勵:8的氨基酸序列，和（(3)0)1?-13，其包含，5￡〇10勵:9的氨基酸 序列，SEQ ID NO: 86的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO: 89的9-17個連續氨基酸且包含SEQ ID NO:89第1位到第9位氨基酸殘基的氨基酸序列；或 所述至少一種重鏈互補決定區和所述至少一種輕鏈互補決定區的組合。
13. 權利要求11或12的方法，其中所述雙特異性嵌合蛋白的抗癌功效相比于沒有所述 DARPin與其連接的所述抗c-Met抗體或抗體片段增強。
14. 編碼權利要求1至7中任一項的雙特異性嵌合蛋白的核酸，任選地在載體中。
15. 包含權利要求14的核酸的細胞。
【文檔編號】C07K19/00GK104341529SQ201410363385
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2013年7月26日
【發明者】鄭光鎬, 李承炫, 高榮晙, 金罠京, 黃載雄, 趙美英, 李政昱, 林柏瑋 申請人:三星電子株式會社